利用SSR分析浙南地區(qū)甜玉米自交系的遺傳多樣性

岳高紅，潘彬榮，劉永安，梅喜雪，許立奎，張宗宸，周志輝

(浙南作物育種重點實驗室/溫州市農(nóng)業(yè)科學研究院 作物研究所，浙江 溫州 325006)

甜玉米是玉米屬之中的一個亞種——甜質(zhì)型玉米亞種，是控制胚乳的一個或多個隱性基因發(fā)生突變形成的。由于甜玉米籽粒胚乳之中含糖量高，具有營養(yǎng)豐富，口感香甜、脆嫩的特點，又被稱之為水果玉米，深受國內(nèi)外消費者的喜愛[1-2]。甜玉米起源于美洲的熱帶和亞熱帶高原地區(qū)，至今已有100多年的種植和生產(chǎn)歷史[3-4]。20世紀60年代我國的甜玉米育種工作才起步，通過從國外引進甜玉米材料和自主選育相結(jié)合的方法，相繼育成了一批普通型甜玉米、超甜型甜玉米和加強型甜玉米[5-7]。這些品種表現(xiàn)出產(chǎn)量高、適應性強、品質(zhì)好、種皮薄、渣質(zhì)少，既可作水果鮮食，又可速凍加工，深受農(nóng)民的歡迎[8]。

溫州市農(nóng)業(yè)科學研究院作物研究所甜玉米育種團隊長期從事甜玉米的引選和培育工作，從國內(nèi)外收集了大量的甜玉米種質(zhì)資源，通過多年套袋自交和定向選擇，形成了一批適宜浙南地區(qū)的甜玉米自交系，并成功育成了國家審定甜玉米品種金玉甜1號[9]和浙江省審定甜玉米新品種金玉甜2號[10]。

分子標記技術已廣泛應用于各種玉米材料的遺傳多樣性研究中[11-14]，尤其是SSR標記，因其多態(tài)性豐富、重復性穩(wěn)定、共顯性、選擇中性、操作簡便等優(yōu)點，常被用來分析甜玉米自交系的遺傳多樣性[15-16]。為此，本研究利用SSR分子標記對浙南地區(qū)甜玉米自交系的遺傳多樣性進行分析，以期能揭示甜玉米自交系間的遺傳背景差異，為甜玉米自交系種質(zhì)的科學評價，雜種優(yōu)勢潛力的挖掘，以及新品種的選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為37份浙南地區(qū)甜玉米自交系，均由溫州市農(nóng)業(yè)科學研究院提供(表1)。這批自交系是作物研究所甜玉米育種團隊自2000年以來，從國內(nèi)外引進、收集回來的地方品種、改良品種和推廣品種等，經(jīng)連年自交套袋后，分離選育出的綜合農(nóng)藝性狀良好，株系表現(xiàn)穩(wěn)定、一致的材料。

1.2 分子標記分析

1.2.1 DNA提取

在田間玉米苗期，每個自交系選取長勢一致的5～6株幼苗混合收取嫩葉片約0.5 g，用液氮磨成粉狀，用改良的CTAB法提取和純化DNA[17]。以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質(zhì)量，經(jīng)紫外分光光度計測定DNA濃度后，稀釋至20 ng·μL-1的工作液備用，置于4 ℃冰箱儲藏待用。

