銀杏內酯通過抗炎和抗氧化保護缺血再灌注導致的大鼠心肌損傷

劉永強，劉 輝，韓培立，周朝元，崔勤濤

（新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院1.心外科，2.心內科 河南新鄉(xiāng)453100）

心肌缺血再灌注（myocardial ischaemia-reperfusion，MI/R）損傷是冠心病患者手術治療后的嚴重并發(fā)癥之一，可引起心肌細胞大量死亡、心肌組織炎性浸潤及氧化應激等病理現(xiàn)象，嚴重影響手術對冠心病的治療效果。而作為威脅人類生命的一大常見病，每年全球約有70萬人死于冠心病，近年來，我國冠心病發(fā)病率逐年遞增，且患者逐漸低齡化[1-2]。手術再灌注是應對冠心病心肌缺血的主要治療方法，因此，減輕術后MI/R 損傷對改善冠心病患者治療有重大意義。研究表明，MI/R損傷中的炎癥反應及氧化應激可導致心肌組織損傷嚴重，緩解炎癥反應及氧化應激可減輕心臟手術引起的MI/R損傷[3]。而銀杏內酯（bilobalide，BB）具有顯著的抗炎及抗氧化作用。研究發(fā)現(xiàn)，BB 可顯著抑制缺氧引起的脂肪細胞炎癥反應及過氧化氫誘導的黑色素細胞氧化應激，降低胃潰瘍及腦I/R 損傷組織中炎癥因子的表達，減少肥胖患者脂肪組織中氧自由基的產(chǎn)生[4]。有研究發(fā)現(xiàn)，BB 有抑制MI/R 大鼠心肌細胞凋亡的作用[5]，但BB 對MI/R 損傷氧化應激和炎癥反應等影響及作用機制仍不明確，本研究對BB 在MI/R 損傷中的影響及作用機制進行深入探索，為提高冠心病治療效果提供新的選擇。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

BB 購自美國Sigma 公司；伊文思藍購自北京鼎國生物技術公司；肌酸激酶MB型同工酶（creatine kinase MB isoenzyme，CK-MB）和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）檢測試劑盒購自美國Cayman公司；HE染色試劑盒、TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒和DAB 顯色液購自上海碧云天生物公司；兔抗大鼠白細胞介素6（interleukin- 6，IL-6）、Ki67、Bcl-2、Bax、NF-κB P65、NF-κB抑制蛋白（inhibitor of NF-κB，IκBα）和IκBα激酶（IκBα kinase，IKK）多克隆抗體（一抗）購自美國Santa Cruz 公司；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG二抗購自武漢三鷹公司；兔抗大鼠活化的胱天蛋白酶3、NF-E2相關因子2（nuclear transcription factor EF-E2-related factor 2，Nrf2）、血紅素氧合酶（heme oxygenase 1，HO-1）和NAD（P）H醌脫氫酶1〔NAD（P）H quinone dehydrogenase 1，NQO1〕多克隆抗體（一抗）購自美國Abcam 公司；磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH）購自北京中杉金橋生物技術有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、IL-1β、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和IL-10 ELISA試劑盒購自美國Invitrogen公司。

1.2 大鼠、Ml/R模型制備和分組

30只雄性SD大鼠，6～8周齡，體質量180～220 g，合格證號SCXK（京2012-0001），實驗動物許可證SYXK（豫）2018-0005，隨機分為5組，每組6只。大鼠ip給予戊巴比妥鈉麻醉后，氣管連接呼吸機。術前消毒后開縱切口于第三四肋骨間，暴露心臟。正常組大鼠只分離不結扎。結扎大鼠左冠狀動脈前降支，當心肌顏色由紅轉白且心電圖ST段持續(xù)弓背升高時開始記時，持續(xù)30 min后，解除結扎進行再灌注。以心肌由白轉紅且ST段下降為再灌注成功的標準。術后縫合切口。造模成功后1 d，BB與1%羥基纖維素鈉混合后，按照分組分別ig給予等量生理鹽水和BB 2，4和8 mg·kg-1，每日1次，連續(xù)4周。4周后檢測各組大鼠心率（heart rate，HR）。處死大鼠后，收集外周血，分離心臟組織，并將組織進行石蠟包埋，用于后續(xù)檢測。

