馬鈴薯茄鐮孢菌干腐病生防菌株的篩選、鑒定及其防效

劉治會，郝蓉蓉，許永鋒，楊成德，*，張俊蓮

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護學(xué)院/甘肅省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程實驗室，甘肅 蘭州 730070； 2.甘肅省張掖市植保植檢站，甘肅 張掖 734000； 3.甘肅省作物遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新重點實驗室，甘肅 蘭州730070)

馬鈴薯是重要的糧菜兼用型作物，也是優(yōu)良的飼料作物，是僅次于水稻、小麥、玉米的第四大糧食作物[1]。甘肅省是我國馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)之一，干腐病是馬鈴薯貯藏期最常見的真菌性病害，嚴(yán)重影響馬鈴薯的經(jīng)濟價值和食用價值，常年發(fā)病率為10%～30%，最高達60%[2-4]。茄鐮孢菌(Fusariumsolani)是甘肅省馬鈴薯干腐病優(yōu)勢病原菌。侵染塊莖后，初期薯塊表面出現(xiàn)黑褐色凹陷病斑，隨后擴大形成較多輪紋狀褶皺；后期薯塊內(nèi)部變空，干燥時內(nèi)部長滿白色菌絲，整個薯塊變硬、變輕、干縮，呈灰褐色或深褐色，濕度大時發(fā)病部位變紅呈糊狀[5]。

目前，對馬鈴薯干腐病以化學(xué)防治為主，常用藥劑有戊唑福美雙、代森錳鋅、戊唑醇、咯菌腈和噻菌靈等殺菌劑，控制效果較好，但容易誘導(dǎo)病原物產(chǎn)生耐藥性、農(nóng)藥殘留和環(huán)境污染等問題[6-7]。生物防治是指利用生物及其代謝所產(chǎn)生的產(chǎn)物來防治植物病蟲害的一種方法，具有無毒、無害、無污染和不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點[8-9]。國內(nèi)外眾多實驗室已經(jīng)開始大量篩選、保存可以有效抑制植物病原的生防菌株[10-11]；王瑞霞等[12]分離得到對馬鈴薯環(huán)腐病菌(Clavibactermichiganensissubsp.sepedonicum)具有較強拮抗作用的內(nèi)生細菌P1；暢濤等[13]發(fā)現(xiàn)，莫海威芽孢桿菌(Bacillusmojavensis)ZA1對馬鈴薯壞疽病菌具有明顯的抑制作用，且對馬鈴薯貯藏期的多種病原具有較好的抑制作用；關(guān)小敏等[14]從馬鈴薯根際土壤中篩選獲得能有效抑制馬鈴薯立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)的菌株G1。我國對馬鈴薯干腐病的系統(tǒng)性研究及報道較多，對其在甘肅地區(qū)的發(fā)生、分布、流行和致病菌的種類等也有較多報道。但是，有關(guān)馬鈴薯干腐病生物防治方面的報道較少，僅陳書珍等[15]發(fā)現(xiàn)生物農(nóng)藥枯草芽孢桿菌B2對馬鈴薯窖藏干腐病具有較強的抑菌防病作用。因此，本試驗以甘肅省馬鈴薯干腐病優(yōu)勢病原茄鐮孢菌(F.solani)為指示菌，從120株內(nèi)生細菌中篩選拮抗菌，并進行了防效試驗，以期為甘肅省馬鈴薯干腐病的生物防治提供菌種資源和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試病原菌：從甘肅省馬鈴薯上分離獲得的干腐病原菌——茄鐮孢菌QF-4(F.solani)。

供試拮抗細菌：262AG6、B3、YO-71、264ZY10、XSG3、G2、e、O10、261AG3、FQ1、S27、B6、G5、YO-57、264AY3、S21、O55、O56、O61、S26、b、Y0、d、261AY7、261AY2、262AY6、O50、O27、B3、O16、O22、ZMG1、ZMG3、261ZG8、263ZG9、262XG5、265ZY1、265ZY3、265XY6、263XY1、267GG1、267GG2、263ZG7、265ZG8、263XG9、262XG7、QL-1、B6、O44和S30等120株，以上菌株均由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院植物病原細菌及細菌多樣性實驗室提供。

培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基、NA培養(yǎng)基、NB培養(yǎng)液，配方詳見參考文獻[16]。

供試藥劑：70%甲基硫菌靈可濕性粉劑(陜西美邦農(nóng)藥有限公司)；枯草芽孢桿菌可濕性粉劑(德強生物股份有限公司)；265ZY1、265ZY3和265XY6的3種復(fù)配菌肥；30%噻呋·嘧菌酯懸浮劑(陜西上格之路生物科學(xué)有限公司)。