1.2.2 SSR分析

表1 玉米自交系信息

Table 1 Information of sweet maize inbred lines

材料編號Material No.材料來源Resource地理來源Geographical origin材料編號Material No.材料來源Resource地理來源Geographical origin01華自 Huazi臺灣Taiwan19奧甜3號 Aotian No. 3廣東 Guangdong0291美國U.S.A.20特甜1號 Tetian No. 1浙江 Zhejiang03795浙江Zhejiang21超甜2018 Chaotian 2018浙江 Zhejiang04海南高 Hainangao海南 Hainan22佳美1號 Jiamei No. 1福建 Fujian05華自(白)119 Huazi (white) 119臺灣 Taiwan23種都1號 Zhongdu No. 1成都 Chengdu06引5(黃) Yin 5 (yellow)美國 U.S.A.24超甜4號 Chaotian No. 4浙江 Zhejiang07田5 Tian 5四川 Sichuan25超甜318 Chaotian 318浙江 Zhejiang08田15 Tian 15四川 Sichuan26奧甜8210 Aotian 8210廣東 Guangdong09華7 Hua 7浙江 Zhejiang27SW503北京 Beijing10品2(白粒) Pin 2 (white grain)浙江 Zhejiang28T1539云南 Yunnan11黃金1號 Gold No. 1美國 U.S.A.29甜甜2號 Tiantian No. 2廣東 Guangdong1206D18 浙江Zhejiang30白甜糯1號 Baitiannuo No. 1江蘇 Jiangsu13T6廣東 Guangdong31廣甜5號 Guangtian No. 5廣東 Guangdong14法國種 French species法國 France32浙甜7號 Zhetian No. 7浙江 Zhejiang15金銀甜135(黃)浙江 Zhejiang33日本種 Japanese species日本 JapanJinyintian 135 (yellow)34新珍201 Xinzhen 201四川 Sichuan16金銀蜜脆 Jinyinmicui浙江 Zhejiang35豐甜1號 Fengtian No. 1廣東 Guangdong17先甜5號 Xiantian No. 5廣東 Guangdong36華5 Hua 5浙江 Zhejiang18海南矮 Hainanai海南 Hainan37788-1浙江 Zhejiang

選用已報道的分布于玉米10條染色體上，多態(tài)性豐富的49對SSR標記，對37份甜玉米自交系進行PCR擴增。所有SSR引物皆由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR擴增在ABI 9700型PCR儀上進行，反應體系總體積為15 μL，包括2×TaqPCR MasterMix(天根生化科技(北京)有限公司)7.5 μL，10 ng·μL-1正反向引物各0.5 μL，20 ng·μL-1DNA模板2.5 μL，補ddH2O至15 μL。PCR擴增反應程序為95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 40s，30個循環(huán)；72 ℃ 5 min。擴增產(chǎn)物在6%的聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離，然后用簡易銀染法顯色[18]。在醫(yī)用觀片燈上觀察電泳凝膠成像結(jié)果，進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和拍照。

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

根據(jù)聚丙烯酰胺凝膠電泳成像結(jié)果記錄甜玉米各自交系在每個SSR標記下的擴增情況，按照在相同遷移位置有擴增條帶記為1，無條帶記為0，建立0/1矩陣數(shù)據(jù)庫。用NTsys-pc 2.11軟件分析每對引物擴增位點的多態(tài)性信息量(polymorphism information content，PIC)[19]和遺傳相似系數(shù)[20]，按照非加權組平均法(unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA)對這37份玉米自交系進行聚類分析，構(gòu)建聚類分析樹狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR標記特征

選用49對SSR標記引物對37份浙南地區(qū)甜玉米自交系進行PCR擴增，其中37對擴增產(chǎn)物在6%聚丙烯酰胺凝膠上呈現(xiàn)多態(tài)性，且?guī)头€(wěn)定，重現(xiàn)性佳(圖1)，多態(tài)性比率為75.5%。37對多態(tài)性引物對37份甜玉米自交系共擴增出233條擴增帶，多態(tài)性條帶有209條，每對SSR引物可產(chǎn)生2～16條擴增帶，2～15條多態(tài)性條帶，多態(tài)性比率60.0%～100.0%，PIC值0.62～0.95，平均每個標記有5.65個等位變異基因，平均多態(tài)性信息量為0.82，表明實驗中所選用的SSR標記在37個甜玉米自交系間具有較豐富的多態(tài)性(表2)。

2.2 遺傳相似性

根據(jù)SSR分子標記結(jié)果計算出37個甜玉米自交系間的遺傳相似系數(shù)(表3)，結(jié)果顯示，各甜玉米自交系間的相似性系數(shù)為0.12～0.94，其中自交系ind24與ind25的相似系數(shù)最大，達到了0.94，而自交系ind11與ind30，ind11與ind32的相似系數(shù)最小，僅有0.12，所有供試甜玉米自交系的平均相似系數(shù)為0.40，說明這些甜玉米自交系之間遺傳背景差異較大，具有較豐富的遺傳多樣性。

