槲皮素在Caco-2單層細(xì)胞模型上的跨膜吸收和甲基化代謝

李素云，李 崢，王立芹，高蔚娜，張振清，郭長(zhǎng)江

（1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院，北京100038；2.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院環(huán)境醫(yī)學(xué)和作業(yè)醫(yī)學(xué)研究所，天津300050；3.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院毒物藥物研究所，北京100850；4.河北醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病學(xué)與統(tǒng)計(jì)教研室，河北石家莊050011）

槲皮素（quercetin）及其糖苷衍生物是膳食成分中最常見(jiàn)的類黃酮之一，廣泛存在于包括蔬菜、水果和中草藥等植物中，在機(jī)體內(nèi)能產(chǎn)生多種有益的作用[1-2]。已有較多的研究報(bào)道，槲皮素是類黃酮家族中最有力的抗氧化劑之一，特別是清除高活性自由基，如清除過(guò)氧化亞硝酸和羥基的能力。另外，體外實(shí)驗(yàn)表明，其具有抗凝血、抗肝纖維化、抗菌、抗動(dòng)脈粥樣硬化和抗增殖等作用[3]。槲皮素可直接調(diào)節(jié)某些生物轉(zhuǎn)化酶的基因表達(dá)，通過(guò)與雌激素結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合抑制細(xì)胞增殖[4-5]。近年來(lái)一些研究表明，槲皮素在腸道中可非競(jìng)爭(zhēng)性地抑制葡萄糖和果糖的易化擴(kuò)散，具有調(diào)節(jié)糖的腸道吸收、預(yù)防肥胖和控制血糖的作用[6]，同時(shí)具有刺激實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胰島素分泌、改善胰島素敏感性和胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)、促進(jìn)外周組織對(duì)葡萄糖利用、抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)、下調(diào)炎癥因子基因表達(dá)等作用[7-8]。由于槲皮素在自然界廣泛的分布和多樣的生物學(xué)作用，其在疾病預(yù)防和治療中的潛力開(kāi)始被關(guān)注，近年來(lái)成為諸多領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

但是，槲皮素在體外條件下極不穩(wěn)定，見(jiàn)光易分解、氧化。同時(shí)大量體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)表明，槲皮素在腸黏膜細(xì)胞中即發(fā)生廣泛的代謝轉(zhuǎn)化，門(mén)靜脈中幾乎檢測(cè)不到槲皮素原型，循環(huán)中的槲皮素苷元含量甚微[8-9]。因此，有關(guān)其在腸道內(nèi)的吸收規(guī)律及可能的影響因素仍無(wú)定論[10-11]，而口服生物利用度低一直被認(rèn)為是其作為功能性食品使用的主要障礙[13]，這成為限制深入了解和有效利用槲皮素的瓶頸之一。本研究利用小腸吸收模型Caco-2細(xì)胞單層和外排蛋白P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp)和多藥耐藥蛋白2（multi-drug resistance protein 2，MRP2)的特效抑制劑環(huán)胞菌素A（cyclosporin，CysA）和MK571，對(duì)槲皮素的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)行了動(dòng)態(tài)考察和分析，為進(jìn)一步揭示槲皮素在腸道的吸收過(guò)程及可能的影響因素奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑和儀器

Caco-2細(xì)胞，40～50代，美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)。槲皮素、檉柳黃素（tamarixetin）、異鼠李亭（isorhamnetin）、L-谷氨酰胺和胰蛋白酶，美國(guó)Sigma 公司；甲醇（色譜純），美國(guó)Fisher 公司；DMEM 培養(yǎng)基，美國(guó)Gibico公司；胎牛血清和非必需氨基酸，美國(guó)Hyclone 公司；丁螺環(huán)酮（批號(hào)0803021），北京華素制藥股份有限公司；其他試劑均為分析純。Millicell 12 孔板，美國(guó)Millipore 公司；高效液相色譜-質(zhì)譜（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）（Agilent 1100 LC/MS DVL，DE），美國(guó)Agilent公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