1.2 拮抗菌株的篩選

采用平板對峙法，以馬鈴薯干腐菌(F.solani)為指示菌，根據(jù)抑菌率篩選優(yōu)良拮抗菌株。

抑菌率(%)=[(對照病原菌菌落直徑-處理病原真菌菌落直徑)/(對照病原菌菌落直徑-菌餅直徑)]×100。

1.3 拮抗菌株的鑒定

1.3.1 拮抗菌株的形態(tài)觀察

將保存于斜面的拮抗菌株在NA平板上劃線后置于28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，72 h后觀察菌落形態(tài)并描述培養(yǎng)性狀及拍照。

將拮抗細菌分別劃線接種于NA平板，培養(yǎng)18～24 h后進行革蘭氏染色，鏡檢拍照[17]。

1.3.2 16S rDNA序列鑒定

DNA的提取。將活化24 h的菌株接入NB培養(yǎng)液，28 ℃振蕩培養(yǎng)12 h，隨后按上海生物工程技術(shù)有限公司試劑盒提取DNA。

PCR擴增。利用引物對提取的DNA進行PCR擴增，引物序列分別為5’-CCGGATCCAGAGTTTGATCATGGCTCAGCA-3’和5’-CGG GATCCTACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’，由上海生物工程技術(shù)有限公司合成。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性10 s，54 ℃退火20 s，68 ℃延伸40 s，35個循環(huán)；最后在68 ℃下延伸7 min，4 ℃保存。反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測，具特異性條帶的擴增產(chǎn)物送上海生物工程技術(shù)有限公司測序。

序列分析。將上海(Sangon)生物工程技術(shù)公司所測序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進行同源性比較(http:∥www.ncbi.nlm.nihgov/blast.cgi)，選擇同源性達99%以上的序列用Mega(7.0)軟件中的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定各菌株的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)地位。

1.4 大田試驗對馬鈴薯干腐病的防效

試驗在張掖市民樂縣南古鎮(zhèn)觀音堂村進行，試驗種薯為大西洋，種植時間為2017年5月6日。微生物菌劑采用草炭、有機肥、骨粉按45%、45%和10%混合作為發(fā)酵基質(zhì)，充分混勻后裝入布袋121 ℃高壓滅菌2 h，按10%(265ZY1、265ZY3、265XY6按1∶1∶1混合)接種量接入種子液，于淺盤中置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵10 d，后35 ℃烘干并稱取1 g干燥的發(fā)酵菌劑采用平板稀釋計數(shù)法計算活菌數(shù)(CFU·g-1)，菌量達1012CFU·g-1。

將馬鈴薯切為邊長3～4 cm的小塊，用3種菌復(fù)配劑(265ZY1、265ZY3、265XY6)3 kg·667m-2拌種處理，以30%噻呋·嘧菌酯懸浮劑設(shè)26.5 mL·667m-2、枯草芽孢桿菌可濕性粉劑設(shè)60 g·667m-2和70%甲基硫菌靈可濕性粉劑設(shè)132 g·667m-2作藥劑對照，以清水為空白對照；每處理3次重復(fù)，每重復(fù)100個薯塊，以播種形式將處理薯塊埋于重茬馬鈴薯田中，30 d后調(diào)查薯塊干腐病發(fā)生情況，并計算發(fā)病率、病情指數(shù)和防效[18]。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2007、SPSS 24.0、Mega(7.0)等軟件進行試驗設(shè)計與數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗細菌的篩選

從120個供試內(nèi)生細菌中，經(jīng)初篩獲得30株對茄鐮孢菌有較好拮抗效果的菌株。復(fù)篩得到拮抗效果較強且穩(wěn)定的菌株265ZY1、265ZY3和265XY6進行后續(xù)研究(表1)。

2.2 拮抗菌株的鑒定

2.2.1 形態(tài)及培養(yǎng)性狀觀察

經(jīng)革蘭氏染色，265ZY1、265ZY3和265XY6菌體均為紫色，即革蘭氏陽性，菌體桿狀(圖1)；265ZY1菌落呈現(xiàn)白色、干燥、扁平、邊緣整齊，表面有褶皺；265ZY3菌落較厚，邊緣整齊表面干癟多褶皺，呈不規(guī)則圓形，乳白色；265XY6乳白色半透明菌落，表面多褶皺，邊緣不整齊(圖2)。