1.3 心肌梗死面積檢測

取1.2 分組大鼠，結扎大鼠冠狀動脈時注射伊文藍于左心室中，對未心梗死部位進行染色，用于切片觀察。切片于1% TTC 溶液中37℃染色15 min。切片藍染區(qū)為正常心肌組織，未著色區(qū)為缺血梗死心肌組織，蒼白區(qū)為壞死心肌組織。通過Image-Pro Plus 6.0 測量切片中組織總面積及梗死區(qū)面積。心肌梗死面積百分比（%）=梗死區(qū)面積/組織總面積×100%。

1.4 試劑盒檢測血清CK-MB和LDH的濃度

取各組大鼠血液，室溫下靜置30 min后，2500×g離心10 min取上清。按試劑盒說明書進行實驗，用比色法進行測定，得到各組CK-MB及LDH濃度。

1.5 HE染色觀察心肌組織病理變化

將石蠟切片脫蠟后，放入蘇木精染色液中，洗滌后伊紅復染，脫水，封片。其中紫藍色為細胞核，紅色為細胞質及細胞外基質。

1.6 TUNEL檢測心肌細胞凋亡

石蠟切片脫蠟、修復后，利用內源性過氧化物酶封閉液作用5 min。洗滌后滴加TUNEL檢測液，于37℃避光孵育1 h。洗滌后再滴加DAB顯色液進行顯色，蘇木精復染。其中棕色為凋亡細胞，藍色為正常細胞。細胞凋亡率（%）=凋亡細胞數(shù)目/總細胞數(shù)目×100%。

1.7 ELlSA 檢測心肌組織中SOD，GSH-Px活性和MDA含量及血清中l(wèi)L-1β，TNF-α和lL-10濃度

將1.2 各組心肌組織研磨成勻漿，用于檢測SOD，GSH-Px活性和MDA含量。從各組外周血中分離出血清，用于檢測IL-1β，TNF-α 和IL-10 濃度。實驗步驟按Invitrogen試劑盒說明書進行實驗。避光顯色后，通過酶標儀檢測各組樣品吸光度值，按說明書公式計算其濃度。

1.8 免疫組化檢測心肌組織Ki67和lL-6的表達

石蠟切片脫蠟、修復后，滴加一抗稀釋液（1∶1000），4℃孵育過夜。洗滌后滴加對應二抗（1∶2000），室溫靜置45 min，37℃孵育50 min。洗滌后滴加鏈酶蛋白親和素，37℃作用50 min。洗滌后滴加DAB顯色液避光顯色，蘇木精復染。棕色為抗原蛋白陽性細胞，藍色為正常細胞。用陽性細胞率表示Ki67和IL-6的表達。

1.9 Western印跡檢測心肌組織Bax、Bcl-2、活化的胱天蛋白酶3、Nrf2、HO-1、NQO-1、p-lKK、p-lκBα和NF-κB P65蛋白表達水平

RIPA 裂解組織，提取1.2 各組心肌，BCA 試劑盒定量蛋白，調平各組蛋白濃度。取各組蛋白30 mg，10% SDS-PAGE 將蛋白分離，半干轉膜法將蛋白轉移至PVDF 膜上。脫脂奶粉室溫封閉2.5 h，一抗（1∶1000）4℃過夜，二抗（1∶2000）37℃1 h，最后曝光顯色，以GAPDH 為內參。用目標蛋白與內參蛋白積分吸光度值的比值表示蛋白的相對表達水平。

1.10 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 BB對Ml/R 大鼠心肌梗死面積百分比、心率及血清中CK-MB和LDH 濃度的影響

表1和表2結果顯示，與正常對照組相比，MI/R模型組心肌梗死面積百分比顯著升高，大鼠HR 顯著下降，血清中CK-MB 及LDH 濃度顯著升高（P＜0.01）；與MI/R 模型組比較，MI/R 模型+BB 2，4 和8 mg·kg-1組心肌梗死面積百分比顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），HR 顯著升高（P＜0.05，P＜0.01），血清中CK-MB 及LDH 濃度顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。BB可顯著減輕MI/R造成的心肌梗死損傷。

Tab.1 Effect of bilobalide（BB）on myocardial infarction area and heart rate（HR）of myocardial ischemia reperfusion（Ml/R）model rats