2.3 基于SSR標記的聚類分析

根據(jù)37個SSR標記的結(jié)果對37份供試甜玉米自交系進行聚類分析，結(jié)果表明，所選甜玉米自交系間具有豐富的遺傳變異。在遺傳相似系數(shù)0.39時，可以將供試的37份甜玉米自交系分為3大類群(Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ)(圖2)。第Ⅰ類群只有來自佳美1號和新珍201育的2個自交系，這兩個自交系之所以與其他自交系有較大的遺傳差異，可能是由于其原雜交種中滲入了普通玉米的遺傳片段，并在自交過程中被保留了下來，這還有待進一步的實驗予以驗證。第Ⅱ類群包括來自華自(白)119、引5黃(自53)、法國種、黃金1號和日本種的5份自交系，主要來源于境外引進的玉米材料，這些材料往往保留原有玉米品種的部分特征特性，因而遺傳差異較大，獨立聚類成一個類群。第Ⅲ類群包括30份自交系，主要是來自國內(nèi)選育甜玉米品種或地方農(nóng)家種的后代選系。根據(jù)其田間表現(xiàn)及自交選育過程的歷年記載，又可將其分為兩個亞群：第1亞群包括來自91、795、田5、田15、華7、品2白粒、06D18繁殖、T6、先甜5號、種都1號、甜甜2號和廣甜5號的共12份自交系材料，主要是在原始基礎材料自交過程中有目的地以甜度高、皮渣率低、風味好等品質(zhì)選擇為標準定向選育而成的自交系；第2亞群包括來自華自、海南高、金銀甜135(黃)、金銀蜜脆、海南矮、奧甜3號、特甜1號、超甜2018、超甜4號、超甜318、奧甜8210、SW503、T1539、白甜糯1號、浙甜7號、豐甜1號、華5和788-1的共計18份自交系材料，這些自交系都是在原始基礎材料自交過程中有目的地以長勢旺盛、綜合性狀良好、產(chǎn)量高等農(nóng)藝性狀為標準定向選育而成的自交系。

電泳泳道編號與表1材料編號相同。Code of electrophoretic lane in the figure was the same as the material No. in Table 1.圖1 供試甜玉米自交系SSR分子標記phi092電泳圖譜Fig.1 Electrophoresis profiles amplified by SSR molecular marker phi092 in sweet maize inbred lines

