利用NCI-H1975細(xì)胞篩選對奧西替尼耐藥的鐵氧還蛋白1基因及其功能鑒定

陳 晨＊，彭培佩＊，王 健，黃 芳，王 芃，李山虎，王建剛

（1.河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，河南洛陽471023；2.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院生物工程研究所，北京100850；3.廣東藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，廣東省生物技術(shù)候選藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州510006）

2018年，全球約有1810萬新發(fā)癌癥病例，其中肺癌占11.6%，是癌癥中診斷率最高的病種[1]。而非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占肺癌總數(shù)的80%～85%，是全球致死率最高的腫瘤[2]。在NSCLC治療中，肺腺癌占總數(shù)50%以上，是最常見的組織亞型。導(dǎo)致肺腺癌發(fā)生的相關(guān)驅(qū)動(dòng)基因包括表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR），Kirsten大鼠肉瘤病毒致癌基因（kirsten rat sarcoma viral oncogene，KRAS）、人EGFR2（HER2）、磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸3-酪氨酸α 催化亞基、B-Raf 原癌基因和Met 原癌基因（Met proto-oncogene，MET）基因突變及間變性淋巴癌激酶，ROS 原癌基因1 和RET 原癌基因重排[3]。EGFR 又稱Her1 或者ErbB1，是ErbB 受體家族4大成員之一。EGFR 過度表達(dá)能激活下游重要的信號(hào)通路，從而導(dǎo)致細(xì)胞增殖、存活、轉(zhuǎn)移和血管生成等[4]。在NSCLC 的研究中，EGFR 一直是一個(gè)熱點(diǎn)。

對于NSCLC 治療，一個(gè)重要的里程碑進(jìn)展就是發(fā)現(xiàn)EGFR 激活突變是一種有效的治療靶點(diǎn)，進(jìn)而研發(fā)出具有顯著抗腫瘤活性的一系列EGFR 酪氨酸激酶抑制劑（EGFR tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI）。目前為止，已經(jīng)開發(fā)出了3代EGFRTKI 藥物，然而大多數(shù)接受EGFR-TKI 治療的患者經(jīng)常在1～2 年內(nèi)產(chǎn)生耐藥性[5-8]。EGFR-TKI 耐藥最常見的機(jī)制之一是EGFR發(fā)生T790M突變，該突變約占獲得性耐藥患者比例的50%～60%[9-10]。第三代EGFR-TKI奧西替尼（osimertinib）克服了由于T790M 突變而產(chǎn)生的耐藥，臨床反應(yīng)有效率為59%～71%[11-14]。但是隨著時(shí)間的推移，患者對奧西替尼也不可避免地產(chǎn)生耐藥性。有文獻(xiàn)指出，EGFR 外顯子20 中的新的C797S 氨基酸突變，是T790M 陽性患者中對奧西替尼耐藥的潛在機(jī)制[15]。除了C797 位突變，L798I 突變[16-17]，KRAS或者絲裂原活化蛋白激酶激酶（mitogen-activated protein kinase kinase，MEK）突變激活的絲裂原活 化 蛋 白 激 酶 激 活 通 路[18]，或 通 過MET 或ERBB2[17，19-21]進(jìn)行的旁路激活，都是已報(bào)道的第三代EGFR-TKI 耐藥機(jī)制。盡管如此，目前為止人們對奧西替尼獲得性耐藥機(jī)制的了解并不完全。本研究主要是利用CRISPR-Cas9全基因組文庫和人非小細(xì)胞肺癌NCI-H1975 細(xì)胞篩選對奧西替尼耐藥基因及其分子作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、藥物、試劑和主要儀器

