黃粉蟲酶解物體內(nèi)外抗氧化及免疫活性研究

劉竹青 李 巖 崔旋旋 樸美子*

（1青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 山東青島 266109 2青島海潤農(nóng)大有限檢測公司 山東青島 266109）

黃粉蟲（Tenebrio molitor）又叫面包蟲，是一種富含蛋白質(zhì)的昆蟲，干燥的黃粉蟲幼蟲含蛋白質(zhì)高達40%，有“蛋白質(zhì)飼料寶庫”的稱號。研究發(fā)現(xiàn)，黃粉蟲能很好地提高人體免疫力，降低人體血脂，延緩器官衰老。李奕冉等[1]研究了黃粉蟲蛋白對小鼠免疫功能的影響，結(jié)果表明黃粉蟲蛋白可以明顯增加小鼠免疫器官質(zhì)量，增強小鼠細(xì)胞免疫力。

蛋白質(zhì)經(jīng)過酶解后得到分子質(zhì)量小，具有生物活性的多肽類物質(zhì)。多肽類物質(zhì)的活性主要表現(xiàn)在降血壓、降膽固醇、抗肥胖、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)等[2-3]。張莉莎等[4]利用陽陰離子交換柱層析以及Sephadex G-25凝膠柱層析對酶解得到的多肽進行分離純化，發(fā)現(xiàn)純化后的多肽表現(xiàn)出很強的抗氧化性。Jolles等[5]利用胰蛋白酶酶解人乳蛋白，分離出一種具有免疫活性的肽，可以刺激巨噬細(xì)胞吞噬綿羊紅細(xì)胞。徐鑫等[6]采用胰蛋白酶酶解酪蛋白酸鈉的方法制備免疫活性肽，獲得的多肽刺激脾細(xì)胞增殖能力最強，能提高機體免疫力的活性。目前對抗氧化活性肽的研究較多集中在大豆肽和玉米肽上，對黃粉蟲的利用還局限在黃粉蟲蛋白質(zhì)的提取上[7]，而對黃粉蟲酶解物（Tenebrio Molitor Hydrolysate，以下簡稱TMH）的抗氧化活性及免疫活性的研究還很少。本文對TMH體外抗氧化活性進行研究，并通過小鼠試驗研究了TMH的體內(nèi)抗氧化活性和免疫活性，為黃粉蟲功能性食品的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃粉蟲酶解物（TMH），自制；雄性昆明種8周齡SPF級實驗小鼠〔合格證號SCXKL（魯）20140007〕，青島大任富城畜牧有限公司；基礎(chǔ)飼料，青島大任富城畜牧有限公司；D-半乳糖，國藥集團；MDA、T-SOD、GSH-Px、CAT、·OH 試劑盒、考馬斯亮藍(lán)蛋白質(zhì)測定試劑盒，免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白 M（IgM）、白細(xì)胞介素 4（IL-4）、γ-干擾素（IFN-γ）小鼠 ELISA 測定試劑盒，南京建成生物工程公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2000型紫外分光光度計，尤尼克（上海）儀器有限公司；AR1140型電子分析天平，奧豪斯集團；臺式酸度測定儀，北京哈納科儀科技有限公司；ELx808型酶標(biāo)儀，美國BioTek公司；DSHZ-300A型旋轉(zhuǎn)式恒溫振蕩器，江蘇國華電器有限公司；電熱恒溫水浴鍋，龍口市先科儀器有限公司；RE-6000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；FD-1D-80冷凍干燥機，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；TGL-16M高速臺式冷凍離心機，湖南湘儀儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 TMH的制備 將黃粉蟲幼蟲干燥后粉碎，過100目篩子，脫脂。利用Arazyme酶酶解，加酶量為517.8 U/g原料，料水比為1∶26.05，酶解時間5.0 h。滅酶15 min后，過濾、離心，取上層離心液即TMH，冷凍干燥后備用。

