亞慢性暴露3-氯-1，2-丙二醇對(duì)雄性大鼠生殖系統(tǒng)的影響

邢寒竹 方 冰 常巧英 龐國(guó)芳

（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心 北京 100083）

氯丙醇類是公認(rèn)的食品污染物，主要在食用油精煉過(guò)程中產(chǎn)生，而3-氯-1，2-丙二醇 （3-MCPD）是該類物質(zhì)的典型代表，幾乎存在于全部精煉植物油中[1]。含油脂食品和釀造醬油也存在3-MCPD暴露問(wèn)題[2-3]，3-MCPD脂肪酸酯在油脂中的含量更高[4-5]，且其大部分（86%）在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為3-MCPD發(fā)揮毒性[6]。

對(duì)于3-MCPD的毒性研究已有幾十年歷史，研究認(rèn)為3-MCPD暴露可能對(duì)人體產(chǎn)生肝腎毒性、免疫毒性、遺傳毒性、致癌性以及生殖毒性[7-8]，其主要靶器官是腎臟和生殖系統(tǒng)，長(zhǎng)期攝入可引起腎功能衰退和雄性不育[7]。尤其是近年來(lái)世界范圍內(nèi)精液質(zhì)量下降[9]，使3-MCPD在食品中的暴露問(wèn)題成為關(guān)注熱點(diǎn)。

研究表明，較高的3-MCPD暴露劑量，可導(dǎo)致蝙蝠精子數(shù)量急劇降低 （70 mg·kg-1急性暴露4 d），睪丸曲細(xì)精管結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞[10]；在 25～36 mg·kg-1劑量范圍，3-MCPD可導(dǎo)致曲細(xì)精管生精上皮損傷[11]，生精細(xì)胞變性剝落[12]及一定程度的睪丸萎縮[13]。

目前，F(xiàn)AO/WHO認(rèn)定的3-MCPD的最低可見(jiàn)有害作用水平為 1.1 mg·kg-1體重/d[14]，然而，在該劑量下對(duì)3-MCPD生殖毒性的研究欠缺，且存在爭(zhēng)議。Cho 等[11]發(fā)現(xiàn) 0.94 mg·kg-1和 4.59 mg·kg-13-MCPD經(jīng)口暴露13周，對(duì)大鼠精子活力沒(méi)有明顯影響；而 Kwack 等[15]灌胃 0.25～5 mg·kg-13-MCPD 28 d后，發(fā)現(xiàn)大鼠精子數(shù)量和精子活力都顯著降低。本文研究了較低劑量（1.0 mg·kg-1和5.0 mg·kg-1）下3-MCPD慢性暴露對(duì)雄性大鼠生長(zhǎng)以及精子數(shù)量和質(zhì)量的影響；睪丸組織病理和性激素水平的改變，并探究了3-MCPD染毒大鼠睪丸細(xì)胞凋亡情況，為3-MCPD的生殖毒性評(píng)價(jià)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

3-MCPD，純度＞99%，美國(guó) Sigma Aldrich有限公司；M199培養(yǎng)基，美國(guó) GIBCO公司；T（HY-10027）RIA 血清睪酮放免試劑盒、P（HY-031）RIA血清孕酮放免試劑盒，北京華英生物技術(shù)研究所；TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，瑞士Roche公司；4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI），美國(guó)圣克魯斯生物技術(shù)有限公司。

TOX IVOS V.12.0 CASA系統(tǒng)，美國(guó)Hamilton Thorne公司；XH-6020全自動(dòng)放免計(jì)數(shù)儀，西安核儀器廠；DM5500 B科研級(jí)生物顯微鏡，德國(guó)Leica公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組試驗(yàn)方法

動(dòng)物來(lái)源：雄性SD大鼠，7周齡，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證：SCXK（京）2016-0006。動(dòng)物分組：雄性 SD 大鼠18只，體重220～260 g。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室環(huán)境溫度（22±2.00）℃，濕度 50%～60%，分籠飼養(yǎng)，每籠 3只，自由采水采食；適應(yīng)1周后，按照體重隨機(jī)分3組，每組6只，分別為對(duì)照組（灌胃等體積蒸餾水）和2個(gè)3-MCPD染毒組 （染毒劑量為1.0 mg·kg-1體重/d和5.0 mg·kg-1體重/d）。每天灌胃蒸餾水或3-MCPD水溶液，共飼養(yǎng)90 d。