感受態(tài)細(xì)胞大腸桿菌DH5α 和DH10b 為本實(shí)驗(yàn)室保存，人NCI-H1975細(xì)胞購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心；奧西替尼購于美國Selleck 公司；Genome-scale CRISPR Knock-Out v2.0 pooled libraries（GeCKOv2 libraries）購于美國Addgene 公司；細(xì)胞染色體DNA 提取試劑盒購自美國Bimake 公司；pBM23 Toposmart 克隆試劑盒購于北京博邁德生物公司；山羊抗人微管蛋白多克隆抗體購自美國Santa Cruz 公司；兔抗人磷酸化EGFR（phosphorylation of EGFR，p-EGFR）、EGFR和FDX1的多克隆抗體購于英國Abcam公司；兔抗人細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶的磷酸化抗體（phosphorylation of extracellular regulated protein kinases，p-ERK），總聚（ADP-核糖）聚合酶全蛋白〔total-poly（ADP-ribose）polymerase，T-PARP〕多克隆抗體購自美國Cell Signaling 公司；山羊抗兔和兔抗山羊IgG二抗購于北京中杉金橋生物公司；RPMI 1640，DMEM 高糖培養(yǎng)基和胰蛋白酶購于美國Gibco 公司；二甲亞砜（DMSO）購于美國Sigma 公司；胎牛血清購于杭州四季青公司；青霉素和鏈霉素購于華北制藥有限公司；嘌呤霉素購于美國HyClone 公司；蛋白酶抑制劑和結(jié)晶紫購于美國Amresco 公司；Lipofectamine 3000 轉(zhuǎn)染試劑盒、BCA 蛋白定量試劑盒、CO2恒溫培養(yǎng)箱和MULTISKAN FC酶標(biāo)儀均購自美國Thermo 公司；ECL 發(fā)光液購于北京天跟生化科技有限公司；Cell Counting Kit8（CCK8）試劑盒購于東仁化學(xué)科技有限公司；5417R低溫高速離心機(jī)及5418 臺(tái)式常溫離心機(jī)購于德國Eppendorf 公司；電泳槽和濕轉(zhuǎn)膜儀購于美國Biorad公司。

1.2 GeCKO v2 libraries擴(kuò)增及慢病毒包裝

根據(jù)GeCKO v2 libraries 說明書，分別取A、B文庫各1 μL，使用電擊轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)菌，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂氨芐平板，37℃溫箱培養(yǎng)14 h，將A和B庫兩種轉(zhuǎn)化子分別刮下收集，按質(zhì)粒提取試劑盒（美國Axygen 公司）說明書提取質(zhì)粒，并測定濃度，保存在-20℃。文庫擴(kuò)增后，根據(jù)Lipo3000 試劑盒說明書操作，在HEK293T 細(xì)胞中進(jìn)行病毒包裝，并測定病毒滴度。

1.3 Genome-scale CRISPR 文庫篩選奧西替尼耐藥基因

用GeCKO v2 libraries 來進(jìn)行全基因組的篩選。NCI-H1975 細(xì)胞感染含有全基因組小導(dǎo)向RNA（sgRNA）序列的GeCKO v2 libraries 慢 病毒?？刂萍?xì)胞感染慢病毒感染復(fù)數(shù)（multipilicity of infection，MOI）≤0.3，以期確保大部分細(xì)胞中每個(gè)細(xì)胞只能感染1個(gè)sgRNA；為保證感染效率，初始病毒感染細(xì)胞數(shù)≥3.3×108。因此，使用90個(gè)175 cm2培養(yǎng)瓶，每瓶接種NCI-H1975細(xì)胞數(shù)為4.0×106，共接種細(xì)胞3.6×108，用嘌呤霉素抗性篩選后算出MOI=0.255，滿足MOI≤0.3的實(shí)驗(yàn)要求。

將嘌呤霉素篩選后的細(xì)胞分成3 組，分別為第0天（d 0）細(xì)胞組（即為進(jìn)行奧西替尼篩選當(dāng)天收集的1/3細(xì)胞）、奧西替尼4 nmol·L-1組和細(xì)胞對照組，每組細(xì)胞數(shù)6×107。奧西替尼開始篩選的當(dāng)天即將d 0 細(xì)胞樣品凍存收集，同時(shí)當(dāng)奧西替尼4 nmol·L-1組和細(xì)胞對照組細(xì)胞增殖至大致1.2×108時(shí)進(jìn)行傳代，2組細(xì)胞分別篩選10代，以確保潛在目的基因的穩(wěn)定富集。篩選結(jié)束后，收集3 組細(xì)胞并送上海尋百會(huì)生物科技有限公司進(jìn)行高通量測序和生物信息學(xué)分析，分析富集的sgRNA及對應(yīng)的基因。

