RNA干擾高遷移率族蛋白1對(duì)Aβ25-35刺激HT22細(xì)胞中晚期糖基化終末產(chǎn)物受體/Toll樣受體4信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

韓 園，劉 煜，戈文威，王孝慶，曹 紅，李 軍

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，育英兒童醫(yī)院麻醉與圍術(shù)期醫(yī)學(xué)科，浙江 溫州325027）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD）是一種多發(fā)的病因未明的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，主要表現(xiàn)為記憶力減退，認(rèn)知功能障礙以及性格改變，嚴(yán)重影響患者正常生活和基本工作[1]。目前公認(rèn)主流學(xué)說“β 淀粉樣蛋白（amyloid-β，Aβ）級(jí)聯(lián)瀑布假說”，是指腦內(nèi)沉積的Aβ主要由淀粉樣前體蛋白（amyloid-β precursor protein，APP）經(jīng)過β 分泌酶Ⅰ和γ 分泌酶1 和酶2 所合成，然后又通過腦啡肽酶（neprilysin，NEP）等方式降解。AD 患者腦內(nèi)Aβ的形成和清除的不平衡導(dǎo)致過量的Aβ產(chǎn)生級(jí)聯(lián)作用，可通過炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、糖氧剝離、細(xì)胞凋亡、線粒體功能障礙等多種途徑加速AD 的病程。AD 患者腦內(nèi)的Aβ 激活了神經(jīng)元細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞，繼而釋放大量的炎癥因子，通過氧化還原反應(yīng)對(duì)神經(jīng)元以及突觸造成傷害[2]。高遷移率族蛋白box-1（high mobility group box-1 protein，HMGB1）是一種非組DNA結(jié)合蛋白，不僅參與DNA的轉(zhuǎn)錄，且在神經(jīng)元細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞上廣泛表達(dá)，參與腦中神經(jīng)炎癥的進(jìn)程，其受體主要有晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（receptor for advanced glycation end products，RAGE）、Toll樣受體2（Toll-like receptor 2，TLR2）和TLR4等[3]。近年來研究表明，靶向特異性抑制HMGB1對(duì)于慢性炎癥反應(yīng)和自身免疫性疾病等的治療有一定作用[4]，而小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）沉默HMGB1 表達(dá)，可減少Aβ25-35刺激下原代海馬神經(jīng)元細(xì)胞中HMGB1 的表達(dá)，其機(jī)制可能與RAGE/TLR4信號(hào)通路相關(guān)[5]，故本研究探討siRNA抑制HMGB1的表達(dá)對(duì)Aβ25-35刺激HT22的影響，進(jìn)一步研究HMGB1在AD病理機(jī)制中的作用。

1 材料與方法

1.1 藥物和試劑

Aβ25-35（A4559）和MTT（M5655）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑GenMute（SL100568）購(gòu)自美國(guó)Signagen公司；兔抗小鼠HMGB1多克隆抗體（ab18256）、兔抗小鼠RAGE多克隆抗體（ab3611）、兔抗小鼠NF-κB P65 單克隆抗體（ab7970）購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司；小鼠抗小鼠TLR4 單克隆抗體（sc-293072）購(gòu)自美國(guó)Santa公司；兔抗小鼠β肌動(dòng)蛋白多克隆抗體（ap0060）購(gòu)自美國(guó)Bioworld公司；小鼠IL-1β 和TNF-α ELISA 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)R&D 公司；DyLight-594 驢抗兔（E032421）購(gòu)自美國(guó)Earthox 公司，HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG 二抗（BYE003）和HRP 標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG 二抗（BYE004）購(gòu)自美國(guó)Jackson 公司（上海博蘊(yùn)生物科技有限公司分裝）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

HT22 細(xì)胞購(gòu)自ATCC 細(xì)胞庫(kù)，該細(xì)胞是小鼠海馬細(xì)胞來源的HT-4 細(xì)胞系的一個(gè)亞系[6]。將HT22細(xì)胞接種于DMEM完全培養(yǎng)基（含1%青鏈霉素、10%胎牛血清），置于37°С，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 MTT法測(cè)Aβ25-35細(xì)胞存活