1.3 測(cè)定指標(biāo)

1.3.1 體重和臟器系數(shù)測(cè)定 每周稱量并記錄大鼠體重，實(shí)驗(yàn)結(jié)束當(dāng)天稱量終點(diǎn)體重，脫頸法處死。解剖大鼠后摘取肝臟、腎臟、脾臟、睪丸和附睪組織，用生理鹽水清洗，擦干后稱量各臟器質(zhì)量并計(jì)算臟器系數(shù)。計(jì)算公式：

臟器系數(shù)（%）=（臟器質(zhì)量/大鼠體重）×100 1.3.2 大鼠精子數(shù)量、活力及畸形率測(cè)定 大鼠稱重后立即剪下雙側(cè)附睪尾，放入60 mm無(wú)菌培養(yǎng)皿中，加入5 mL 37℃預(yù)熱的M199培養(yǎng)液，沿附睪尾縱向剪出4～5個(gè)長(zhǎng)度約為2 mm的切口，將該培養(yǎng)皿置于37℃培養(yǎng)箱中孵育10 min，使精子從附睪尾中游離出來(lái)，進(jìn)入培養(yǎng)基中，得到精子懸液。吸取10 μL精子懸液，加入樣品槽中，使用計(jì)算機(jī)輔助精子分析系統(tǒng) （computer assisted sperm analysis，CASA）分析精子數(shù)量及質(zhì)量。每個(gè)樣品隨機(jī)選取20個(gè)視野觀察，計(jì)數(shù)400個(gè)精子以上，并計(jì)算畸形率。計(jì)算公式：

精子畸形率（%）=（畸形精子數(shù)量/觀測(cè)精子總數(shù)）×100

1.3.3 大鼠睪丸組織病理切片觀察及形態(tài)學(xué)參數(shù)測(cè)定 稱重后將大鼠右側(cè)睪丸立即放入4%多聚甲醛固定液中固定，制備石蠟切片，然后用蘇木精-伊紅（HE）染色，進(jìn)行組織病理學(xué)觀察。參考文獻(xiàn)[16]方法測(cè)定大鼠睪丸形態(tài)學(xué)參數(shù)。每個(gè)樣本隨機(jī)選取20個(gè)曲細(xì)精管測(cè)量，從基底膜到管腔的垂直距離為生精上皮的高度，每個(gè)曲細(xì)精管在兩個(gè)不同位置上測(cè)量2次。

1.3.4 大鼠血清睪酮和孕酮含量測(cè)定 血清睪酮和孕酮水平測(cè)定方法按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，采用放射免疫分析法。非特異性結(jié)合（NSB）＜5%，靈敏度＜0.01 ng/mL，標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍 0.1～20 ng/mL，精密度為批內(nèi)變異系數(shù) （CV）＜8%，批間變異系數(shù)（CV）＜15%。

1.3.5 大鼠睪丸組織切片TUNEL染色細(xì)胞凋亡觀察 將石蠟切片脫蠟至水，滴加蛋白酶K工作液，37℃培養(yǎng)箱孵育30 min，之后用PBS緩沖液洗滌3次，每次5 min；稍甩干后滴加破膜工作液，常溫孵育20 min，用PBS洗滌3次，每次5 min；取試劑 1（TdT）和試劑 2（dUTP）按 2 ∶29（V/V）混合，滴加覆蓋組織，平放于濕盒內(nèi)，37℃孵育2 h；PBS洗滌3次，每次5 min，之后滴加DAPI染液復(fù)染，避光室溫孵育10 min；PBS洗滌3次，每次5 min，稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片，使用熒光顯微鏡觀察，凋亡細(xì)胞核呈現(xiàn)綠色熒光。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，將染毒組與對(duì)照組間進(jìn)行比較，P＜0.05，表示差異顯著；P＞0.05，表示染毒組與對(duì)照組相比差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Means±SD）表示。