1.4 候選耐藥基因鐵氧還蛋白1（ferredoxin 1，F(xiàn)DX1）敲除質(zhì)粒構(gòu)建和細(xì)胞系建立

利用CRISPR.V2 載體建立敲除FDX1 基因的慢病毒表達(dá)載體，靶向FDX1 的sgRNA 序列，F(xiàn)：CACCGATCCAGCGCGGGACCCAGCG，R：AAACCGCTGGGTCCCGCGCTGGATC；靶向腺相關(guān)病毒結(jié)合位點(diǎn)1（adeno-associated virus integration site1，AAVS1）基因sgRNA 序列（對照組），F(xiàn)：CACCGGGGGCCACTAGGGACAGGAT，R：AAACATCCTGTCCCTAGTGGCCCCC。引物由北京博邁德生物工程公司合成，4℃保存。使用CRISPR.V2載體按膠回收試劑盒（Axygen公司）說明書進(jìn)行酶切回收載體片段，將設(shè)計(jì)的sgRNA 進(jìn)行退火，將載體片段和退火片段通過T4 連接酶連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10b，涂氨芐平板，挑單克隆菌落，搖菌提取質(zhì)粒，并測定濃度，-20℃保存。送北京博邁德生物工程公司進(jìn)行測序。

為了獲得慢病毒，將293T細(xì)胞接種于100 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿，24 h 后，分別用靶向FDX1 或AAVS1的sgRNA 質(zhì)粒和產(chǎn)生慢病毒顆粒的包裝質(zhì)粒psPAX2以及包膜質(zhì)粒pMD2.G按照4∶3∶1用量共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，12 h 后換成8 mL 新鮮培養(yǎng)液并分別在24 和48 h 后收取病毒液，將2 次病毒液混合后用0.45 微米孔徑濾器過濾，分裝，留部分于4℃保存待感染目的細(xì)胞，其余放在-80℃保存。

將NCI-H1975 細(xì)胞接種在100 mm 細(xì)胞培養(yǎng)皿中，密度40%～50%。第2天，將4 mL DMEM完全培養(yǎng)液與聚凝胺6～8 g·L-1和4 mL 病毒液混合后替換老的培養(yǎng)液，12 h后換為新鮮DMEM完全培養(yǎng)基，2 d 后，細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時(shí)，加入嘌呤霉素1.5 g·L-1篩選72 h。建立sg-FDX1 和sg-AAVS1細(xì)胞系。

1.5 細(xì)胞染色體DNA提取和測序

按照細(xì)胞染色體DNA提取試劑盒的要求，首先將sg-FDX1 細(xì)胞接種在30 mm 小皿中，生長密度為80%～90%時(shí)吸去培養(yǎng)液，PBS 洗2遍。收取細(xì)胞，加入100 μL消化液，充分重懸，55℃水浴30 min；然后在95℃水浴5 min 滅活蛋白酶。DNA 直接進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，取大約2 μL 擴(kuò)增產(chǎn)物（50 ng），1 μL T 載體pBM23 和1 μL 10×Toposmart，加離子水補(bǔ)充到10 μL反應(yīng)體系后在室溫下連接5～15 min，然后將5 μL連接產(chǎn)物加入到50 μL DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30 min；然后于42℃熱激45 s，冰浴2 min，加入500 μL 無抗性LB培養(yǎng)液后，再置37℃搖床中，165 rpm培養(yǎng)1 h；取200 μL菌液均勻涂抹于氨芐抗性LB平板上，置37℃恒溫培養(yǎng)箱中。12 h后挑取單克隆菌落，搖菌12 h 送檢測序。PCR 擴(kuò)增引物：FDX1-F：TGGAGTCTCTCGCGGCCTCA，F(xiàn)DX1-R：GCACTGGAACCAGAGACTC。