Caco-2 細(xì)胞用DMEM 培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、1%非必需氨基酸、1% L-谷氨酰胺和青霉素-鏈霉素雙抗液）培養(yǎng)，孵育條件為37℃，5%CO2。

1.3 槲皮素跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)[3]

實(shí)驗(yàn)前，將接種有細(xì)胞的12 孔Millicell 板以37℃PBS（pH 7.2）浸泡15 min，輕微沖洗Millicell板，除去細(xì)胞表面附著物。

腔側(cè)→基底側(cè)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)：在腔側(cè)加入含槲皮素的PBS 600 μL，槲皮素終濃度為9.0或18.0 mg·L-1；基底側(cè)加入PBS（pH 7.2）1200 μL；每濃度設(shè)3復(fù)孔，置37℃，5%CO2條件下孵育，分別于30，60，90，120 和150 min 于基底側(cè)和腔側(cè)分別取樣50 μL，-4℃冷藏備用，并各補(bǔ)充等體積PBS?？瞻讓?duì)照組腔側(cè)和基底側(cè)均只加PBS，其他操作相同。取出的樣品精確加入等體積內(nèi)標(biāo)溶液后充分混勻，進(jìn)樣20 μL，應(yīng)用LC-MS 測(cè)定槲皮素、異鼠李亭和檉柳黃素。

基底側(cè)→腔側(cè)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)：將含槲皮素的PBS 1200 μL 加入基底側(cè)，槲皮素終濃度為9.0 或18.0 mg·L-1；腔側(cè)加入PBS600 μL；其他操作同上。

P-gp和MRP2抑制實(shí)驗(yàn)：先于腔側(cè)加入300 μL CysA 10 mmol·L-1或MK571 1 mmol·L-1（pH=7.2），孵育15 min 后，再加入300 μL含槲皮素的PBS 溶液，終濃度為9.0和18.0 mg·L-1，其余操作同上。

1.4 槲皮素及其甲基代謝產(chǎn)物的LC-MS檢測(cè)[4]

液相條件：色譜柱為Agient-C18 柱，2.1 mm×100 mm，3.5 μm，柱溫為室溫，流動(dòng)相A為水（含0.1%甲酸）；流動(dòng)相B為甲醇+乙腈（含0.1%甲酸），A∶B=65∶35（V/V）。流速：0.2 mL·min-1；進(jìn)樣量：20 μL。

質(zhì)譜條件：采用電噴霧離子源，霧化氣壓力30 psi，干燥氣流速8 L·min-1，干燥氣溫度35℃，毛細(xì)管壓力3000 V，四極桿溫度保持在99℃，增益為1，峰寬為0.10 min，選擇正離子模式，采用選擇離子監(jiān)測(cè)（SIM）測(cè)定以提高靈敏度。

應(yīng)用流動(dòng)注射方式（FIA）、以全掃描模式優(yōu)化各化合物的Fragmentor 值及分子離子峰的質(zhì)荷比（m/z）。槲皮素、異鼠李亭和檉柳黃素的m/z 分別為303，317和317，內(nèi)標(biāo)丁螺環(huán)酮m/z為386.2。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 槲皮素雙向轉(zhuǎn)運(yùn)中槲皮素及其甲基化代謝產(chǎn)物在加載側(cè)和透過(guò)側(cè)含量的動(dòng)態(tài)變化

2.1.1 槲皮素含量的動(dòng)態(tài)變化

由圖1可見(jiàn)，槲皮素9.0和18.0 mg·L-1在Caco-2單層細(xì)胞模型上雙向的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中，透過(guò)側(cè)槲皮素的動(dòng)態(tài)變化均呈先升后降的趨勢(shì)，120 min 達(dá)峰值，隨后下降（P＜0.01）；加載側(cè)剩余量在150 min內(nèi)呈持續(xù)下降趨勢(shì)（P＜0.01）。