2.2 BB對Ml/R 大鼠心肌形態(tài)的影響

正常對照組大鼠心肌組織中，心肌纖維完整，排列整齊，無纖維斷裂及炎性細胞浸潤。MI/R模型組心肌組織中紅細胞明顯增多，心肌纖維結構雜亂，出現(xiàn)心肌纖維斷裂及炎性浸潤現(xiàn)象。與MI/R模型組比較，MI/R 模型+BB 2 mg·kg-1組中紅細胞及炎癥細胞發(fā)生明顯減少；MI/R 模型+BB 4 mg·kg-1組中心肌纖維排列較為規(guī)則，纖維斷裂明顯減少；MI/R模型+BB 8 mg·kg-1組中心肌組織損傷得到顯著緩解，纖維排列規(guī)則，炎癥細胞浸潤明顯減少。表明BB可顯著緩解MI/R造成的心肌組織損傷（圖1）。

Tab.2 Effect of BB on serum content of creatine kinase MB isoenzyme（CK-MB）and lactate dehydrogenase（LDH）of Ml/R model rats

Fig.1 Effect of BB on myocardial morphology in Ml/R model rats（HE staining）. See Tab.1 for the rat treatment.Arrows show the fibers were well arranged and inflammatory cell infiltration was markedly reduced.

2.3 BB對Ml/R 大鼠心肌細胞凋亡的影響

與正常對照組比較，MI/R模型組大鼠心肌細胞凋亡明顯增多，凋亡細胞百分比顯著上升（P＜0.01，圖2）。與MI/R 模型組比較，MI/R 模型+BB 2，4 和8 mg·kg-1組中凋亡細胞明顯減少，凋亡細胞百分比顯著下降（P＜0.05，P＜0.01）。表明BB 可顯著降低MI/R引起的心肌細胞凋亡。

Fig.2 Effect of BB on apoptosis of myocardiocytes of Ml/R model rats（TUNEL staining）. See Tab.1 for the rat treatment. Arrows show the apoptotic cells. ±s，n=6. ＊＊P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with MI/R model group.

2.4 BB 對Ml/R 大鼠心肌組織中SOD，GSH-Px 活性和MDA濃度的影響

與正常對照組比較，MI/R模型組大鼠心肌組織中SOD 及GSH-Px 活性顯著降低（P＜0.01），MDA濃度顯著升高（P＜0.01）。與MI/R模型組比較，MI/R模型+BB 2，4和8 mg·kg-1組中SOD及GSH-Px活性顯著升高（P＜0.05，P＜0.01），MDA濃度顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。表明BB可顯著減弱MI/R造成的自由基氧化損傷（表3）。

2.5 BB 對Ml/R 大鼠血清lL-1β，TNF-α 和lL-10 水平的影響

與正常對照組比較，MI/R模型組大鼠外周血中IL-1β，TNF-α 和IL-10 水平顯著升高（P＜0.01）。與MI/R模型組比較，MI/R模型+BB 2，4和8 mg·kg-1組中IL-1β 和TNF-α 濃度顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），IL-10 濃度顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）。表明BB可顯著改善MI/R導致的炎癥反應（表4）。

Tab.3 Effect of BB on activities of superoxide dismutase（SOD），glutathione peroxidase（GSH-Px）and malondialdehyde（MDA）in myocardial tissue of Ml/R model rats

See Tab.1 for the rat treatment. s，n=6. ＊＊P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with MI/R model group.

Tab.4 Effect of BB on serum interleukin-1β（lL-1β），tumor necrosis factor-α（TNF-α）and lL-10 of Ml/R model rats

2.6 BB 對Ml/R 大鼠心肌組織Ki67 和lL-6 表達水平的影響

與正常對照組比較，MI/R模型組大鼠心肌組織中Ki67和IL-6表達顯著增多，Ki67和IL-6陽性細胞百分比顯著上升（P＜0.01，圖3）。與MI/R模型組比較，MI/R 模型+BB 2，4 和8 mg·kg-1組中Ki67 表達顯著增多，Ki67陽性細胞百分比顯著上升（P＜0.05，P＜0.01），而IL-6表達顯著減少，IL-6陽性細胞百分比顯著降低（P＜0.05，P＜0.01，圖3）。

2.7 BB 對Ml/R 大鼠心肌組織Bcl-2、Bax 和活化的胱天蛋白酶3表達水平的影響

Fig.3 Effect of BB on expression levels of Ki67（A1，A2）and lL-6（B1，B2）in myocardial tissue in Ml/R model rats detected by immunohistochemistry. See Tab.1 for the rat treatment. Arrows show the positive cells. A2 and B2 was the semi-quantitative result of A1 and B1，respectively.±s，n=6. ＊＊P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，##P＜0.01 compared with MI/R model group.