對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HT22 細(xì)胞經(jīng)胰酶消化，按5×107L-1的密度接種于96孔板。16 h后，細(xì)胞鋪滿孔底，吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，各組加入不同濃度的Aβ25-35（0，2.5，5，10，20和40 μmol·L-1），每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，孵育24 h 后，加入20 μL MTT 溶液，繼 續(xù)培養(yǎng)4 h 后，每孔加150 μL DMSO，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分融解。用酶標(biāo)儀測(cè)定在490 nm處的吸光度A490nm，并計(jì)算細(xì)胞存活率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。細(xì)胞存活率（%）=（處理組A490nm-空白組A490nm）/（對(duì)照組A490nm-空白組A490nm）×100%。計(jì)算得出其半抑制濃度（IC50）

1.4 HMGB1 siRNA序列的篩選

根據(jù)siRNA 的設(shè)計(jì)原則和GenBank 中的HMGB1 的基因序列，設(shè)計(jì)出具有特異性的針對(duì)HMGB1 的4 個(gè)大小為21 個(gè)核苷酸的干擾序列（siRNA551，siRNA706，siRNA773 和siRNA821），以及與HMGB1 序列無同源性的陰性對(duì)照片段（scramble siRNA）。siRNA 序列委托上海吉瑪公司合成：siRNA551：5′-CAAGGCUCGUUAUGAAAGATT-3′（正義鏈），5′-UCUUUCAUAACGAGCCUUGTT-3′（反義鏈）；siRNA706：5′-GCUUAUCCAUUGGUGAUGUTT-3′（正 義 鏈），5′-ACAUCACCAAUGGAUAAGCTT-3′（反義鏈）；siRNA773：5′-GCAGCCCUAUGAGAAGAAATT-3′（正義鏈），5′-UUUCUUCUCAUAGGGCUGCTT-3′（反義鏈）；siRNA821：5′-GGAUAUUGCUGCCUACAGATT-3′（正義鏈），5′-UCUGUAGGCAGCAAUAUCCTT-3′（反義鏈）。

選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用0.25%胰酶消化后，加入含10%胎牛血清的DMEM，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×108L-1，接種至6孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)50%～60%融合度時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染按GenMute轉(zhuǎn)染試劑說明書操作。轉(zhuǎn)染24 h 后收集細(xì)胞進(jìn)行Western印跡檢測(cè)。

1.5 免疫熒光法觀察HMGB1的定位

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HT22 細(xì)胞，接種于帶有細(xì)胞爬片的6孔板上，16 h后加入Aβ25-35處理24 h，經(jīng)多聚甲醛固定，Triton X-100 通透，山羊血清封閉，加一抗（兔抗小鼠HMGB1 多克隆抗體，1∶1000）和熒光標(biāo)記二抗（DyLight-594 驢抗兔，1∶50），以及4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）復(fù)染核，最后在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.6 Western印跡法檢測(cè)HMGB1，RAGE，TLR4和NF-κB P65蛋白量表達(dá)

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HT22 細(xì)胞分為5 組：正常細(xì)胞對(duì)照組（按常規(guī)方法培養(yǎng)不做任何處理），Aβ25-35組（加入終濃度為40 μmol·L-1的Aβ25-35，處理24 h）；siRNA 組（轉(zhuǎn)染siRNA 50 μmol·L-1，作用24 h）；siRNA 或scramble siRNA+Aβ25-35組（轉(zhuǎn)染siRNA或scramble siRNA 50 μmol·L-1作用24 h后，加入終濃度為40 μmol·L-1的Aβ25-35繼續(xù)孵育24 h）。

收集細(xì)胞，提取細(xì)胞蛋白，BCA 法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，經(jīng)制膠、上樣（10 μL體積含30 μg蛋白樣品）、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育一抗（HMGB1，1∶1000；RAGE，1∶1000；TLR4，1∶500；NF-κB P65，1∶2000和β肌動(dòng)蛋白，1∶1000）及二抗（HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG 二抗，1∶5000；HRP 標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG二抗，1∶5000）后曝光，用Quantity One軟件對(duì)蛋白HMGB1，RAGE，TLR4，NF-κB P65 和β 肌動(dòng)蛋白進(jìn)行積分吸光度（integrated absorbance，IA）分析。待測(cè)蛋白相對(duì)表達(dá)水平用IA目標(biāo)蛋白/IAβ肌動(dòng)蛋白比值表示。

