肝細(xì)胞癌中miR-942-5p的表達(dá)及其與患者惡性特征及不良預(yù)后的關(guān)系

丁琭，莫緩椰，鮮瑤，涂康生

（西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院 1.麻醉科 2.肝膽外科 3.營(yíng)養(yǎng)科，陜西 西安 710061）

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是世界上最常見(jiàn)和最具侵襲性的人類(lèi)惡性腫瘤之一[1]。HCC預(yù)后不良和高復(fù)發(fā)率主要是由于肝內(nèi)和肝外轉(zhuǎn)移的高發(fā)率[2]。轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，許多細(xì)胞內(nèi)在成分和外在微環(huán)境因素影響HCC細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能[3]。然而，介導(dǎo)HCC侵襲轉(zhuǎn)移的潛在分子機(jī)制仍然很不清楚。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類(lèi)長(zhǎng)度約22～24個(gè)核苷酸的小型非編碼RNA分子，它們通過(guò)靶向mRNA降解和翻譯抑制參與基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控[4-5]。越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)miRNA在不同的生理和病理學(xué)過(guò)程發(fā)揮關(guān)鍵作用，如細(xì)胞增殖、分化、凋亡和細(xì)胞周期進(jìn)程[6-8]。筆者既往研究發(fā)現(xiàn)miR-876-5p在HCC組織中表達(dá)降低，其通過(guò)靶向抑制BCL6共抑制因子樣蛋白1（BCL-6 corepressor-like-1，BCORL1）阻斷上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）和HCC細(xì)胞侵襲[9]。另外miR-1468通過(guò)激活過(guò)氧化物酶體增殖劑激活受體γ（peroxisome proliferators-activated receptor-γ，PPAR-γ）介導(dǎo)的Akt信號(hào)通路促進(jìn)HCC進(jìn)展[10]。miR-942-5p是一個(gè)新近發(fā)現(xiàn)的腫瘤相關(guān)miRNA，其在乳腺癌患者血清標(biāo)本中表達(dá)顯著高于健康對(duì)照組[11]。miR-942-5p通過(guò)下調(diào)干擾素刺激基因12a（interferon stimulated gene 12a，ISG12a）減少腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL）誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡[12]。另外，miR-942-5p通過(guò)激活Wnt/β連環(huán)蛋白（β-catenin）信號(hào)通路促進(jìn)食管鱗狀細(xì)胞癌中的腫瘤干細(xì)胞樣特征[13]。然而miR-942-5p在HCC中的表達(dá)和功能?chē)?guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究檢測(cè)miR-942-5p在HCC及癌旁組織中的表達(dá)，分析miR-942-5p表達(dá)與HCC臨床病理特征及患者生存率的相關(guān)性，通過(guò)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)明確miR-942-5p在HCC中的功能及其潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 病例資料

收集2017年1月—2017年12月西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽外科組織樣本庫(kù)保存的手術(shù)切除HCC及對(duì)應(yīng)癌旁組織（距離腫瘤邊緣≥2 cm）標(biāo)本73例。收集的樣本均經(jīng)病理學(xué)確認(rèn)，組織標(biāo)本最初在液氮中快速冷凍，然后在-80 ℃下儲(chǔ)存直至使用。所有患者均簽署了書(shū)面知情同意書(shū)，本研究經(jīng)西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2 主要材料

HCC細(xì)胞株HCCLM3和MHCC97H以及HEK293T細(xì)胞均由本實(shí)驗(yàn)室保存。DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、TRIzol試劑、Lipofectamine 2000、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；0.25%胰酶-EDTA購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；青霉素、鏈霉素溶液和二抗羊抗鼠IgG購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；miR-942-5p mimics/inhibitors、陰性對(duì)照及miR-942-5p PCR引物購(gòu)自廣州銳博生物技術(shù)有限公司；All-in-One?miRNA qPCR定量檢測(cè)試劑盒和含有3'UTR FBLN5的熒光素酶報(bào)告載體購(gòu)自廣州復(fù)能基因有限公司；Transwell小室及六孔板購(gòu)自美國(guó)Corning公司；Matrigel基質(zhì)膠購(gòu)自美國(guó)BD Biosciences公司；RIPA蛋白裂解液購(gòu)自上海碧云天公司；BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；PVDF膜和ECL發(fā)光液購(gòu)自美國(guó)Millipore公司；FBLN5抗體購(gòu)自美國(guó)R&D Systems公司；GAPDH抗體購(gòu)自美國(guó)United States Biological公司；定點(diǎn)突變?cè)噭┖匈?gòu)自美國(guó)Agilent Technologies公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCCLM3及MHCC97H細(xì)胞，按2×105個(gè)細(xì)胞每孔接種于六孔板中，待細(xì)胞貼壁后根據(jù)Lipofectamine 2000說(shuō)明書(shū)轉(zhuǎn)染等量（50 nmol/L）的 miR-942-5p 抑制物和陰性對(duì)照序列。轉(zhuǎn)染48 h后實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot分別檢測(cè)miR-942-5p表達(dá)和FBLN5蛋白表達(dá)。