1.6 Western 印跡法檢測sg-FDX1 和sg-AAVS1細(xì)胞中的FDX1，c-PARP蛋白水平及EGFR和ERK磷酸化水平

將敲除FDX1 和AVVS1 表達(dá)的NCI-H1975 細(xì)胞分別接種在2 個(gè)培養(yǎng)皿中，貼壁后收取細(xì)胞Western 印跡法檢測敲除效果。將sg-FDX1 和sg-AVVS1 細(xì)胞各接種在4 個(gè)培養(yǎng)皿中，分別加入奧西替尼0，30，50 和100 nmol·L-1處理30 h 后收取細(xì)胞；用含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA 裂解液裂解細(xì)胞，利用BCA 比色法在酶標(biāo)儀570 nm 處檢測吸光度（A570nm）值，測定標(biāo)準(zhǔn)曲線得出蛋白樣品的濃度。向蛋白樣品中加入5×SDS 加樣緩沖液并煮沸10 min，對蛋白進(jìn)行預(yù)變性處理。以10%SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白樣品后，在濕轉(zhuǎn)裝置中以200 mA 進(jìn)行恒流轉(zhuǎn)膜2.5 h，在5%脫脂奶粉中封閉約30 min。使用5%脫脂奶粉稀釋一抗（1∶1000），在4℃的搖床上孵育過夜。用TBST洗膜3次后加入二抗（1∶5000）室溫孵育1 h，之后用TBST 洗膜3 次，每次5 min，以ECL法顯影及定影。膠片經(jīng)掃描后用Image J進(jìn)行積分吸光度分析。以目標(biāo)蛋白和內(nèi)參蛋白的積分吸光度的比值表示蛋白相對表達(dá)水平。

1.7 CCK-8法檢測細(xì)胞存活

將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞消化后，按每孔3000 個(gè)細(xì)胞接種到96 孔板中，每組3 個(gè)孔，置于CO2培養(yǎng)箱24 h 后，各孔單獨(dú)加入奧西替尼0，12，20，30 nmol·L-1處理72 h，或用奧西替尼30 nmol·L-1處理細(xì)胞3，5 和7 d 后，去除原孔內(nèi)的培養(yǎng)液后每孔加入100 μL稀釋后的CCK8工作液（按CCK8原液與培養(yǎng)液1∶9 的比例配制）繼續(xù)孵育2 h，利用酶標(biāo)儀在450 nm處檢測吸光度（A450nm）值，細(xì)胞相對存活率（%）=（加藥組A450nm-空白組A450nm）/（正常對照組A450nm-空白組A450nm）×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖

當(dāng)克隆生長到約有10個(gè)細(xì)胞時(shí)，加入奧西替尼12 nmol·L-1，10 d后去除原培養(yǎng)液，加入PBS 洗滌3次，甲醇固定細(xì)胞約30 min后，加入結(jié)晶紫染液染色30 min，用流水緩慢清洗孔內(nèi)剩余染料后放置于室內(nèi)風(fēng)干。顯微鏡下計(jì)數(shù)≥10 個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 CRISPR-Cas9文庫篩選NCI-H1975細(xì)胞中奧西替尼耐藥基因FDX1

圖1 是通過CRISPR-Cas9 文庫在NCI-H1975細(xì)胞中篩選對奧西替尼發(fā)揮耐藥作用的FDX1基因的流程。本研究采用GeCKO v2 libraries 慢病毒文庫感染NCI-H1975細(xì)胞，經(jīng)嘌呤霉素篩選后建立起全基因組敲除的NCI-H1975細(xì)胞系。將該細(xì)胞系分成3組，分別命名為第0天組（d 0），奧西替尼4 nmol·L-1處理組和細(xì)胞對照組，將奧西替尼4 nmol·L-1組和細(xì)胞對照組分別培養(yǎng)篩選10代后，將3組細(xì)胞提取全基因組DNA 并且PCR 擴(kuò)增進(jìn)行sgDNA 高通量測序和生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)其中一種sgRNA 富集，所對應(yīng)的基因?yàn)镕DX1。

Fig.1 Genome-wide CRISPR screens identified ferredoxin 1（FDX1）as potential osimertinib resistance gene on NCI-H1975 cells.