1.3.2 TMH體外抗氧化活性

1）DPPH自由基清除能力測定 參考文獻[8]。

2）超氧陰離子清除能力測定 采用鄰苯三酚自氧化法測定[9]。

3）總還原能力測定 采用鐵氰化鉀法測定[10]。

1.3.3 TMH體內(nèi)抗氧化活性研究

1.3.3.1 小鼠的分組與飼喂 選取60只初始體重為18～22 g的8周齡雄性昆明種SPF級小鼠，隨機分為6組，每組10只，分別為空白組、D-半乳糖致衰老模型組（簡稱為模型組）、VC陽性對照組以及TMH低劑量組、中劑量組、高劑量組。其中，空白組皮下注射 0.1 mL/（10g·d）生理鹽水，其余各組皮下注射 200 mg/（kg bw·d） D-半乳糖[11]（D-半乳糖以無菌生理鹽水配成20 mg/mL的溶液，使用前用0.22 μm濾膜過濾除菌）。空白組和模型組每日灌胃等體積的生理鹽水，VC陽性組小鼠灌胃 VC〔10 mg/（kg bw·d）〕溶液，TMH 的低、中、高劑量組每日按多肽含量100，300，500 mg/（kg bw·d）灌胃小鼠。每日定時灌胃，注射 1次，連續(xù)6周。期間觀察小鼠體征，每周記錄1次小鼠體重。

1.3.3.2 小鼠的處死及血漿準(zhǔn)備 對試驗小鼠末次注射后，禁食12 h，眼球取血并處死，血液中加入抗凝劑，靜置3 h，3 000 r/min離心15 min，小心吸取上層血漿，分裝后液氮冷凍備用。

1.3.3.3 肝臟組織勻漿的制備 取解剖后小鼠肝臟，用生理鹽水沖洗干凈，瀝干水分，稱取0.2 g放入組織研磨器中，加入9倍生理鹽水進行研磨，制成10%肝臟組織勻漿。

1.3.3.4 小鼠肝臟組織蛋白質(zhì)含量測定 采用蛋白質(zhì)定量試劑盒（考馬斯亮藍(lán)法）測定小鼠肝臟組織的蛋白質(zhì)含量。

1.3.3.5 小鼠血漿和肝臟組織抗氧化指標(biāo)的測定按照試劑盒提供的方法，分別測定小鼠血漿和肝臟勻漿中 MDA 含量，CAT、GSH-Px、T-SOD 活力以及抑制羥自由基能力。

1.3.4 TMH免疫活性研究

1.3.4.1 實驗動物的分組與飼喂 選取40只初始體質(zhì)量18～22 g的8周齡昆明種清潔級雄性小鼠，隨機分為4個處理組，分別為空白組，TMH的低、中、高劑量組，每組10只。低、中、高劑量組每日按 TMH 中多肽含量 100，300，500 mg/（kg bw·d）灌胃小鼠，空白組每日灌胃等體積的生理鹽水，各組小鼠自由取食和飲水，飼養(yǎng)30 d。

1.3.4.2 小鼠致敏及血清制備[12]取公雞血置于裝有玻璃珠的三角瓶中，同一方向搖動脫纖維，用生理鹽水清洗 2～3 次，離心（2 000 r/min，10 min），取上清，用生理鹽水配制體積分?jǐn)?shù)為2%的雞紅細(xì)胞懸液。每只小鼠腹腔注射雞血紅細(xì)胞0.2 mL，5 d后眼球取血，將凝固血與離心管壁剝離，使血清充分析出，以2 000 r/min離心10 min，收集血清。

1.3.4.3 肝臟組織勻漿的制備 小鼠飼養(yǎng)30 d后，稱小鼠體重，眼部取血后處死，分別摘取小鼠的胸腺與脾臟，用生理鹽水沖洗，用濾紙充分吸干內(nèi)臟表面的水分，稱取小鼠各臟器質(zhì)量并記錄數(shù)據(jù)，計算免疫器官指數(shù)（g/kg體重）。

1.3.4.4 小鼠血清中免疫功能指標(biāo)的測定 采用酶聯(lián)免疫吸附法測定小鼠血清中的免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白 M（IgM）、白細(xì)胞介素 4（IL-4）、γ-干擾素（IFN-γ），試驗遵循 ELISA 測定試劑盒操作步驟。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)采用x±s表示，采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行方差分析，統(tǒng)計組間差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 TMH體外抗氧化活性