表2 37對多態(tài)性SSR引物信息

Table 2 Information of 37 pairs of polymorphic SSR primers

編號No.引物名稱Primername前引物序列Forward primer sequence(5'-3')后引物序列Reverse primer sequence(5'-3')總帶數(shù)Totalfragmentsnumber多態(tài)性帶數(shù)Polymorphicfragmentsnumber多態(tài)性比率Polymor-phismratio/%多態(tài)性信息量PIC1Umc1269TATATTAGAGGCACCTCCCTCCGTAGCTGCTTCAGCGACTTTGG99100.0 0.93 2Umc1422GAGATAAGCTTCGCCCTGTACCTCCTCATCGCGATCTCCCAGTC44100.0 0.83 3umc1318ACTTCGTCTAGTGTCCCTCCGTTTGCCAGATTAAAAGCAACACAAGA33100.0 0.74 4phi047GGAGATGCTCGCACTGTTCTCCTCCACCCTCTTTGACATGGTATG66100.0 0.90 5phi031GCAACAGGTTACATGAGCTGACGACCAGCGTGCTGTTCCAGTAGTT1414100.0 0.95 6phi051CGACATCGTCAGATTATATTG-CAGACCAGGCGAAAGCGAACGACAACAATCTT22100.0 0.70 7phi065AGGGACAAATACGTGGAGACACAGCGATCTGCACAAAGTGGAGTAGTC33100.0 0.79 8phi053 CTGCCTCTCAGATTCAGAGATTGAC AACCCAACGTACTCCGGCAG55100.0 0.84 9phi050TAACATGCCAGACACATACGGACAGATGGCTCTAGCGAAGCGTAGAG33100.0 0.78 10phi083CAAACATCAGCCAGAGACAAGGACATTCATCGACGCGTCACAGTCTACT44100.0 0.82 11phi014AGATGACCAGGGCCGTCAACGACCCAGCTTCACCAGCTTGCTCTTCGTG55100.0 0.85 12phi027CACAGCACGTTGCGGATTTCTCTGCGTACGTACGACGAAGACAC44100.0 0.79 13phi077GAGAAGAGGATCAGGTTCGTTCCACGCGTTGTACATCTTGCCTGCTT33100.0 0.78 14phi080CACCCGATGCAACTTGCGTAGATCGTCACGTTCCACGACATCAC1010100.0 0.92 15phi072ACCGTGCATGATTAATTTCTCCAGC-CTTGACAGCGCGCAAATGGATTGAACT11763.6 0.88 16phi085AGCAGAACGGCAAGGGCTACTTTTGGCACACCACGACGA6466.7 0.81 17phi087GAGAGGAGGTGTTGTTTGACACACACAACCGGACAAGTCAGCAGATTG33100.0 0.73 18phi092GTGGGGGAGCCTACTACAGGGACGAGGCCATCATCACGGT141392.9 0.95 19phi114CCGAGACCGTCAAGACCATCAAAGCTCCAAACGATTCTGAACTCGC161593.8 0.94 20phi116GCATACGGCCATGGATGGGATCCCTGCCGGGACTCCTG1010100.0 0.93 21phi126TCCTGCTTATTGCTTTCGTCATGAGCTTGCATATTTCTTGTGGACA1111100.0 0.92 22phi96100AGGAGGACCCCAACTCCTGTTGCACGAGCCATCGTAT10660.0 0.86 23phi4488880CGATCCGGAGGAGTTCCTTACCATGAACATGCCAATGC5360.0 0.66 24bnlg1203GACCCGTCTCTCTTGAGTGCGTCTGTCTGCACCCGTTTTT151066.7 0.91 25Umc1065ACAAGGCCATCATGAAGAGCAGTACACGGTCTGGCACACTAACCTTAT77100.0 0.88 26bnlg1538CAGCCGAAGACGAAGCCGTGGTGAACGAACGAGCAA4375.0 0.79 27bnlg2238TGCCACTCAAGCCTTCTTTTTTCTGATTGCAGTGCAGACC151173.3 0.92 28ZAG107GCAACTAGAAGTAGATGGCTTGT-TATGGCAACAACAAGTGGCTGGCTAGGGT-GAA 44100.0 0.82 29bnlg391CAGATATCACAGCATCAGAAGATCAAAAATGTAAGAACTTGTTTGGGATT55100.0 0.83 30phi024ACTGTTCCACCAAACCAAGCCGAGAAGTAGGGGTTGGGGATCTCCTCC22100.0 0.70 31phi002CATGCAATCAATAACGATGGCGAGTTTAGCGTAACCCTTCTCCAGTCAGC22100.0 0.62 32phi064CCGAATTGAAATAGCTGCGAGAAC-CTACAATGAACGGTGGTTATCAA-CACGC44100.0 0.81 33phi048GCAAACCTTGCATGAACCCGATTGTCAAGCGTCCAGCTCGATGATTTC22100.0 0.68 34phi127ATATGCATTGCCTGGAACTGGAAG-GA AATTCAAACACGCCTCCCGAGTGT33100.0 0.77 35phi112TGCCCTGCAGGTTCACATTGAGTAGGAGTACGCTTGGATGCTCTTC33100.0 0.78 36phi073GTGCGAGAGGCTTGACCAAAAGGGTTGAGGGCGAGGAA22100.0 0.69 37phi076TTCTTCCGCGGCTTCAATTTGACCGCATCAGGACCCGCAGAGTC44100.0 0.81 合計Total23320993.3

圖2 基于SSR標記的37份甜玉米自交系的聚類樹狀圖Fig.2 Dendrogram of 37 sweet maize inbred lines based on SSR markers