2.1.2 異鼠李亭含量的動(dòng)態(tài)變化

由圖2可見(jiàn)，在Caco-2單層細(xì)胞模型上雙向跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中，槲皮素9.0和18.0 mg·L-1組不同時(shí)間點(diǎn)，于加載側(cè)和透過(guò)側(cè)均能檢測(cè)到異鼠李亭，其雙側(cè)含量呈現(xiàn)與母體化合物槲皮素相似的趨勢(shì)特征，120 min 達(dá)峰，150 min 下降，且18 mg·L-1組異鼠李亭的含量均高于同側(cè)的9 mg·L-1組。另外發(fā)現(xiàn)，兩側(cè)異鼠李亭的含量在雙向轉(zhuǎn)運(yùn)之間有差別：腔側(cè)→基底側(cè)轉(zhuǎn)運(yùn)中，從30～150 min 腔側(cè)的含量始終高于基底側(cè)（P＜0.01）；而基底側(cè)→腔側(cè)轉(zhuǎn)運(yùn)中，30 min 時(shí)基底側(cè)的含量高于腔側(cè)，60 min 后腔側(cè)含量高于基底側(cè)，直至150 min孵育終點(diǎn)。

Fig.1 Dynamic changes of quercetin amount on receiver side（A1 and B1）and loading side（A2 and B2）during bidirectional transport. A：apical→basolateral transport；B：basolateral→apical transport. s，n=3. ＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with the previous time group of the same concentration；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with quercetin group at the same time

2.1.3 檉柳黃素含量的動(dòng)態(tài)變化

由圖3可見(jiàn)，槲皮素在Caco-2單層細(xì)胞在雙向跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中，9.0和18.0 mg·L-1組不同時(shí)間點(diǎn)，于加載側(cè)和透過(guò)側(cè)均能檢測(cè)到檉柳黃素。雙側(cè)檉柳黃素的含量變化和分布趨勢(shì)與異鼠李亭相似，18 mg·L-1組檉柳黃素的含量均高于同側(cè)的9 mg·L-1組（P＜0.01）。檉柳黃素在兩側(cè)的分布特點(diǎn)亦與異鼠李亭相似，在腔側(cè)→基底側(cè)轉(zhuǎn)運(yùn)中，腔側(cè)的含量始終高于基底側(cè)（P＜0.01）；基底側(cè)→腔側(cè)轉(zhuǎn)運(yùn)中，30～60 min時(shí)基底側(cè)的含量高于腔側(cè)，60 min后腔側(cè)含量高于基底側(cè)（P＜0.01），直至150 min孵育終點(diǎn)。

Fig.2 Dynamic changes of isorhamnetin on both sides after bi-directional transport of quercetin. A1 and B1：apical side→basolateral side；A2 and B2：basolateral side→apical side；A：quercetin 18 mg·L-1；B：quercetin 9 mg·L-1.s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with the previous time group of the same concentration；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with quercetin group at the same time.

2.2 槲皮素雙向轉(zhuǎn)運(yùn)中槲皮素及其甲基化代謝產(chǎn)物在加載側(cè)和透過(guò)側(cè)相對(duì)含量的分析比較

由表1 和表2 可見(jiàn)，在30～150 min 孵育時(shí)間內(nèi)，透過(guò)側(cè)槲皮素在120 min達(dá)到峰值時(shí)，仍不及加載量的7%～10%，150 min 時(shí)減至6%～7%；而加載側(cè)剩余量在30 min 時(shí)已不足加載量20%～25%，且隨孵育時(shí)間持續(xù)減少，150 min 時(shí)不足加載量的10%，表明在跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中，加載側(cè)減少的槲皮素＞90%未檢測(cè)到。槲皮素的甲基化代謝產(chǎn)物異鼠李亭和檉柳黃素在兩側(cè)的檢出量亦僅為槲皮素加載量的0.1%～0.3%。

Fig.3 Dynamic changes of tamarixetin on both side after bi-directional transport of quercetin. A1 and B1：apical side→basolateral side；A2 and B2：basolateral side→apical side；A：quercetin 18 mg·L-1；B：quercetin 9 mg·L-1. s，n=3. ＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with the previous time group of the same concentration；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with quercetin group at the same time.

