大孔樹(shù)脂純化桑葚渣中α-淀粉酶抑制劑的工藝優(yōu)化及其活性成分研究

范 銘，向 露，徐文慧，曹 艷，劉 哲，陸勝民，，*

(1.浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江 金華 321004； 2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 食品科學(xué)研究所，浙江省果蔬保鮮與加工技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部果品采后處理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310021)

糖尿病是一種因胰島素分泌不足或胰島素作用障礙而引起的代謝疾病，其最主要特征是碳水化合物、脂肪和蛋白質(zhì)代謝紊亂，導(dǎo)致機(jī)體長(zhǎng)期處于高血糖狀態(tài)[1]。近幾年，全世界的糖尿病發(fā)病率呈現(xiàn)持續(xù)上升趨勢(shì)，糖尿病現(xiàn)已成為世界第3大嚴(yán)重威脅人類健康的非傳染病[2-3]。糖尿病分為Ⅰ型糖尿病和Ⅱ型糖尿病，Ⅱ型糖尿病占糖尿病患者的90%以上。對(duì)于Ⅱ型糖尿病患者，餐后高血糖的危害遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)空腹高血糖，通過(guò)使用α-淀粉酶抑制劑來(lái)降低餐后血糖是治療Ⅱ型糖尿病的重要手段；因此，研究開(kāi)發(fā)α-淀粉酶抑制劑已成為近年來(lái)藥物研究的熱點(diǎn)[4-5]。

α-淀粉酶抑制劑屬于糖(苷)水解酶抑制劑中的一種，它能有效地抑制腸道內(nèi)唾液及胰淀粉酶的活性，阻礙食物中碳水化合物的水解和消化，減少糖分的攝取，降低血糖和血脂含量。因此，α-淀粉酶抑制劑可以作為防治肥胖癥、脂肪過(guò)多癥、動(dòng)脈硬化癥、高血脂及糖尿病等的有效藥物。

桑葚屬于桑科，被列入藥食同源名錄，鮮果味道甜美、多汁，且營(yíng)養(yǎng)豐富。大量研究表明，桑葚提取物在降血糖、增強(qiáng)免疫、降血脂、抗氧化、抗腫瘤等方面有顯著作用[6-7]。目前以桑葚為原料的產(chǎn)品，大多以酒、飲料之類的形式生產(chǎn)，榨汁后的桑葚渣則被丟棄，這樣既污染環(huán)境又浪費(fèi)資源。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，桑葚渣具有降血糖的功效[8]。本文以去離子水超聲輔助提取桑葚渣中α-淀粉酶抑制劑，對(duì)其分離純化方法進(jìn)行優(yōu)化，并研究其成分，旨在為探明桑葚中的降糖成分、開(kāi)發(fā)降糖食品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

桑葚品種為大十，采摘于浙江省安吉縣梅溪鎮(zhèn)馬村桑葚基地。

主要儀器設(shè)備：DHG-9146A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；SCIENTZ-18N冷凍干燥機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；BJ-300多功能粉碎機(jī)，德清拜杰電器有限公司；Waters 1525高效液相色譜儀，沃特世科技(上海)有限公司；BSA1245-CW電子天平(精確至0.000 1 g)，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；KQ-500DB型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；LXJ-ⅡB型離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；UV-1800紫外分光光度計(jì)，日本島津公司；層析柱，上海夏美生物科技有限公司。

主要試劑：可溶性淀粉、氯化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、碳酸鈉，購(gòu)于上海國(guó)藥集團(tuán)；二甲基亞砜，購(gòu)于上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；α-淀粉酶(豬胰腺淀粉酶)，購(gòu)于Sigma公司；阿卡波糖、槲皮苷、異槲皮素、金絲桃苷，均為分析純標(biāo)準(zhǔn)品(純度均≥98%)，購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司；樹(shù)脂AB-8、S-8、D101、NKA-9和HZ-806，均購(gòu)于鄭州勤實(shí)科技有限公司。

1.2 桑葚渣中降糖物質(zhì)提取

稱取熱風(fēng)干燥后的桑葚渣粉5 g，按1∶10的料液質(zhì)量比加入去離子水，充分混勻后，在超聲溫度為60 ℃、超聲功率為500 W的條件下超聲提取1 h。超聲提取結(jié)束后，4 000 r·min-1離心10 min，取上清液，即得桑葚渣提取原液。將提取原液在50 ℃條件下減壓濃縮至一定體積，然后在阱溫度-40 ℃左右、真空度0.025 MPa條件下冷凍干燥72 h，之后用蒸餾水配成一定的濃度。體外測(cè)定提取液對(duì)α-淀粉酶活性的抑制率，作為反映提取液降糖效果的指標(biāo)。