1.3.2 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)用TRIzol試劑從組織和培養(yǎng)的細(xì)胞中提取總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，has-miR-942-5p引物序 列 RT：5'-GTC GTA TCC AGT GCA GGG TCC GAG GTA TTC GCA CTG GAT ACG ACC ACA T-3'；F：5'-GCG CGC TCT TCT CTG TTT TGG C-3'，R：5'-GTG CAG GGT CCG AGG T-3'；U6 引物序列 RT：5'-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3'；F：5'-GCT TCG GCA GCA CAT ATA CTA AAA T-3'，R：5'-CGC TTC ACG AAT TTG CGT GTC AT-3'。參照 All-in-One? miRNA qPCR 定量檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)，應(yīng)用美國(guó)ABI Prism?7300型熒光定量PCR系統(tǒng)進(jìn)行PCR反應(yīng)，每個(gè)模板設(shè)3個(gè)復(fù)孔，取平均 CT值，以 2-ΔΔCT法計(jì)算 miR-942-5p的相對(duì)表達(dá)量。

1.3.3 Western blot使用RIPA緩沖液裂解來(lái)自培養(yǎng)細(xì)胞的總蛋白質(zhì)，BCA法定量蛋白濃度，取等量總蛋白加入2×上樣緩沖液后100 ℃煮沸5 min。將蛋白質(zhì)在10%SDS聚丙烯酰胺凝膠上完全電泳，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。將膜用5%脫脂牛奶封閉 2 h，將膜與一抗（FBLN5，1:1 000；GAPDH，1:5 000）在4 ℃溫育過(guò)夜，然后將膜與二抗（1:1 000）室溫孵育 1～2 h，ECL 發(fā)光液顯影，應(yīng)用Amersham? Imager 600凝膠成像儀拍照。

1.3.4 miR-942-5p在HCC中的生存率分析應(yīng)用OncoLnc網(wǎng)站（http://www.oncolnc.org/）平臺(tái)分析TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中miR-942-5p與HCC患者預(yù)后的相關(guān)性，OncoLnc網(wǎng)站建議對(duì)于樣本量較大的腫瘤數(shù)據(jù)，推薦比較表達(dá)前1/3和后1/3的樣本數(shù)據(jù)。因此，采用Kaplan-Meier分析miR-942-5p表達(dá)水平前33%的HCC患者（n=119）和后33%的HCC患者（n=119）的生存時(shí)間。

1.3.5 Transwell實(shí)驗(yàn)使用Transwell小室測(cè)定HCC細(xì)胞的遷移和侵襲能力。針對(duì)細(xì)胞遷移測(cè)定，小室的上層和下層由具有8 μm孔的聚碳酸酯膜隔開(kāi)，在小室底部加入含10%FBS的DMEM作為化學(xué)引誘劑，將5×104個(gè)轉(zhuǎn)染后HCC細(xì)胞經(jīng)無(wú)血清培養(yǎng)基混懸并接種在小室上層，然后將小室在37 ℃下含有5%CO2的潮濕培養(yǎng)箱中孵育24 h，遷移到膜下側(cè)的細(xì)胞用0.1%結(jié)晶紫染色，顯微鏡下拍照和計(jì)數(shù)。針對(duì)細(xì)胞侵襲測(cè)定，Matrigel基質(zhì)膠按1:8稀釋加入小室上室面，其余操作同上。