Tab.1 Dynamic changes of percentage of quercetin and methyl quercetin on both sides after apical side→basolateral side transport of quercetin 18 mg·L-1loaded

Tab.2 Dynamic changes of percentage of quercetin and methyl quercetin on both sides after basolateral side→apical side transport of quercetin 18 mg·L-1 loaded

2.3 P-糖蛋白和MRP2 對(duì)槲皮素跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的影響

由圖4可知，槲皮素在Caco-2單層細(xì)胞腔側(cè)→基底側(cè)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中，在槲皮素、CysA+槲皮素和MK571+槲皮素孵育條件下，槲皮素9.0和18.0 mg·L-1透過(guò)側(cè)槲皮素含量的動(dòng)態(tài)變化均呈現(xiàn)隨孵育時(shí)間先升后降的趨勢(shì)，120 min達(dá)峰，隨后下降（P＜0.01）。與槲皮素組比較，CysA+槲皮素和MK571+槲皮素組透過(guò)側(cè)槲皮素均顯著高于槲皮素組（P＜0.01）。

Fig.4 Dynamic changes of quercetin amount on basolateral side during transmembrane transport of apical side→basolateral side.，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with the previous time group of the same concentration；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with quercetin group at the same time.

3 討論

腸道吸收和排泄是決定口服黃酮類化合物生物利用度的兩個(gè)主要因素，不良的口服生物利用度已被認(rèn)為是其作為藥物和營(yíng)養(yǎng)劑使用的一個(gè)主要障礙[14-15]。已往研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素口服后，血液中幾乎檢測(cè)不到槲皮素原型的存在，由于槲皮素分子量大、極性強(qiáng)，因此在很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)被認(rèn)為很難在腸道吸收，口服后的吸收可以忽略不計(jì)[16-18]。近年來(lái)的大量研究證實(shí)，槲皮素可以在小腸各段被吸收，并且在腸道黏膜細(xì)胞內(nèi)即發(fā)生廣泛的代謝[17-18]。Walgren等[19]采用Caco-2細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素可通過(guò)結(jié)腸上皮細(xì)胞吸收。Hollman等[20]通過(guò)回腸造口術(shù)的志愿者口服槲皮素，發(fā)現(xiàn)實(shí)際上人的腸道可吸收相當(dāng)量的槲皮素，但在吸收過(guò)程中首過(guò)代謝嚴(yán)重，因此口服給藥槲皮素后原型成分的血漿濃度水平極低，其中被吸收的槲皮素僅有不到1.5%以原型通過(guò)尿液排出。本課題組前期研究也表明，槲皮素在Caco-2單層細(xì)胞模型上，可以完整的分子形式被Caco-2 細(xì)胞攝取并分泌到基底側(cè)[21]，同時(shí)還檢測(cè)到槲皮素的甲基化代謝產(chǎn)物。槲皮素在Caco-2 細(xì)胞上的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)特征與其糖苷不同，槲皮素在跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中隨孵育時(shí)間呈現(xiàn)先升后降的動(dòng)態(tài)特征，而其糖苷則呈現(xiàn)出隨孵育時(shí)間持續(xù)升高的動(dòng)態(tài)表現(xiàn)，150 min 孵育時(shí)間內(nèi)沒(méi)有觀察到平臺(tái)期，透過(guò)側(cè)的甲基代謝產(chǎn)物具有和其原型化合物相似的動(dòng)態(tài)表現(xiàn)[22-23]。對(duì)槲皮素的穩(wěn)定性考察表明，在37℃，5%CO2細(xì)胞孵育條件下，180 min時(shí)間內(nèi)槲皮素的穩(wěn)定性好[24]，從而可以排除槲皮素在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中的穩(wěn)定性不佳對(duì)其動(dòng)態(tài)特征產(chǎn)生的影響。由此推測(cè)，槲皮素獨(dú)特的動(dòng)態(tài)特征可能與其跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中的代謝有關(guān)，同時(shí)也不能排除外排蛋白對(duì)其跨膜吸收的影響[25-26]。但即便如此，仍有研究認(rèn)為槲皮素作為膳食和中草藥中普遍存在的黃酮類物質(zhì)，生物利用度較差，且不同的研究結(jié)果差異也較大[27]。