1.3 大孔樹(shù)脂型號(hào)篩選

本試驗(yàn)選用的大孔樹(shù)脂有AB-8、S-8、D101、NKA-9、HZ-806，它們的型號(hào)及物理性質(zhì)如表1所示。以對(duì)α-淀粉酶活性的抑制率為指標(biāo)，考查各樹(shù)脂對(duì)提取液中降糖物質(zhì)的分離效果。大孔樹(shù)脂在使用前需經(jīng)過(guò)預(yù)處理，具體操作步驟見(jiàn)參考文獻(xiàn)[9]。稱取5 g已活化的濕大孔樹(shù)脂放入同一規(guī)格的錐形瓶中，量取25 mg·mL-1的桑葚粗提液20 mL于三角瓶中，放入搖床，25 ℃振蕩6 h，過(guò)濾，取濾液，測(cè)定其對(duì)α-淀粉酶活性的抑制率。水洗濾出的飽和樹(shù)脂除去其表面的殘留溶液，吸干表面水分，精確加入70%(體積分?jǐn)?shù))乙醇溶液20 mL振蕩6 h，濾出解吸液，濃縮后凍干，測(cè)定吸附前后的α-淀粉酶抑制活性，根據(jù)活性物質(zhì)吸附及解吸率選擇出適宜的大孔樹(shù)脂。

表1 供試樹(shù)脂的物理參數(shù)

Table 1 Physical parameters of resins

樹(shù)脂Resin極性Polarity粒徑Particle size/mm比表面積Specific surface area/(m2·g-1)外觀色澤AppearanceD101非極性Nonpolarity0.30～1.25550乳白色或淺黃色Milky or light yellowAB-8弱極性Weak polarity0.30～1.25480乳白色或淺黃色Milky or light yellowHZ-806中極性Middle polarity 0.315～1.25—乳白色至淡藍(lán)色Milky to light blueS-8極性Polarity0.315～1.25100～120乳白色MilkyNKA-9極性Polarity0.30～1.25250～290乳白色Milky

1.4 大孔樹(shù)脂吸附體系優(yōu)化

將預(yù)處理好的選定的大孔樹(shù)脂用濕法裝入內(nèi)徑2.4 cm、體積700 mL的層析柱中，加入一定體積的桑葚渣水提液，選定上樣流速，靜置一段時(shí)間，測(cè)定流出液對(duì)α-淀粉酶的抑制率，確定吸附效果。之后以一定體積的去離子水沖洗柱子，將糖類等雜質(zhì)沖出，隨即用乙醇溶液進(jìn)行洗脫，將流出液濃縮、凍干，測(cè)定其對(duì)α-淀粉酶活性的抑制率。

1.4.1 上樣流速的選擇

將大孔樹(shù)脂填裝入內(nèi)徑為2.4 cm的層析柱中，將一定體積的桑葚渣水提液按12、24、36、48 mL·min-1的速度經(jīng)過(guò)層析柱，將流出液分別濃縮、凍干，測(cè)定其對(duì)α-淀粉酶活性的抑制率，從而得到最適上樣流速。

1.4.2 洗脫劑體積分?jǐn)?shù)的選擇

將一定體積的桑葚渣水提液以一定流速上柱，靜置一段時(shí)間后，用水洗脫，再依次用相同體積的體積分?jǐn)?shù)分別為10%、30%、50%、70%、90%的乙醇溶液洗脫，將各洗脫液濃縮、凍干，測(cè)定其對(duì)α-淀粉酶活性的抑制率，從而得到最適洗脫劑體積分?jǐn)?shù)。

1.4.3 洗脫劑流速的選擇

一般來(lái)說(shuō)，選擇合適的洗脫速度可以達(dá)到洗脫較完全且耗時(shí)較短的效果[10]。填充大孔樹(shù)脂后，加入一定體積的桑葚渣水提液，待其全部進(jìn)入層析柱后將閥門關(guān)上，吸附一定時(shí)間，將吸附好的樹(shù)脂用70%(體積分?jǐn)?shù))乙醇分別以12、24、36、48 mL·min-1的流速進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，測(cè)定其對(duì)α-淀粉酶活性的抑制率，從而得到最佳洗脫流速。