2 結(jié)果

2.1 3-MCPD灌胃對(duì)大鼠體重的影響

由圖1可知，在13周染毒期間，染毒組大鼠體重增長(zhǎng)變化與對(duì)照組相比均無(wú)顯著差異。

圖1 各組大鼠體重的變化Fig.1 The body weight changes of experimental rats

2.2 3-MCPD灌胃對(duì)大鼠臟器系數(shù)的影響

3-MCPD染毒處理13周后，各組大鼠臟器系數(shù)見(jiàn)表1。隨著3-MCPD染毒劑量的增加，大鼠腎臟系數(shù)升高，5.0 mg·kg-1染毒組與對(duì)照組相比有顯著差異（P＜0.05）。而染毒組肝臟、脾臟、睪丸及附睪系數(shù)與對(duì)照組相比差異均不顯著（P＞0.05）。

2.3 3-MCPD灌胃大鼠精子數(shù)量及質(zhì)量的變化

如表2所示，3-MCPD染毒會(huì)降低大鼠總精子濃度、精子活力與直線運(yùn)動(dòng)精子比例，提高畸形精子率；與對(duì)照組相比，5.0 mg·kg-1染毒組大鼠總精子濃度和直線運(yùn)動(dòng)精子比例明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 3-MCPD對(duì)臟器系數(shù)的影響Table1 The effects of 3-MCPD on organ coefficient

表2 3-MCPD對(duì)大鼠總精子濃度、精子活力、直線精子比例和畸形精子率的影響Table2 The effects of 3-MCPD on total sperm concentration，rates of motile sperm，progressive sperm and teratosperm of rats

2.4 3-MCPD灌胃大鼠睪丸組織病理學(xué)及形態(tài)測(cè)量學(xué)變化

對(duì)照組大鼠睪丸曲細(xì)精管內(nèi)各級(jí)生精細(xì)胞排列規(guī)則，無(wú)壞死脫落，睪丸間質(zhì)結(jié)構(gòu)完整，間質(zhì)細(xì)胞緊密排列其中，無(wú)空泡（圖 2a）；1.0 mg·kg-1染毒組生精細(xì)胞仍規(guī)則排列，較為疏松，少量細(xì)胞脫落，間質(zhì)結(jié)構(gòu)緊密完整（圖 2b）；5.0 mg·kg-1染毒組各級(jí)生精細(xì)胞排列紊亂，結(jié)構(gòu)疏松，有大量細(xì)胞脫落形成空洞，間質(zhì)細(xì)胞排列疏松，且內(nèi)有空泡（圖2c）。

圖2 3-MCPD對(duì)睪丸組織形態(tài)學(xué)的影響Fig.2 Effects of 3-MCPD on histomorphology of the testis

對(duì)大鼠睪丸形態(tài)測(cè)量學(xué)評(píng)價(jià)結(jié)果如表3所示。兩組3-MCPD染毒大鼠的曲細(xì)精管直徑均明顯縮?。≒＜0.05），同時(shí)3-MCPD還會(huì)降低生精上皮高度，差異不顯著（P＞0.05）。

表3 3-MCPD暴露大鼠睪丸形態(tài)的變化Table3 The morphometric index changes of the testes in rats exposed to 3-MCPD

2.5 3-MCPD灌胃對(duì)大鼠血清孕酮和睪酮水平的影響

3-MCPD對(duì)大鼠血清孕酮和睪酮水平的影響如圖3所示。3-MCPD灌胃13周后，大鼠血清中孕酮和睪酮水平均隨染毒劑量的增加呈下降趨勢(shì)；5.0 mg·kg-1染毒組血清孕酮含量明顯低于對(duì)照組（P＜0.05）；染毒組大鼠血清睪酮含量與對(duì)照相比差異不顯著（P＞0.05）。

2.6 3-MCPD灌胃大鼠睪丸TUNEL細(xì)胞凋亡染色的變化

熒光顯微鏡觀察TUNEL染色后凋亡細(xì)胞核呈綠色熒光。對(duì)照組凋亡細(xì)胞較少，而1.0 mg·kg-1和5.0 mg·kg-1染毒組均出現(xiàn)較多的凋亡細(xì)胞，且多分布于曲細(xì)精管內(nèi)部。

圖3 3-MCPD對(duì)大鼠性激素水平的影響Fig.3 Effects of 3-MCPD on levels of sex hormone of rats

圖4 3-MCPD對(duì)大鼠睪丸細(xì)胞凋亡的影響（×200）Fig.4 Effects of 3-MCPD on apoptosis of testicular cells（×200）