2.2.2 16S rDNA 序列分析

利用試劑盒提取菌株265ZY1、265ZY3和265XY6的基因組DNA，在1%瓊脂糖凝膠上電泳檢測，提取的DNA片段特異性良好，滿足擴增要求，可以進行PCR擴增。

擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，與DL2000Marker比較，約在1 500 bp處有一明亮條帶，其分子量大小與菌株16S rDNA基因序列長度的理論值相符，送上海生物工程技術(shù)有限公司測序。

表1 良好拮抗菌株的抑菌率

Table 1 The inhibition rate of antagonistic bacterial strains

菌種Strain抑菌率Inhibition ratio/%菌種Strain抑菌率Inhibition ratio/%菌種Strain抑菌率Inhibition ratio/%265ZY373.00O1071.88264AY371.25265XY672.80O2771.88S2171.15265ZY172.20261AG371.77O5571.04 262AG672.08FQ171.67O5671.04B372.08S2771.67O6170.94YO-7172.08O5071.46S2670.83264ZY1071.98B671.46b70.21XSG371.98G571.46263XY170.10e71.88YO-5771.25O4470.00G271.88QL-171.25S3070.00

圖1 拮抗細菌的革蘭氏染色Fig.1 Gram staining of antagonistic bacteria

圖2 拮抗細菌的培養(yǎng)性狀Fig.2 Culture characteristics of antagonistic bacteria

將所測序列提交至NCBI中的GenBank數(shù)據(jù)庫，登錄網(wǎng)址http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi， 用BLAST軟件將菌株265ZY1、265ZY3和265XY6的16S rDNA序列與GenBank中序列進行比較，并下載同源性較高的序列，使用Mega(7.0)軟件鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)，結(jié)果表明，菌株265ZY1與死谷芽孢桿菌B.vallismortis(KF818642)聚在一起，相似度達99%；菌株265ZY3與解淀粉芽孢桿菌B.amyloliquefaciens(KJ149810)聚在一起，相似度達99%；菌株265XY6與甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌B.methylotrophicus(KM817258)聚在一起，相似度達99%。結(jié)合形態(tài)特征將菌株265ZY1鑒定為死谷芽孢桿菌B.vallismortis，菌株265ZY3鑒定為解淀粉芽孢桿菌B.amyloliquefaciens，菌株265XY6鑒定為甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌B.methylotrophicus。

2.3 對馬鈴薯干腐病的防效

由表2可知，施用4種藥劑后，馬鈴薯干腐病的發(fā)病率為9.17%～20.00%，病情指數(shù)為1.76～6.02，空白對照的發(fā)病率和病情指數(shù)分別為59.17%和22.96，其中，三菌株(265ZY1、265ZY3、265XY6)復(fù)配菌劑的防效達79.75%，低于30%噻呋嘧菌酯(防效達92.25%)的防效，但優(yōu)于70%甲基硫菌靈(防效達73.50%)，與枯草芽孢桿菌防效相似。結(jié)果表明，本試驗所得微生物菌劑對馬鈴薯干腐病具有較好防效，說明微生物菌劑具有開發(fā)為生物農(nóng)藥的潛力。

3 討論與結(jié)論

表2 四種藥劑對馬鈴薯干腐病的防效

Table 2 Control effect of four fungicides on potato dry rot

藥劑Fungicide用藥量Dosage發(fā)病率Disease incidence/%病情指數(shù)Disease index防效Control effects/%甲基硫菌靈Thiophanate-methyl132 g·667m-220.00±0.03 b6.02±0.09 b73.50±0.04 c枯草芽孢桿菌Bucillus subtilis60 g·667m-215.83±0.02 bc4.45±0.61 bc80.75±0.03 b三菌株復(fù)配30000 g·667m-214.17±0.02 bc4.72±0.25 bc79.75±0.05 bCombination of three strains(265ZY1、265ZY3、265XY6)噻呋嘧菌酯Thiflufur azoxystrobin26.5 mL·667m-29.17±0.04 c1.76±0.10 c92.25±0.02 a對照Control—59.17±0.07 a22.96±0.70 a—

同列數(shù)據(jù)后沒有相同字母表示在0.05水平差異顯著(P<0.05)。

Values with different lowercase letter within the same column meant significant difference among different treatments at 0.05 level.