1.5 α-淀粉酶活性抑制體系

取50 μL α-淀粉酶(2 U·mL-1)和一定濃度的抑制劑25 μL，在37 ℃孵化10 min，加入0.75%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))可溶性淀粉溶液1 mL，37 ℃反應(yīng)5 min，加入1 mL DNS試劑，沸水浴5 min，迅速冷卻后用蒸餾水稀釋2.5倍，在540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值[11-12]。如上分別構(gòu)建空白管、空白對(duì)照管、抑制劑管和背景對(duì)照管的反應(yīng)體系，其中：空白管中不加抑制劑，空白對(duì)照管不加α-淀粉酶和抑制劑，背景對(duì)照管不加α-淀粉酶。設(shè)空白管、空白對(duì)照管、抑制劑管和背景對(duì)照管在540 nm處測(cè)得的吸光值分別用A、B、C、D表示，則該抑制劑對(duì)α-淀粉酶活性的抑制率(I)為

(1)

1.6 洗脫液的液相檢測(cè)

1.6.1 供試品和對(duì)照品制備

在最佳吸附條件下，用不同體積分?jǐn)?shù)(10%、30%、50%、70%、90%)的乙醇溶液或去離子水進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，經(jīng)冷凍干燥，得到樣品，用色譜級(jí)甲醇進(jìn)行溶解，統(tǒng)一配置成25 mg·mL-1的質(zhì)量濃度，經(jīng)過(guò)0.45 μm膜過(guò)濾器過(guò)濾，取濾液作為供試品溶液。

將槲皮苷、異槲皮苷、金絲桃苷準(zhǔn)確配制成質(zhì)量濃度為4、6、8、10、25、30 mg·mL-1的色譜級(jí)甲醇溶液，經(jīng)過(guò)0.45 μm膜過(guò)濾器過(guò)濾，取濾液作為對(duì)照樣品溶液[13]。

1.6.2 色譜條件

采用Sunfire C18液相色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相A為甲醇-水-冰醋酸(體積比5∶95∶0.1)溶液，流動(dòng)相B為甲醇-冰醋酸(體積比100∶0.1)溶液。洗脫梯度見(jiàn)表2，流速1 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm，柱溫40 ℃，進(jìn)樣量10 μL[14]。

1.7 數(shù)據(jù)處理與分析

所有試驗(yàn)重復(fù)3次。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2010軟件進(jìn)行整理，在SPSS 17.0軟件平臺(tái)上進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 大孔樹(shù)脂的選擇

經(jīng)測(cè)定，在經(jīng)過(guò)大孔樹(shù)脂吸附、解吸前，制備的桑葚渣水提液對(duì)α-淀粉酶活性的抑制率為(62.52±0.67)%，由于不同樹(shù)脂的靜態(tài)吸附-解吸性能相差較大，經(jīng)大孔樹(shù)脂吸附和解吸后，其流出液對(duì)α-淀粉酶活性的抑制率呈現(xiàn)出較大區(qū)別(表3)。樹(shù)脂吸附后流出液對(duì)α-淀粉酶活性的抑制率越高，說(shuō)明樹(shù)脂吸附效果越差。由此可知，在吸附性能方面，AB-8效果最好，HZ-806次之，D101效果最差。解吸后流出液對(duì)α-淀粉酶活性的抑制率越大，說(shuō)明樹(shù)脂解吸效果好。由此可知，在解吸性能方面，同樣以AB-8的效果最好。綜上，AB-8樹(shù)脂對(duì)桑葚渣水提液中α-淀粉酶抑制劑的吸附、解吸效果均較好[15]，適用于桑葚渣中α-淀粉酶抑制劑的分離純化。

2.2 上樣流速的選擇

經(jīng)測(cè)定，上樣前樣品對(duì)α-淀粉酶活性的抑制率為(58.16±0.22)%。采用不同的上樣流速進(jìn)行吸附后，流出液對(duì)α-淀粉酶的抑制率如表4所示?？梢钥闯?，隨著上樣流速增大，樹(shù)脂吸附后流出液對(duì)α-淀粉酶的抑制率不斷升高，說(shuō)明在本試驗(yàn)條件下，增加上樣流速不利于樹(shù)脂吸附桑葚渣提取液中的α-淀粉酶抑制劑。一般情況下，物料流過(guò)樹(shù)脂的速度越慢，越有利于樹(shù)脂的吸附，吸附效果越優(yōu)良；但是速率過(guò)慢，會(huì)導(dǎo)致吸附效率不高[16]，不利于生產(chǎn)投入。綜合考慮樹(shù)脂的吸附效果及工作效益，確定上樣流速為12 mL·min-1。