1.3.6 熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)根據(jù)定點(diǎn)突變?cè)噭┖姓f(shuō)明書(shū)突變野生型3'UTR-FBLN5中潛在的miR-942-5p結(jié)合位點(diǎn)，構(gòu)建攜帶突變型3'UTRFBLN5的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒。HEK293T細(xì)胞以3.5×104/孔的細(xì)胞密度接種在六孔板中，待融合度達(dá)到80%后，用miR-942-5p mimics或陰性對(duì)照和含有野生型3'UTR-FBLN5或突變型3'UTR-FBLN5的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒（1 mg/孔）瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，根據(jù)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)說(shuō)明書(shū)在轉(zhuǎn)染48 h后測(cè)量螢火蟲(chóng)和海腎熒光素酶活性，將熒光素酶活性標(biāo)準(zhǔn)化為海腎熒光素酶活性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用GraphPad Prism 6.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。組間比較采用Student's-t檢驗(yàn)，使用Kaplan-Meier方法繪制總體存活曲線(xiàn)，并進(jìn)行Logrank分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 miR-942-5p在HCC和癌旁組織中的表達(dá)

應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)73例HCC和癌旁組織中miR-942-5p的表達(dá)水平，結(jié)果顯示miR-942-5p在HCC組織中的表達(dá)明顯高于對(duì)應(yīng)的癌旁組織[（2.390±1.495）vs.（1.764±0.987），P=0.0033]（圖1）。

圖1 miR-942-5p在HCC和癌旁組織中的表達(dá)Figure1 The expressions of miR-942-5p in HCC tissue and tumor-adjacent tissue

2.2 miR-942-5p表達(dá)與HCC患者臨床病例特征的關(guān)系

根據(jù)miR-942-5p在73例HCC組織中的中位表達(dá)水平，將HCC患者分為miR-942-5p高表達(dá)組（n=37）和低表達(dá)組（n=36），統(tǒng)計(jì)學(xué)分析miR-942-5p表達(dá)與HCC患者臨床病理特征的相關(guān)性，結(jié)果顯示，miR-942-5p在多個(gè)腫瘤（≥2）、有血管浸潤(rùn)和高TNM分期（III+IV）的HCC組織中表達(dá)水平明顯高于單個(gè)腫瘤、無(wú)血管浸潤(rùn)和低TNM分（I+II）期的HCC組織（P＜0.05）；而miR-942-5p表達(dá)與患者性別、年齡、HBsAg狀態(tài)、AFP水平、腫瘤大小、肝硬化和Edmondson-Steiner分級(jí)無(wú)明顯關(guān)系（均P＞0.05）（表1）。

表1 miR-942-5p表達(dá)與HCC患者臨床病理特征的關(guān)系[n（%）]Table1 Relations of miR-942-5p expression with clinicopathologic features of HCC patients[n (%)]

2.3 miR-942-5p與HCC患者總生存率的關(guān)系

在OncoLnc網(wǎng)站（http://www.oncolnc.org/）平臺(tái)基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析miR-942-5p表達(dá)與HCC患者總生存率的關(guān)系，結(jié)果顯示miR-942-5p表達(dá)水平前33%的HCC患者（n=119）的總生存時(shí)間明顯低于miR-942-5p表達(dá)后33%的HCC患者（n=119）（P=0.017 6）（圖2）。

2.4 干擾miR-942-5p表達(dá)對(duì)HCC細(xì)胞遷移和侵襲的影響

使用Lipofectamine 2000瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-942-5p inhibitors或陰性對(duì)照至HCCLM3及MHCC97H細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染48 h后實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-942-5p抑制物能明顯降低HCCLM3和MHCC97H細(xì)胞中miR-942-5p表達(dá)水平（均P＜0.05）（圖3）。應(yīng)用Transwll小室檢測(cè)HCC細(xì)胞遷移和侵襲能力，結(jié)果顯示干擾miR-942-5p能明顯抑制HCCLM3和MHCC97H細(xì)胞遷移和侵襲能力（P＜0.05）（圖4-5）。

圖3 miR-942-5p抑制物在HCCLM3和MHCC97H細(xì)胞中的干擾效果Figure3 The knockdown efficiency of miR-942-5p inhibotors in HCCLM3 and MHCC97H cells

圖4 干擾miR-942-5p抑制HCCLM3和MHCC97H細(xì)胞遷移Figure4 miR-942-5p knockdown inhibited the migration of HCCLM3 and MHCC97H cells

圖5 干擾miR-942-5p抑制HCCLM3和MHCC97H細(xì)胞侵襲Figure5 miR-942-5p knockdown inhibited the invasion of HCCLM3 and MHCC97H cells