本研究結(jié)果表明，在Caco-2 單層細(xì)胞模型上的雙向轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中，當(dāng)加載側(cè)槲皮素呈現(xiàn)隨孵育時(shí)間持續(xù)下降的趨勢(shì)時(shí)，透過(guò)側(cè)測(cè)到的槲皮素呈現(xiàn)出先升后降的特征表現(xiàn)，120 min 達(dá)峰，隨后下降，但120 min 達(dá)峰時(shí)，透過(guò)側(cè)槲皮素的量也才相當(dāng)于加載量的7%～10%。而加載側(cè)槲皮素在孵育30 min時(shí)即已剩余不足加載量的20%～25%，150 min時(shí)僅為加載量的約10%。即加載側(cè)減少的槲皮素與透過(guò)側(cè)測(cè)定到的槲皮素之間相差懸殊，在跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中，加載側(cè)減少的槲皮素的近90%未在透過(guò)側(cè)檢測(cè)到。槲皮素的甲基化產(chǎn)物異鼠李亭和檉柳黃素在兩側(cè)的量也僅為相對(duì)于槲皮素加載量的0.1%～0.3%。由此表明，在150 min 時(shí)間內(nèi)，加載量的約90%已經(jīng)被吸收，而透過(guò)側(cè)檢測(cè)到的量卻不足加載量的10%，二者相差在10倍左右。

進(jìn)一步對(duì)槲皮素甲基代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析，顯示槲皮素在雙向轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中，150 min時(shí)間內(nèi)，加載側(cè)和透過(guò)側(cè)均能測(cè)定到異鼠李亭和檉柳黃素，且在兩側(cè)的動(dòng)態(tài)分布均呈現(xiàn)出與透過(guò)側(cè)母體化合物槲皮素相似的動(dòng)態(tài)特征，即在孵育的前120 min 內(nèi)呈逐漸升高的動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)，120 min 達(dá)峰，隨后下降。研究還發(fā)現(xiàn)，在由腔側(cè)→基底轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中，異鼠李亭和檉柳黃素在任一時(shí)間點(diǎn)腔側(cè)的含量均顯著高于基底側(cè)；而在基底側(cè)→腔側(cè)轉(zhuǎn)運(yùn)中，30 min時(shí)基底側(cè)異鼠李亭和檉柳黃素的量高于腔側(cè)，60～90 min 時(shí)腔側(cè)面的含量超過(guò)基底側(cè)，且這一趨勢(shì)一直持續(xù)到150 min 孵育終點(diǎn)。也就是說(shuō)，無(wú)論腔側(cè)還是基底側(cè)加載槲皮素，30～60 min 后腔側(cè)的甲基槲皮素的量總是高于基底側(cè)，其原因待深入研究。

本研究同時(shí)觀察了P-pg 和MRP2 對(duì)槲皮素跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，P-gp 特效抑制劑CysA和MRP2 特效抑制劑MK571 均顯著增加了槲皮素的透過(guò)量，提示P-gp和MRP2對(duì)槲皮素跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)可能具有一定的影響。

綜上所述，槲皮素在跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中的代謝轉(zhuǎn)化有可能是影響其吸收和生物利用度的影響因素之一，外排蛋白P-pg和MRP2對(duì)其跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)亦有一定的影響。在此基礎(chǔ)上，深入研究槲皮素在腸道吸收過(guò)程中的代謝轉(zhuǎn)化，以及這些代謝轉(zhuǎn)化對(duì)槲皮素生物活性及跨膜吸收產(chǎn)生的影響具有重要意義。