3 討論

SSR分子標記因其廣泛分布于全基因組，具有穩(wěn)定性高、重現(xiàn)性佳、等位基因多態(tài)性豐富等優(yōu)點，被廣泛用于各種農(nóng)作物的遺傳多樣性分析[19-22]。黃君等[23]利用56個SSR標記對54份甜玉米自交系進行分析，檢測到155個等位基因變異，平均每對引物檢測到2.77個等位基因，變異范圍為2～5個，平均多態(tài)性信息含量為0.42。張姿麗等[15]采用40對SSR引物在48份超甜玉米自交系中檢測到86個等位基因變異，平均每個標記檢測到的等位基因變異為2.15個，平均多態(tài)性信息含量為0.49。李銳等[12]以SSR標記對144份甜玉米群體進行遺傳多樣性分析，40個SSR位點共檢測出343個等位變異，每對引物平均檢測出8.58個等位變異，平均多態(tài)性信息含量為0.76。本研究利用37對多態(tài)性SSR引物在37份甜玉米自交系中檢測到209條多態(tài)性條帶，每個位點可檢測到2～15個等位基因變異，平均等位基因數(shù)5.65，平均每個SSR標記的PIC為0.82，平均等位基因位點數(shù)高于黃君等[24]和張姿麗等[15]的實驗結(jié)果，多態(tài)性信息含量PIC值均高于上述研究[12，15，23]結(jié)果，表明供試甜玉米自交系間的遺傳差異較大，所篩選的引物代表性較好，能夠檢測出自交系豐富的遺傳多樣性。

玉米自交系之間的遺傳多樣性差異越大，可表現(xiàn)出越強的適應性，雜交種親本間的遺傳差異性直接決定了是否能夠得到雜種優(yōu)勢潛力大的雜交種后代[24]。因此，客觀地評價甜玉米自交系之間的遺傳多樣性對育種具有重要的意義。利用SSR分子標記技術進行甜玉米自交系的遺傳多樣性分析，既可避免遺傳信息的錯判，又可根據(jù)遺傳距離的遠近為甜玉米雜種優(yōu)勢的利用及強優(yōu)勢組配的選擇提供理論指導。本研究中UPGMA聚類結(jié)果顯示，37份甜玉米自交系間的遺傳相似系數(shù)在0.12～0.94，說明供試材料間的遺傳差異較大，反映了自交系來源廣泛，自交系間的遺傳多樣性水平較高。聚類結(jié)果將甜玉米自交系劃分為三個類群，第Ⅰ類群，認為是其遺傳基礎中滲入了普通玉米的部分基因，因此遺傳背景差異較大；第Ⅱ類群集中了從境外引入的甜玉米材料的自交后代，保留了原有品種的特征特性，與國內(nèi)甜玉米品種、株系間存在較大的遺傳差異；第Ⅲ類群基本上是國內(nèi)選育甜玉米品種或地方農(nóng)家種的后代選系。由此可見，UPGMA聚類分析的劃分結(jié)果與浙南地區(qū)甜玉米自交系的系譜來源及地理分布基本吻合。

本研究對甜玉米自交系的遺傳變異性進行了分析和評價，有利于甜玉米資源的保存、利用和新品種的選育。第Ⅰ類群中的自交系與其他兩個類群自交系的遺傳距離較大，表明相互之間的親緣關系較遠，基因交流比較有限。在雜交選育方面可以選擇遺傳距離相對較大且遺傳相似性較低的自交系作為親本，有可能獲得具有較大雜種優(yōu)勢的雜交種。另外，甜玉米新品種的選育不應當局限于雜種優(yōu)勢和品質(zhì)改良，還需要將配合力、抗病性、抗蟲性和耐逆性等納入到育種目標中，因此，建議在今后的甜玉米育種工作中引進配合力、抗病性、抗蟲性、耐逆性強的甜玉米種質(zhì)資源，在自交系的選育中增加對其配合力、抗病性、抗蟲性和耐逆性的評價，結(jié)合分子標記技術，提高甜玉米育種的效率和效果。