表2 洗脫梯度

Table 2 Elution gradient

t/minA/%B/%0100051000305050403070452080490100511000

表3 不同大孔樹(shù)脂對(duì)桑葚渣水提液中α-淀粉酶抑制劑的靜態(tài)吸附和解吸性能

Table 3 Adsorption-desorption capacity of 5 types of macroporous resins on alpha-amylase inhibitor of from mulberry pomace extracts

樹(shù)脂類型Resintype吸附后流出液的α-淀粉酶活性抑制率 Inhibitionrate of α-amylase activity ineffluent after adsorp-tion/%解吸后流出液的α-淀粉酶活性抑制率 Inhibitionrate of α-amylase activity ineffluent after desorption/%AB-80.74±0.2186.36±3.53S-840.13±2.6718.63±4.25NKA-922.70±3.3352.72±4.31HZ-80620.29±1.7448.66±2.97D10171.12±2.897.63±1.62

表4 不同上樣流速下流出液對(duì)α-淀粉酶活性的抑制率

Table 4 Inhibition rate of α-amylase activity by effluent under different sampling rates

流速Current speed/(mL·min-1)α-淀粉酶活性抑制率 Inhibitoryrate of α-amylase activity/%126.41±1.832416.74±2.813625.66±3.644826.12±2.19

2.3 洗脫劑體積分?jǐn)?shù)的選擇

由圖1可知，洗脫液體積分?jǐn)?shù)顯著(P<0.05)影響洗脫液對(duì)α-淀粉酶活性的抑制效果。當(dāng)乙醇的體積分?jǐn)?shù)為0～30%時(shí)，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增加，流出液對(duì)α-淀粉酶活性的抑制率顯著(P<0.05)降低，說(shuō)明洗脫劑的解吸效果減弱；當(dāng)乙醇的體積分?jǐn)?shù)為30%～70%時(shí)，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增加，洗脫液對(duì)α-淀粉酶活性的抑制率顯著(P<0.05)增加，說(shuō)明洗脫劑的解吸效果增強(qiáng)；但當(dāng)乙醇的體積分?jǐn)?shù)進(jìn)一步由70%增加至90%時(shí)，洗脫液對(duì)α-淀粉酶活性的抑制率顯著(P<0.05)下降。由于所選定的樹(shù)脂為弱極性，根據(jù)相似相溶原理，α-淀粉酶抑制劑易被極性較弱的乙醇洗脫下來(lái)，但乙醇體積分?jǐn)?shù)過(guò)高則會(huì)使醇溶性雜質(zhì)增多，導(dǎo)致解吸效果差。綜合試驗(yàn)結(jié)果，確定最適洗脫劑為體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇。

2.4 洗脫劑流速的選擇

由圖2可知，隨著洗脫劑流速增加，洗脫液對(duì)α-淀粉酶活性的抑制率先增加后下降，說(shuō)明洗脫速度過(guò)快并不利于物質(zhì)解吸。當(dāng)流速為24 mL·min-1時(shí)，洗脫液對(duì)α-淀粉酶活性的抑制率最高，且顯著(P<0.05)高于其他處理，因此選擇24 mL·min-1作為最適洗脫劑流速。

2.5 洗脫液的液相色譜分析結(jié)果

以前述選擇的最佳上樣速度，將吸附好的樹(shù)脂以不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液(10%、30%、50%、70%、90%)和去離子水按最佳的洗脫速度進(jìn)行洗脫，收集各洗脫液，濃縮、冷凍干燥，分別配制成統(tǒng)一質(zhì)量濃度的洗脫液。其中，70%乙醇洗脫液對(duì)α-淀粉酶活性的抑制率為86.13%，其半抑制質(zhì)量濃度(IC50)為(8.16±0.26)mg·mL-1，阿卡波糖和標(biāo)準(zhǔn)品槲皮苷對(duì)α-淀粉酶活性的IC50分別為(1.04±0.06)、(3.39±0.56)mg·mL-1。各洗脫液的液相色譜檢測(cè)結(jié)果如圖3所示。