2.2 建立的敲除FDX1的NCI-H1975細(xì)胞

提取敲除FDX1 的NCI-H1975 細(xì)胞（sg-FDX1細(xì)胞）的基因組DNA，經(jīng)PCR 擴(kuò)增sgRNA 靶點(diǎn)兩端的片段并連接T 載體后，送公司測序發(fā)現(xiàn)在靶點(diǎn)位置造成了301 bp 的大片段缺失突變（圖2A）。Western 印跡結(jié)果（圖2B）顯示，sg-FDX1 細(xì)胞中FDX1 蛋白的表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01），表明成功構(gòu)建敲除FDX1基因細(xì)胞sg-FDX1細(xì)胞。

2.3 奧西替尼對sg-FDX1細(xì)胞凋亡的作用

Western 印跡結(jié)果（圖3）顯示，奧西替尼50 nmol·L-1處理30 h 后，sg-AAVS1 細(xì)胞活化的PARP 顯著升高（P＜0.01），sg-FDX1 細(xì)胞活化的PARP無明顯變化。說明敲除FDX1減弱了奧西替尼對細(xì)胞凋亡的作用。

2.4 奧西替尼對sg-FDX1 細(xì)胞FDX 蛋白表達(dá)及EGFR和EGFR蛋白磷酸化的影響

Fig.2 Expression of FDX1 protein in sg-FDX1 cells by Western blotting. A：the sequence result of sg-FDX1 and 301 bp was deleted around the sgRNA target site；B：the FDX1 expression level in sg-adeno-associated virus integration site1（AAVS1）and sg-FDX1 cells；C：the semi-quantitative analysis of B. IA：integrated absorbance.s，n=3. ＊＊P＜0. 01，compared with sg-AAVS1 cells.

Fig.3 Effect of osimertinib on protein expression level of cleaved-poly（ADP-ribose）polymerase（PARP）in sg-AAVS1 and sg-FDX1 cells by Western blotting. The cells were treated for 30 h. B was the semi-quantitative analysis of A.s，n=3. ＊＊P＜0.01，compared with sg-AVVS1 cells without osimertinib treatment；##P＜0.01，compared with sg-AVVS1 cells with osimertinib treatment.

Western印跡結(jié)果（圖4）顯示，奧西替尼0，30，50，100 nmol·L-1處理細(xì)胞30 h 后，與sg-AAVS1細(xì)胞相比，在抑制FDX1 蛋白表達(dá)的條件下，sg-FDX1 細(xì)胞p-EGFR 和p-ERK 蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）；2組細(xì)胞ERK全蛋白表達(dá)水平無明顯差異。而sg-FDX1 細(xì)胞中EGFR 全蛋白水平降低（P＜0.01）。表明敲除FDX1 可以減弱奧西替尼對細(xì)胞中EGFR 信號(hào)及受其調(diào)控的ERK 信號(hào)通路的抑制作用。

Fig.4 Effect of osimertinib on phosphorylation levels of EGFR，ERK and FDX1 protein expression in sg-FDX1 cells by Western blotting. A：cells were treated with osimertinib at 0，30，50，100 nmol·L-1 for 30 h；B，C and D：the semiquantitative analysis of A. s，n=3. ＊＊P＜0.01，compared with sg-AVVS1 cells.

2.5 奧西替尼對sg-FDX1 細(xì)胞克隆形成和細(xì)胞存活的影響

平板克隆結(jié)果（圖5A，B）顯示，奧西替尼12 nmol·L-1處理10 d，sg-AAVS1和sg-FDX1細(xì)胞的克隆形成能力都顯著減弱（P＜0.01），但相比sg-AAVS1 細(xì)胞，sg-FDX1 細(xì)胞在奧西替尼作用后的克隆形成能力顯著提高（P＜0.01）。CCK8 結(jié)果（圖5C，D）表明，相比sg-AAVS1細(xì)胞，奧西替尼0，12，20，30 nmol·L-1作用7 d，或者用奧西替尼30 nmol·L-1分別處理細(xì)胞3，5 和7 d，sg-FDX1 細(xì)胞增殖能力明顯增強(qiáng)（P＜0.01）。表明敲除FDX1會(huì)導(dǎo)致奧西替尼耐藥。

Fig.5 Effect of osimertinib on clonal formation（A，B）and cell survival（C，D）of sg-FDX1 cells. A and B：the cells were treated with osimertinib 12 nmol·L-1 for 10 d. x±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with corresponding without osimertinib treatment group；##P＜0.01，compared with sg-AVVS1 cells with osimertinib treatment. C：cells were treated with the indicated concentrations for 7 d；D：the cells were treated with osimertinib 30 nmol·L- 1 for indicated time points. ±s，n=3. ＊＊P＜0.01，compared with corresponding sg-AAVS1 cells.