2.1.1 TMH對DPPH自由基的清除作用由圖1可看出，在2～10 mg/mL質(zhì)量濃度范圍，隨著TMH濃度的增大，其對DPPH自由基的清除率也增大，當(dāng)TMH的質(zhì)量濃度為10 mg/mL時，其清除率達88.4%，其 IC50為 3.75 mg/mL。

圖1 不同濃度TMH對DPPH自由基的清除能力Fig.1 DPPH scavenging ability of TMH with various concentrations

2.1.2 TMH對O2-·自由基的清除作用由圖2可以看出，在25～200 mg/mL質(zhì)量濃度范圍，TMH濃度與清除O2-·自由基的能力呈線性關(guān)系。隨著TMH濃度的增大，其清除率不斷增大，當(dāng)質(zhì)量濃度為200 mg/mL時，其清除率達61.0%，IC50為138.42 mg/mL。

2.1.3 TMH的還原能力 由圖3可以看出，在0.5～6 mg/mL質(zhì)量濃度范圍，隨著黃粉蟲酶解物濃度的增大，其還原能力不斷增大。當(dāng)質(zhì)量濃度為6 mg/mL時，其還原能力達到0.653。

2.2 TMH體內(nèi)抗氧化活性

2.2.1 TMH對小鼠體重的影響 體重的改變反映衰老的程度。對實驗小鼠在正常飼喂條件下連續(xù)飼喂6周，每周記錄小鼠體重1次。數(shù)據(jù)表明，飼喂期間各組小鼠的體重都有增加，其中模型組小鼠的體重增加量顯著小于其它各劑量組。研究發(fā)現(xiàn)小鼠體重增加量與TMH劑量的增加呈正比關(guān)系，多肽高劑量組的體重增加量與正常組無顯著差異，說明TMH可減緩衰老模型小鼠的衰老癥狀，起到防衰老的效果。

圖2 不同濃度TMH對O2-·自由基清除能力Fig.2 O2-·radical scavenging ability of TMH with various concentrations

圖3 不同濃度黃粉蟲酶解物的還原能力Fig.3 Reducing capacity of TMH with various concentrations

表1 TMH對小鼠體重的影響Table1 Effect of TMH on body weight of mice

2.2.2 TMH對小鼠血漿中MDA含量、CAT、GSHPx、T-SOD活力及抑制羥自由基能力的影響 機體組織中的超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶等可以清除體內(nèi)自由基和脂質(zhì)過氧化物，并明顯抑制組織中的丙二醛，從而抑制自由基的產(chǎn)生。小鼠組織中CAT、GSH-Px、T-SOD 活力及抑制羥自由基能力以及小鼠體重和肝臟中MDA含量變化，可以反映小鼠機體抗氧化情況。由表2可看出，模型組小鼠注射D-半乳糖后，肝臟MDA含量顯著升高，同時CAT、T-SOD、GSHPx活力和抑制羥自由基能力顯著降低，D-半乳糖建立衰老模型成功。與模型組相比，高劑量組TMH可以顯著降低MDA（P<0.05）含量并抑制羥自由基能力；低劑量組TMH就可以顯著提高小鼠血漿、肝臟中CAT（P<0.05）活力；中劑量組TMH可以顯著提高GSH-Px（P<0.05）活力；當(dāng)TMH為高劑量組時，可以顯著提高小鼠血漿、肝臟中TSOD（P<0.05）活力，其中，隨著劑量的增加，各指標(biāo)與模型組的差異增大，并與空白組的指標(biāo)接近。

表2 TMH對小鼠血漿中MDA含量、CAT、GSH-Px、T-SOD活力及抑制羥自由基能力的影響Table2 Effect of TMH on MDA，CAT，GSH-Px，T-SOD and OH·in mice’s plasma

2.2.3 TMH對小鼠肝臟中MDA含量、CAT、GSHPx、T-SOD活力及抑制羥自由基能力的影響 由表3可看出，模型組小鼠注射D-半乳糖后，肝臟MDA 含量顯著升高，同時 CAT、T-SOD、GSHPx活力和抑制羥自由基能力顯著降低，說明用D-半乳糖建立衰老模型成功。與模型組相比，TMH高劑量組的小鼠肝臟中MAD含量和T-SOD活力有顯著的變化，低、中劑量組沒有顯著性改變；CAT活力在低、中、高劑量組中都有所降低，變化均不顯著；TMH中劑量組中GSH-Px活力和·OH清除能力比模型組顯著提高，與空白組無顯著性差異。