1.7 ELlSA法檢測(cè)細(xì)胞上清液中l(wèi)L-1β和TNF-α的水平

收集正常細(xì)胞對(duì)照組（不做任何處理）、Aβ25-35組（加入終濃度為40 μmol·L-1的Aβ25-35，處理24 h）、siRNA+Aβ25-35組（轉(zhuǎn)染siRNA 50 μmol·L-1作用24 h后，加入終濃度為40 μmol·L-1的Aβ25-35繼續(xù)孵育24 h）各組細(xì)胞上清液，按ELISA 試劑盒說明書操作，用酶標(biāo)儀測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品及樣本吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和吸光度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣本IL-1β和TNF-α水平。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Aβ25-35作用HT22細(xì)胞24 h時(shí)lC50

MTT 結(jié)果顯示（圖1），Aβ25-350，2.5，5，10，20和40 μmol·L-1作用HT22 細(xì)胞24 h 后，HT22 細(xì)胞的存活率隨著Aβ25-35濃度增加而下降，IC50為41.17 μmol·L-1，為此本研究采用Aβ25-3540 μmol·L-1進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 Aβ25-35對(duì)HT22細(xì)胞形態(tài)的影響

顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)結(jié)果（圖2）顯示，正常組HT22 細(xì)胞形態(tài)良好，胞體豐滿，突起細(xì)長(zhǎng)明顯，突起間連接緊密；Aβ25-3540 μmol·L-1作用24 h 后，細(xì)胞大量死亡，聚集成團(tuán)，突起減少，細(xì)胞間隙增大（箭頭所示）。

2.3 Aβ25-35引起HT22細(xì)胞中HMGB1的定位改變

免疫熒光觀察結(jié)果（圖3）顯示，藍(lán)色熒光代表DAPI染色陽(yáng)性的細(xì)胞核，紅色熒光代表HMGB1染色陽(yáng)性的細(xì)胞，在正常對(duì)照組，紅色熒光與藍(lán)色熒光重合，說明HMGB1定位在核內(nèi)；經(jīng)Aβ25-3540 μmol·L-1作用24 h 后，紅色熒光分布于藍(lán)色熒光周圍，說明HMGB1從核內(nèi)逐漸釋放至核外（見箭頭所示）。

Fig.3 Effect of Aβ25-35 on location of high mobility group box-1 protein (HMGB1) in HT22 cells by immunofluorescence staining. Red colour represents HMGB1-positive cells；blue colour represents DAPI-positive cells. HT22 cells were stimulated by Aβ25- 35 40 μmol·L- 1 for 24 h. Arrows show location changes of HMGB1.

2.4 siRNA對(duì)HMGB1表達(dá)的抑制

Western印跡結(jié)果（圖4）顯示，與正常對(duì)照組相比，siRNA551，siRNA706，siRNA773和siRNA821組細(xì)胞中HMGB1 蛋白表達(dá)均顯著降低（P＜0.05）；提示4條特異性的siRNA序列均抑制HMGB1蛋白的表達(dá)，siRNA821抑制率最高，故選擇其用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.5 沉默HMGB1 對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)的HMGB1，RAGE，TLR4 和NF-κB P65表達(dá)的影響

Fig.4 lnhibitory effect of four kinds of small interfering RNAs (siRNAs) on expression of HMGB1 protein by Western blotting. HT22 cells were transfected by siRNA551，siRNA706，siRNA773 and siRNA821 or scramble siRNA at concen-50 μmol·L-1 for 24 h. B was the semi-quantitative result of A.s，n=3.＊P＜0.05，compared with normal control group；#P＜0.05，compared with scramble siRNA group.

Fig.5 Effect of HMGB1 inhibited by siRNA821 on expressions of HMGB1，receptor for advanced glycation end products（RAGE），Toll-like receptor 4（TLR4）and NF-κB P65 in HT22 cells induced by Aβ25-35 by Western blotting.HT22 cells were transfeced with siRNA821 or scramble siRNA at concentration of 50 μmol·L-1 for 48 h and induced by Aβ25-35 40 μmol·L- 1 for 24 h. B was the semi-quantitative result of A.s，n=3. ＊P＜0.05，compared with normal control group；#P＜0.05，compared with Aβ23-35 40 μmol·L-1 group；ΔP＜0.05，compared with siRNA821+Aβ25-35 group.