與正常對照組比較，MI/R模型組大鼠心肌組織中Bcl-2的表達顯著減少，Bax和活化的胱天蛋白3的表達顯著增多（P＜0.01，圖4）。與MI/R模型組比較，MI/R模型+BB 2，4和8 mg·kg-1組中Bcl-2的表達顯著增多，Bax 和活化的胱天蛋白酶3 的表達顯著減少（P＜0.05，P＜0.01，圖4）。表明MI/R 可顯著促進心肌組織細胞凋亡，BB 可顯著抑制MI/R 引起的細胞凋亡。

2.8 BB 對Ml/R 大鼠心肌組織中Nrf2，HO-1 和NQO1蛋白表達的影響

與正常對照組比較，MI/R模型組大鼠心肌組織中Nrf2，HO-1 和NQO1 的表達顯著降低（P＜0.01，圖5）。與MI/R 模型組比較，MI/R 模型+BB 2，4 和8 mg·kg-1組中Nrf2，HO-1 和NQO1 的表達顯著增加（P＜0.05，P＜0.01，圖6）。實驗結果表明，MI/R可激活Nrf2 信號通路，BB 可通過促進Nrf2，HO-1 和NQO1表達提高心肌組織對氧化應激的抵抗能力。

2.9 BB Ml/R 對大鼠心肌組織中p-lKK，p-lκBα 和NF-κB P65蛋白表達的影響

與正常對照組比較，MI/R模型組大鼠心肌組織中p-IKK、p-IκBα 和NF-κB P65 表達顯著升高（P＜0.01，圖6）。與MI/R 模型組比較，MI/R 模型+BB 2 mg·kg-1組中p-IKK 及NF-κB P65 表達顯著降低（P＜0.05，圖6），p-IκBα 表達無顯著差異；BB 4 和8 mg·kg-1組中p-IKK、p-IκBα和NF-κB P65表達顯著均顯著降低（P＜0.01，圖6）。實驗結果表明，MI/R可激活心肌組織中的NF-κB 信號通路，BB 可顯著抑制MI/R對NF-κB信號通路的激活作用。

Fig.4 Effect of BB on expressions of Bcl-2，Bax and cleaved-caspase 3 in myocardial tissue of Ml/R model rats detected by Western blotting. See Tab.1 for the rat treatment. B was the semi-quantitative result of A. x±s，n=6. ＊＊P＜0.01 compared with normal control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with MI/R model group.

Fig.5 Effect of BB on expressions of nuclear factor erythroid 2-related factor 2（Nrf2），heme oxygenasae 1（HO-1）and NAD（P）H：quinone oxidoreductase（NQO1）in rat myocardial tissue of Ml/R model rats detected by Western blotting. See Tab.1 for the rat treatment. B was the semi-quantitative result of A.s，n=6. ＊＊P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with MI/R model group.

Fig.6 Effect of BB on expressions of phosphorylated inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase（p-lKK），phosphorylated inhibitor of NF-κB kinase α（p-lκBα）and NF-κB P65 in myocardial tissue of Ml/R model rat detected by Western blotting. See Tab.1 for the rat treatment. B was the semi-quantitative result of A.±s，n=6. ＊＊P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with MI/R model group.

3 討論

本研究結果顯示，BB 可減小MI/R 模型大鼠心肌梗死面積百分比，降低大鼠外周血中CK-MB 和LDH濃度，提高大鼠心率，減輕心肌組織損傷程度。且隨著用藥濃度由2 mg·kg-1遞增至8 mg·kg-1，BB對MI/R 大鼠的保護作用愈顯著。心肌組織損傷程度降低、心肌梗死面積減小表示MI/R病情得到顯著改善。前人研究顯示，BB 可降低局灶性腦缺血模型的腦梗死面積，減輕腦組織損傷[7]。另外有研究顯示，BB 可降低一氧化氮誘導的大鼠腎上腺髓質PC12 細胞中LDH 的含量[8]。當細胞受到損傷，通透性升高時，LDH被由胞質釋放到細胞外。CK-MB和LDH 是檢測人類心臟疾病的經(jīng)典生物標志物，CK-MB 和LDH 在血液中的濃度越高，表明心肌細胞損傷越嚴重。