3 討論

在較低暴露量的 3-MCPD（1.0，5.0 mg·kg-1體重/d）作用下，大鼠體重沒(méi)有明顯變化，表明該劑量不影響大鼠生長(zhǎng)。3-MCPD 5.0 mg·kg-1染毒組大鼠的腎臟系數(shù)與對(duì)照組相比顯著上升（P＜0.05）；其它各組肝臟、脾臟、睪丸及副睪系數(shù)均無(wú)明顯變化。

精子數(shù)量及質(zhì)量是評(píng)價(jià)雄性生殖能力最直觀的指標(biāo)，精子總濃度反映精液中精子的數(shù)量，精子活力、直線運(yùn)動(dòng)精子比例及精子畸形率則綜合反映精子的質(zhì)量[17]。本研究使用CASA系統(tǒng)分析低劑量3-MCPD暴露13周后大鼠精子數(shù)量及質(zhì)量各項(xiàng)參數(shù)，結(jié)果表明，3-MCPD可顯著降低總精子濃度與直線運(yùn)動(dòng)精子比例，提高畸形精子率。有研究報(bào)道了高劑量3-MCPD暴露會(huì)導(dǎo)致精子數(shù)量和質(zhì)量的下降[10，18]，而低劑量暴露的研究結(jié)果是不一致的[11，15]。本研究發(fā)現(xiàn) 1.0 mg·kg-1和 5.0 mg·kg-13-MCPD染毒仍會(huì)降低精子數(shù)量，影響精子活力和形態(tài)。

睪丸曲細(xì)精管是減數(shù)分裂產(chǎn)生精細(xì)胞的場(chǎng)所。在此前的研究中發(fā)現(xiàn)高劑量3-MCPD暴露導(dǎo)致睪丸曲細(xì)精管生精上皮萎縮，生精細(xì)胞幾乎完全消失[18]。本實(shí)驗(yàn)劑量并沒(méi)有導(dǎo)致嚴(yán)重的萎縮現(xiàn)象，然而睪丸曲細(xì)精管結(jié)構(gòu)仍受到不同程度的損傷，直徑減小，生精細(xì)胞松散、脫落及排列不規(guī)則。此外，TUNEL試驗(yàn)表明，3-MCPD染毒會(huì)增加曲細(xì)精管內(nèi)凋亡細(xì)胞數(shù)量。3-MCPD可能誘導(dǎo)曲細(xì)精管內(nèi)生精細(xì)胞的凋亡，使其出現(xiàn)病理改變，從而降低精子數(shù)量。

通過(guò)睪丸組織病理切片還發(fā)現(xiàn)5 mg·kg-1體重/d 3-MCPD暴露大鼠出現(xiàn)睪丸間質(zhì)空泡損傷。睪丸間質(zhì)細(xì)胞是睪酮的主要合成場(chǎng)所[19]，其損傷可能影響睪酮的合成和分泌。睪酮作為最重要的雄性激素，其含量直接影響精子發(fā)生和成熟過(guò)程，對(duì)于維持雄性生殖能力有著關(guān)鍵作用[20]。然而，3-MCPD是否會(huì)影響睪酮水平仍存在爭(zhēng)議[15，18]。本研究發(fā)現(xiàn)3-MCPD染毒13周后大鼠血清孕酮水平顯著降低，而染毒組睪酮水平隨染毒劑量的升高有降低的趨勢(shì)，與對(duì)照相比并沒(méi)有顯著差異；孕酮是大鼠睪酮合成途徑的前體產(chǎn)物，曾有報(bào)道稱3-MCPD可以調(diào)控睪酮合成關(guān)鍵限速酶（StAR，p450scc和3β-HSD）的表達(dá)量，從而顯著降低R2C大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞孕酮產(chǎn)生水平，然而睪酮分泌并沒(méi)有明顯變化[21]，這與本研究結(jié)果一致。

綜上所述，低劑量3-MCPD亞慢性暴露會(huì)降低大鼠精子數(shù)量及質(zhì)量，損傷曲細(xì)精管，干擾性激素生物合成，誘導(dǎo)睪丸細(xì)胞凋亡。由3-MCPD帶來(lái)的食品安全風(fēng)險(xiǎn)仍不容忽視。