Western 印跡結(jié)果（圖5）顯示，與正常對(duì)照組相比，Aβ25-3540 μmol·L-1組HMGB1，RAGE，TLR4和NF-κB P65 的表達(dá)均升高（P＜0.05），siRNA821組以上各蛋白表達(dá)均下降（P＜0.05），提示siRNA821沉默HMGB1 對(duì)以上各蛋白的表達(dá)有抑制作用；與Aβ25-3540 μmol·L-1組相比，siRNA+Aβ25-35組HMGB1，RAGE，TLR4和NF-κB P65的表達(dá)均降低（P＜0.05），而scramble siRNA+Aβ25-35組各蛋白表達(dá)無明顯變化，提示siRNA821沉默HMGB1可特異抑制Aβ25-35誘導(dǎo)的各蛋白表達(dá)的增高（P＜0.05）。

2.6 沉默HMGB1 對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)的HT22 細(xì)胞分泌lL-1β和TNF-α含量的影響

ELISA 結(jié)果（圖6）顯示，與正常對(duì)照組相比，Aβ25-3540 μmol·L-1處理HT22 細(xì)胞24 h 后，Aβ25-3540 μmol·L-1組上清液中IL-1β和TNF-α含量明顯升高（P＜0.05）；與Aβ25-3540 μmol·L-1組相比，Aβ25-35+siRNA 組上清液中IL-1β 和TNF-α 水平明顯下降（P＜0.05），提示siRNA821沉默HMGB1表達(dá)后，可抑制HT22細(xì)胞IL-1β和TNF-α的表達(dá)。

Fig.6 Effect of HMGB1 inhibited by siRNA821 on levels of interleukin-1β（lL-1β）and tumor necrosis factor-α（TNF-α）in culture supernatants of HT22 cells induced by Aβ25-35 by ELlSA. See Fig.5 for the cell treatment.s，n=3.＊P＜0.05，compared with normal control group；#P＜0.05，compared with Aβ23-35 group.

3 討論

海馬區(qū)作為大腦邊緣系統(tǒng)的主要組成部分，參與機(jī)體學(xué)習(xí)、記憶和整合處理外界信號(hào)等重要生理過程。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)雖能模擬AD 的發(fā)病過程，但因?qū)嶒?yàn)受多因素影響，故本研究采用HT22 細(xì)胞。該細(xì)胞來源于小鼠的海馬神經(jīng)元，因具有可長(zhǎng)期連續(xù)傳代、增殖速度快、均一性好、經(jīng)濟(jì)快速便捷、易于轉(zhuǎn)染等優(yōu)勢(shì)，常被神經(jīng)科學(xué)研究用于與海馬相關(guān)的記憶形成和認(rèn)知障礙方面的分子機(jī)制的研究[7]。人工合成Aβ25-35是具有神經(jīng)毒性的氨基酸片段，故經(jīng)常被用來建立AD 模型[8]。本研究中，Aβ25-35在40 μmol·L-1時(shí)刺激小鼠HT22 細(xì)胞，出現(xiàn)細(xì)胞活力下降，且細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，軸突樹突變短，胞體間連接減少，繼而出現(xiàn)細(xì)胞死亡。這模擬了AD 患者腦內(nèi)海馬細(xì)胞的病理生理過程，可以作為有效的AD離體模型用于本研究。

本研究采用免疫熒光雙標(biāo)的方法觀察到，Aβ25-35刺激HT22 細(xì)胞后，HMGB1 從核內(nèi)轉(zhuǎn)移到核外。HMGB1 主要存在于細(xì)胞核內(nèi)，參與維持DNA穩(wěn)定，修復(fù)損傷DNA，在DNA的轉(zhuǎn)錄調(diào)控與自我復(fù)制等過程中起著十分重要的作用，此外HMGB1 還是啟動(dòng)和維持炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵分子，與中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。臨床研究發(fā)現(xiàn)，AD 患者的顳葉皮質(zhì)中，HMGB1 的表達(dá)水平升高[9]，腦室內(nèi)聯(lián)合注射HMGB1和Aβ加劇AD動(dòng)物模型腦內(nèi)神經(jīng)元的死亡并延遲Aβ 從腦中的清除[10]。此外，HMGB1 還與Aβ 形成復(fù)合體，穩(wěn)定Aβ 的低聚體狀態(tài)，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)于Aβ的吞噬作用[9]。這可能是海馬細(xì)胞通過HMGB1 核轉(zhuǎn)位實(shí)現(xiàn)自我修復(fù)的“保護(hù)”作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，Aβ25-35刺激HT22 細(xì)胞后，細(xì)胞上清液中IL-1β 和TNF-α 水平升高，細(xì)胞中HMGB1，RAGE，TLR4 和NF-κB P65 等蛋白的表達(dá)均升高。HMGB1 的下游受體主要是RAGE 和TLR 成員，包括TLR2和TLR4。RAGE在神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞表面均有表達(dá)，Aβ 與RAGE 結(jié)合后可促進(jìn)Aβ 由胞外向胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)，加快Aβ 在腦內(nèi)的沉積，而HMGB1 與RAGE 結(jié) 合 后，下 游P38 和ERK 被 激活，繼而激活NF-κB，從而導(dǎo)致NF-κB 相關(guān)促炎基因的表達(dá)上調(diào)[11]。而HMGB1 和TLR4 結(jié)合后，通過MyD88 依賴性途徑進(jìn)而促使NF-κB 活化，導(dǎo)致大量炎癥因子釋放[12]。故推測(cè)Aβ 可能是通過HMGB1激活了下游NF-κB通路，分子機(jī)制見圖7。