表3 TMH對小鼠肝臟中MDA含量、CAT、GSH-Px、T-SOD活力及抑制羥自由基能力的影響Table3 Effect of TMH on MDA，CAT，GSH-Px，T-SOD and OH·in mice’s liver

2.3 TMH免疫活性研究

2.3.1 TMH對小鼠免疫器官指數(shù)的影響 胸腺和脾臟分別屬于中樞和外周免疫器官，其增重往往意味著機體淋巴細(xì)胞的增殖，直接體現(xiàn)免疫應(yīng)答的強弱[13]。由表4可知，與對照組比較，隨著TMH劑量的增加，小鼠的免疫器官指數(shù)也有相應(yīng)的變化，其中胸腺指數(shù)沒有顯著變化，脾臟指數(shù)變化顯著。低、高劑量間不存在明顯的量效關(guān)系，其原因有可能是小鼠的胸腺與脾臟較小，解剖時導(dǎo)致測定結(jié)果有一定誤差。同時，劑量設(shè)計跨度大也有待改進。

表4 TMH對小鼠免疫器官指數(shù)的影響Table4 Effect of TMH on the immune organs index of mice

2.3.2 TMH 對小鼠血清中 IgG、IgM、IL-4、IFN-γ含量的影響 血清中的免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白M（IgM）的含量代表血清中免疫球蛋白的主要水平，是反映機體免疫功能狀態(tài)的指標(biāo)[14]。由表5可知，小鼠血清中的IgG含量在低、中、高劑量組間差異顯著，而小鼠血清中的IgM含量在低、中、高劑量組間沒有明顯差異。與空白組相比，小鼠血清中IgG、IgM含量均有顯著性提高。這說明TMH通過提高小鼠血清中IgG、IgM含量，提高小鼠免疫能力的效果。

細(xì)胞因子IL-4對于B細(xì)胞、T細(xì)胞、肥大細(xì)胞、巨噬細(xì)胞都有免疫調(diào)節(jié)作用，主要參與B細(xì)胞增殖以及體液免疫，抗體的產(chǎn)生。細(xì)胞因子IFN-γ主要促進T細(xì)胞增殖，介導(dǎo)細(xì)胞免疫和炎癥反應(yīng)。由表5可知，與空白組相比，低、中、高劑量組小鼠血清中的IFN-γ含量有顯著提升，而中、高劑量組組間并無差異性。與空白組相比，低劑量組小鼠血清中的IL-4含量提高顯著。隨著飼喂劑量的增加，血清中的IL-4含量也顯著提高，并呈正相關(guān)性。TMH可以顯著提高小鼠血清中IL-4的含量，從而提高IL-4參與體液免疫能力，誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生，提高小鼠免疫力。

表5 TMH對小鼠血清中IgG、IgM、IL-4、IFN-γ含量的影響Table5 Effect of TMH on the IgG，IgM，IL-4，IFN-γ concentrations in mice’s plasma tissue

3 結(jié)論

利用Arazyme酶酶解黃粉蟲，得到富含多肽的酶解液。通過體外抗氧化活性研究發(fā)現(xiàn)，黃粉蟲酶解液對DPPH自由基、O2-·自由基的清除能力分別達到 88.4%（10 mg/mL），61.0%（200 mg/L），且當(dāng)其質(zhì)量濃度為6 mg/L時，還原能力達到0.653。

動物試驗表明，TMH可以顯著提高小鼠血漿、肝臟中 CAT、GSH-Px、T-SOD（P<0.05）活力，降低MDA（P<0.05）含量并抑制羥自由基能力；顯著增加血清中 IgG、IgM、IL-4、IFN-γ（P<0.05）的含量，提高小鼠脾臟和肝臟指數(shù)，表現(xiàn)出較強的抗氧化能力以及改善機體免疫的功能。