3 討論

本研究利用CRISPR-Cas9全基因組文庫篩選系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)在奧西替尼的作用下，在NCI-H1975 細(xì)胞中FDX1的sgRNA發(fā)生了顯著的富集，提示FDX1可能參與了細(xì)胞對奧西替尼的耐藥作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)敲除NCI-H1975 細(xì)胞FDX1 表達(dá)后，奧西替尼對于誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡以及對ERGR/ERK信號(hào)通路的抑制作用都顯著降低，同時(shí)對腫瘤細(xì)胞的克隆形成和增殖的抑制作用，相對于sg-AAVS1細(xì)胞均顯著降低。這些結(jié)果都表明，F(xiàn)DX1 表達(dá)水平改變在NSCLC對于第三代靶向治療藥物奧西替尼的耐藥中發(fā)揮作用。

近年來，隨著CRISPR-Cas9 高通量篩選系統(tǒng)的不斷發(fā)展和完善，已經(jīng)篩選獲得了一系列的藥物治療耐藥基因或毒物抗性基因[22-24]。FDX1基因編碼一種小鐵硫蛋白，通過鐵氧還蛋白還原酶將電子從NADPH轉(zhuǎn)移到線粒體細(xì)胞色素P450，參與類固醇，維生素D和膽汁酸代謝[25]。研究表明，F(xiàn)DX1功能的喪失破壞了鐵-硫成簇酶的活性和細(xì)胞中鐵的穩(wěn)態(tài)分布，導(dǎo)致線粒體鐵過載和細(xì)胞質(zhì)中的鐵缺失[26]。目前沒有研究表明該分子和NSCLC對奧西替尼耐藥有關(guān)。我們敲除了NCI-H1975 細(xì)胞對奧西替尼敏感的FDX1，發(fā)現(xiàn)奧西替尼對細(xì)胞的增殖能力和克隆形成能力都得到了減弱，表明FDX1 缺失導(dǎo)致NCT-H1975細(xì)胞對奧西替尼產(chǎn)生抗性。

利用CRISPR-Cas9文庫篩選發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)DX1缺失表達(dá)減弱了伊利司莫（elesclomol）對k562 細(xì)胞的毒性作用，而伊利司莫能夠誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡[27-28]，這提示FDX1 可能參與了奧西替尼對NSCLC 細(xì)胞NCI-H1975 的凋亡誘導(dǎo)功能。目前的研究已經(jīng)證明，奧西替尼能夠有效地誘導(dǎo)EGFR 突變的NSCLC 細(xì)胞發(fā)生凋亡，這種作用可能是通過抑制EGFR以及下游ERK信號(hào)通路，導(dǎo)致BIM蛋白的表達(dá)上調(diào)和Mcl-1 蛋白的降解來實(shí)現(xiàn)的，抑制ERK信號(hào)通路能夠增強(qiáng)細(xì)胞對奧西替尼的敏感性[29]。另外對奧西替尼產(chǎn)生獲得性抗性的NSCLC細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，和敏感的細(xì)胞相比，NSCLC 抗性細(xì)胞對于MEK 信號(hào)通路抑制劑司美替尼（selumetinib）的抑制作用更加敏感，而同時(shí)使用奧西替尼和司美替尼能夠阻止NSCLC 細(xì)胞PC9 耐藥性細(xì)胞的發(fā)生，并且能夠延緩NCI-H1975 細(xì)胞針對奧西替尼產(chǎn)生耐藥[18]。這些研究提示，MAPK/ERK信號(hào)通路的激活可能是導(dǎo)致NSCLC細(xì)胞對奧西替尼產(chǎn)生耐藥的分子機(jī)制之一。

本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)敲除FDX1后，能夠明顯減弱奧西替尼誘導(dǎo)NCI-H1975 細(xì)胞凋亡作用。信號(hào)通路結(jié)果表明，敲除FDX1 后，奧西替尼對NCI-H1975細(xì)胞中EGFR 信號(hào)通路以及與凋亡有關(guān)的ERK 信號(hào)通路的抑制作用都均減弱，這可能正是FDX1 在NCI-H1975 細(xì)胞中對奧西替尼產(chǎn)生耐藥功能的重要分子機(jī)制之一，但是FDX1 是如何調(diào)控相關(guān)信號(hào)通路活性還需深入研究。