柱上無(wú)相同字母的表示處理間差異顯著(P<0.05)。下同。Barks marked without the same letters indicated significant difference at P<0.05. The same as below.圖1 洗脫劑體積分?jǐn)?shù)對(duì)洗脫液α-淀粉酶活性抑制效果的影響Fig.1 Effect of desorption solution concentration on α-amylase activity inhibitory rate of eluent

圖2 洗脫劑流速對(duì)洗脫液α-淀粉酶活性抑制效果的影響Fig.2 Effect of desorption rate on α-amylase activity inhibitory rate of eluent

由圖3可以看出，去離子水、10%乙醇洗脫液中成分較少，可能只有多糖被洗出[17]。體積分?jǐn)?shù)為50%～90%的乙醇洗脫液中出現(xiàn)異槲皮苷和槲皮苷。異槲皮苷含量在50%乙醇洗脫液中最高，隨乙醇體積分?jǐn)?shù)升高，乙醇洗脫液中異槲皮苷的含量逐漸減少，其質(zhì)量濃度分別為26.08、24.33、15.03 mg·mL-1。槲皮苷在體積分?jǐn)?shù)為50%、70%、90%的乙醇洗脫液中的質(zhì)量濃度為分別為4.17、7.06、3.92 mg·mL-1。金絲桃苷在各洗脫液中均未出現(xiàn)。前述試驗(yàn)結(jié)果顯示，50%、70%、90%乙醇洗脫液對(duì)α-淀粉酶活性的抑制率分別為40.42%、79.93%、35.71%，與槲皮苷在洗脫液中的質(zhì)量濃度變化規(guī)律一致；另?yè)?jù)文獻(xiàn)報(bào)道，槲皮苷具有降血糖的功效[18]。由此推測(cè)，槲皮苷可能是桑葚渣提取液中α-淀粉酶抑制劑的主要貢獻(xiàn)因子。

3 小結(jié)與討論

通過(guò)對(duì)比5種大孔樹(shù)脂對(duì)桑葚渣提取液中α-淀粉酶抑制劑的吸附-解吸情況，確定AB-8為最適用的大孔樹(shù)脂。在分離純化桑葚渣水提液中α-淀粉酶抑制劑時(shí)，其動(dòng)態(tài)吸附和解吸的最佳工藝參數(shù)如下：上樣流速12 mL·min-1，洗脫劑為70%(體積分?jǐn)?shù))乙醇溶液，洗脫流速24 mL·min-1。在最佳吸附和解吸條件下，對(duì)不同體積分?jǐn)?shù)乙醇洗脫液中的成分進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)洗脫液中槲皮苷的質(zhì)量濃度與洗脫液對(duì)α-淀粉酶活性的抑制率呈現(xiàn)相似規(guī)律，推測(cè)槲皮苷可能是桑葚渣水提物中α-淀粉酶抑制活性的主要貢獻(xiàn)因子。

據(jù)測(cè)定，阿卡波糖、70%乙醇洗脫液、標(biāo)準(zhǔn)品槲皮苷對(duì)α-淀粉酶活性的IC50分別為(1.04±0.06)、(8.16±0.26)、(3.39±0.56)mg·mL-1。單就對(duì)α-淀粉酶活性的抑制效果而言，阿卡波糖最優(yōu)，其次為槲皮苷標(biāo)準(zhǔn)品，洗脫液效果最差。這可能是由于洗脫液中還含有其他雜質(zhì)，導(dǎo)致其對(duì)α-淀粉酶活性的抑制率降低。目前，有關(guān)植物中槲皮苷降血糖功效的文獻(xiàn)甚少。本研究結(jié)果可為從植物中提取α-淀粉酶抑制劑等相關(guān)研究提供參考，也為探索桑葚渣的資源化利用提供了新的思考方向。

A，去離子水洗脫液；B，10%乙醇洗脫液；C，30%乙醇洗脫液；D，50%乙醇洗脫液；E，70%乙醇洗脫液；F，90%乙醇洗脫液；G，標(biāo)準(zhǔn)品。A， Deionized water eluent; B， 10% ethanol eluent; C， 30% ethanol eluent; D， 50% ethanol eluent; E， 70% ethanol eluent; F， 90% ethanol eluent; G， Standard materials.圖3 各洗脫液的液相色譜成分分析Fig.3 High performance liquid chromatography analysis on compositions of eluents