本研究結果顯示，BB 可升高MI/R 模型大鼠心肌組織中的Ki67 陽性細胞百分比和Bcl-2 表達，降低凋亡細胞百分比及Bax和活化的胱天蛋白酶3表達，隨BB用藥濃度的升高，其產(chǎn)生的抗凋亡促存活作用愈顯著。Bcl-2 與Bax 的比值作為檢測細胞凋亡的常用指標，Bcl-2/Bax 比值增加從側面體現(xiàn)BB抑制心肌細胞凋亡。在MI/R中，心肌細胞凋亡水平顯著升高，導致收縮細胞喪失及心肌細胞代償性肥大，從而進一步促使MI/R 病情惡化。因此，有效抑制心肌細胞凋亡和增加細胞存活可阻止MI/R 的發(fā)展。前人研究顯示，BB 可抑制某些細胞凋亡的發(fā)生，如在帕金森病，BB可抑制α-合成核蛋白聚集體誘導的神經(jīng)元細胞凋亡[9]；在中毒性肝損傷中，BB可阻礙馬纓丹烯誘導豚鼠肝細胞凋亡的發(fā)生[10]。

本研究結果顯示，BB 可降低MI/R 模型大鼠外周血中的IL-1β和TNF-α濃度及心肌組織中的IL-6陽性細胞百分比，升高外周血中IL-10的濃度，且隨BB 用藥濃度的升高，其產(chǎn)生的抗炎作用越明顯。研究顯示，BB 能顯著降低乙醇誘導的胃潰瘍模型大鼠胃組織中IL-6，IL-1β及TNF-α的水平[5]。IL-6，IL-1β 和TNF-α 等促炎癥因子，能促進心肌組織炎性浸潤，刺激其他炎癥因子的表達，加劇心肌炎癥的反應[11]。IL-10 是一種抗炎癥因子，能抑制心肌組織炎癥反應的過度發(fā)生[12]。

本研究結果顯示，BB 可抑制MI/R 模型大鼠心肌組織中p-IKK，p-IκBα和NF-κB P65的表達，且隨BB 用藥劑量增加，其對NF-κB 活化的抑制作用越明顯。據(jù)報道，BB 可顯著抑制脂肪細胞、胃黏膜細胞、神經(jīng)元細胞和巨噬細胞中NF-κB的激活[13]。而在MI/R中，NF-κB被高度激活并顯著促進炎癥反應的發(fā)生，抑制NF-κB激活可顯著減輕心肌組織中的炎癥反應[14]。

本研究結果顯示，BB 可使MI/R 模型大鼠心肌組織中SOD 和GSH-Px 活性升高，而MDA 濃度顯著降低。前人研究顯示，銀杏葉中提取的類黃酮成分可通過清除氧自由基緩解MI/R 造成的組織損傷[16]。SOD 及GSH-Px 是清除氧自由基的主要酶類，可保護機體細胞膜結構完整，MDA是氧自由基與細胞膜脂質的氧化產(chǎn)物，其濃度越高表示組織氧化損傷越嚴重，可作為評估氧化應激水平的指標[17]。

本研究發(fā)現(xiàn)，BB 可顯著提高MI/R 模型大鼠心肌組織中Nrf2，HO-1 和NQO1 的表達。有研究顯示，在神經(jīng)元細胞中，BB可通過激活細胞Nrf2/HO-1信號通路預防氧化應激對神經(jīng)元的損傷[18]。Nrf2/HO-1 信號通路是經(jīng)典的抗氧化通路之一，過度激活Nrf2/HO-1 信號通路可顯著減輕MI/R 造成的組織損傷[19]。HO-1 及NQO1 是重要的抗氧化蛋白，當機體發(fā)生氧化應激時，Nrf2蛋白被激活并進入細胞核，作為受Nrf2調控的靶蛋白，HO-1及NQO1在Nrf2入核后大量產(chǎn)生，并通過自身的抗氧化作用對組織器官進行保護[20]。

綜上所述，BB 可顯著減輕MI/R 引起的心肌組織損傷，降低MI/R模型大鼠心肌組織中的細胞凋亡水平，抑制心肌組織炎癥反應和氧化應激反應，其作用機制可能與抑制NF-κB的活性，誘導Nrf2信號通路激活相關。