目前，對馬鈴薯干腐病防治主要依靠化學(xué)農(nóng)藥[19]，隨著大量微生物農(nóng)藥的開發(fā)與應(yīng)用，生物防治已成為一個熱門的研究領(lǐng)域，發(fā)展至今，已經(jīng)具有較為完整的理論體系和方法。近年來，由于生態(tài)環(huán)境與食品安全問題逐漸受到社會的關(guān)注，從而生物防治得到各方面的大力支持，且研究成果逐步從實驗室走向田間，在農(nóng)產(chǎn)品安全生產(chǎn)中越來越得到人們的重視。國外對馬鈴薯干腐病的生物防治已取得了較大進展[20]，但國內(nèi)利用生防細菌防治馬鈴薯干腐病報道相對較少。馬鈴薯干腐病的生物防治首見于Schisler等[21]的報道，他們對威斯康星地區(qū)的馬鈴薯田間土壤的300多個細菌與酵母菌株進行篩選，發(fā)現(xiàn)有18株細菌對馬鈴薯干腐病具有一定防治潛力。Schisler等[22]在2000年報道了用拮抗細菌來防治貯藏期馬鈴薯干腐病，使貯藏期馬鈴薯干腐病發(fā)病率下降了35%～81%。本試驗篩選獲得3株對甘肅馬鈴薯干腐病菌具有良好抑制作用的菌株265ZY1、265ZY3和265XY6，其中265ZY1溶磷能力較強，達40 μg·mL-1，265ZY3、265XY6產(chǎn)IAA較強，分別達110和147 μg·mL-1，且三株細菌能兩兩親和(另文報道)，為甘肅馬鈴薯干腐病生物防治提供了菌種資源和復(fù)配防效的依據(jù)。

芽孢桿菌是人類發(fā)現(xiàn)最早的拮抗細菌之一。具有分布廣、抑菌譜廣、抗性強、無毒等特點，在動植物的生物防治中應(yīng)用比較廣泛[23]。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，芽孢桿菌作為生防細菌對多種病害有防治作用，張猛等[24]報道了死谷芽孢桿菌菌株wm005對油菜菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum)、黃瓜立枯病菌(Rhizoctoniasolani)、草莓灰霉病菌(Botrytiscinerea)、小麥赤霉病菌(Fusariumgraminearium)、辣椒疫霉病菌(Phytophthoracapsici)、番茄枯萎病菌(Fusariumoxysporumf. sp.lycopersici)、水稻惡苗病菌(Fusariummoniliforme)、葡萄炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporioides)、西瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporumf. sp.niveum)表現(xiàn)出很強的抑制作用；張國漪等[25]研究發(fā)現(xiàn)，死谷芽孢桿菌HJ-5對棉花黃萎病(cottonvirticilliumwilt)有較好的防治作用；魏新燕等[26]研究發(fā)現(xiàn)，甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌BH21具有合成surfactin、iturin及fengycin等多種脂肽類抗菌物質(zhì)的基因，該菌株脂肽粗提物對葡萄灰霉病菌(Botrytiscinerea)具有較強的拮抗作用；周登博等[27]在天然餅肥發(fā)酵液分離獲得甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌4-L-16，其對香蕉枯萎病菌(Fusariumoxysporum)、香蕉炭疽病菌(Colletotrichummusae)、荔枝炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporioides)等9種病原真菌具有抑菌活性。解淀粉芽孢桿菌是一種與枯草芽孢桿菌親緣性很高的細菌，在其自身的生長過程中可以產(chǎn)生一系列的代謝產(chǎn)物，這些代謝產(chǎn)物使得解淀粉芽孢桿菌能夠具有廣泛的抑制真菌和細菌的活性。潘虹余等[28]發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽孢桿菌 B15發(fā)酵液對灰葡萄孢具有良好抑菌效果。這些研究表明芽孢桿菌已被廣泛應(yīng)用于生物防治；且芽孢桿菌在防病的穩(wěn)定性、與化學(xué)農(nóng)藥的相容性等方面表現(xiàn)出極大地優(yōu)勢。因此，篩選經(jīng)濟、高效的生防芽孢桿菌對農(nóng)業(yè)生物防治有極其重要的作用。

本試驗結(jié)果表明，菌株265ZY1、265ZY3和265XY6經(jīng)鑒定均為芽孢桿菌，且對馬鈴薯干腐病菌具有良好的抑菌效果，對馬鈴薯干腐病菌的抑菌率分別為72.20%、73.00%和72.80%；對3菌株復(fù)配菌劑進行了模擬大田試驗，其防治馬鈴薯干腐病的防效達79.75%，表明本試驗篩選和鑒定的3株芽孢桿菌具有防治馬鈴薯干腐病的能力。