Fig.7 Aβ triggers nuclear HMGB1 release that can contribute to neuroinflammation via HMGB1-RAGE/TLR4-NF-κB signaling pathway.

RNA 干擾技術(shù)（RNA interference，RNAi）已逐漸用于疾病的基因治療，并已取得初步效果，RNAi利用具有同源性的雙鏈RNA 誘導(dǎo)特異序列的目標(biāo)基因沉寂，迅速降低基因活性[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，給予siRNA 沉默HMGB1 表達(dá)，可減少Aβ25-35刺激下HT22 細(xì)胞內(nèi)HMGB1 表達(dá)的升高，同時(shí)也減少了下游RAGE，TLR4和NF-κB P65的表達(dá)，并降低了細(xì)胞上清液中IL-1β和TNF-α的水平。本課題組前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)，RNA 干擾HMGB1 表達(dá)可減少Aβ25-35刺激下BV-2細(xì)胞內(nèi)NF-κB的表達(dá)[14]。這與本團(tuán)隊(duì)近期的研究結(jié)果[5]一致。該研究采用的原代海馬細(xì)胞取自胎鼠海馬組織，盡管原代細(xì)胞更能反映體內(nèi)環(huán)境，但培養(yǎng)困難、不易增殖、不易轉(zhuǎn)染，且極易污染。

本研究將治療策略的重點(diǎn)集中在基因水平上，并大膽地鎖定在HMGB1這個(gè)位點(diǎn)上。這與前期其他學(xué)者研究的蛋白水平方向是一致的。Fujita等[15]研究表明，在AD 大鼠模型上，給予HMGB1 特異性拮抗劑能夠抑制神經(jīng)元退化以及淀粉樣沉淀Aβ 形成，有益于改善大鼠的認(rèn)知功能。Wang 等[16]研究發(fā)現(xiàn)，在糖尿病大鼠缺血再灌注損傷模型上，ip給予HMGB1 拮抗劑能夠逆轉(zhuǎn)炎癥反應(yīng)以及腦損傷程度。特異性抑制HMGB1 表達(dá)在改善神經(jīng)炎癥、改善認(rèn)知功能方面具有一定保護(hù)作用。近年來，抗HMGB1中和抗體、重組A-box蛋白、丙酮酸乙醋和甘草酸苷等天然或合成的小分子HMGB1抑制劑用于HMGB1相關(guān)機(jī)制疾病的研究得到了越來越多的關(guān)注[4]，這些研究是在蛋白水平抑制HMGB1 的表達(dá)，而本研究將治療策略的重點(diǎn)集中在基因水平上。

綜上所述，通過RNA 沉默HMGB1 的表達(dá)，可以降低Aβ25-35刺激下HT22 細(xì)胞內(nèi)炎性蛋白的表達(dá)和炎性因子的分泌。可見HMGB1 在AD 發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用，HMGB1-TLR/RAGE-NF-κB炎癥信號(hào)通路在AD 模型中具有重要地位。HMGB1有可能成為AD診斷中的一個(gè)重要的生物標(biāo)志物以及AD基因治療潛在的生物靶點(diǎn)，為AD的治療提供一種新的思路。然而，將RNAi技術(shù)運(yùn)用到動(dòng)物模型和人體試驗(yàn)中，仍需要進(jìn)一步研究和探索。