2.5 miR-942-5p下游靶點(diǎn)分析結(jié)果

在StarBase V3.0[14]網(wǎng)站（http://starbase.sysu.edu.cn/）平臺(tái)預(yù)測(cè)miR-942-5p潛在的下游靶點(diǎn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-942-5p與FBLN5 3'UTR存在互補(bǔ)結(jié)合序列。在HEK293T細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染miR-942-5p模擬物或陰性對(duì)照序列和野生型FBLN5-3'UTR或突變型FBLN5-3'UTR，結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)miR-942-5p明顯降低包含野生型FBLN5-3'UTR質(zhì)粒的熒光素酶活性，但不影響包含突變型FBLN5-3'UTR質(zhì)粒的熒光素酶活性（P＜0.05）（圖6）。應(yīng)用Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染miR-942-5p抑制物或陰性對(duì)照序列的HCC細(xì)胞中FBLN5蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示干擾miR-942-5p導(dǎo)致HCCLM3和MHCC97H細(xì)胞中FBLN5蛋白表達(dá)明顯增加（圖7）。

圖6 miR-942-5p下游靶點(diǎn)預(yù)測(cè)與分析Figure6 Prediction and analysis of the downstream target of miR-942-5p

圖7 干擾miR-942-5p對(duì)HCCLM3和MHCC97H細(xì)胞中FBLN5蛋白表達(dá)的影響Figure7 Influence of miR-942-5p knockdown on expression of FBLN5 protein in HCCLM3 and MHCC97H cells

3 討 論

越來(lái)越多的研究證實(shí)miRNAs通過(guò)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控癌基因或腫瘤抑制基因在HCC發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[15-18]，因此，研究致癌或腫瘤抑制性miRNAs對(duì)于揭示HCC進(jìn)展的分子機(jī)制十分關(guān)鍵。本課題組前期發(fā)表了大量有關(guān)miRNA與HCC的相關(guān)研究，例如發(fā)現(xiàn)miR-194-5p被長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）MCM3AP反義RNA1（MCM3AP antisense RNA 1MCM3APAS1）競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，其通過(guò)靶向調(diào)控叉頭盒蛋白A1（forkhead box A1，F(xiàn)OXA1）抑制HCC細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)凋亡[19]。另外miR-1296通過(guò)靶向阻斷絲氨酸-精氨酸蛋白特異性激酶1（serine-arginine protein kinase 1，SRPK1）介導(dǎo)的PI3K/AKT信號(hào)通路抑制EMT和HCC侵襲轉(zhuǎn)移[20]。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究報(bào)道m(xù)iR-942-5p在人惡性腫瘤的中的表達(dá)和功能。研究發(fā)現(xiàn)miR-942-5p在膀胱尿路上皮癌[21]、肺腺癌[22]和乳腺癌[11]患者血清中表達(dá)均顯著高于健康對(duì)照組。miR-942-5p高表達(dá)與轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌患者的進(jìn)展時(shí)間和總體存活率顯著相關(guān)[23]。miR-942-5p在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)顯著升高，其通過(guò)激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移[24]。同時(shí)miR-942-5p在食管鱗狀細(xì)胞癌中也是通過(guò)激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路發(fā)揮促癌功能[13]。目前miR-942-5p在HCC發(fā)生發(fā)展中的作用尚不清楚。本研究重點(diǎn)研究miR-942-5p在HCC組織中的表達(dá)，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析其與臨床資料和預(yù)后的相關(guān)性，并進(jìn)一步探究miR-942-5p對(duì)HCC細(xì)胞遷移和侵襲的影響及其潛在機(jī)制。

本研究首先在73例HCC和對(duì)應(yīng)癌旁組織中檢測(cè)miR-942-5p的表達(dá)差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-942-5p在HCC組織中的表達(dá)水平顯著高于對(duì)應(yīng)的癌旁組織。臨床病理資料分析發(fā)現(xiàn)miR-942-5p在多個(gè)腫瘤（≥2）、有血管浸潤(rùn)和高TNM分期（III+IV）的HCC組織中表達(dá)水平顯著高于單個(gè)腫瘤、無(wú)血管浸潤(rùn)和低TNM分（I+II）期的HCC組織。而進(jìn)一步基于TCGA數(shù)據(jù)繪制的生存曲線(xiàn)和統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)miR-942-5p高表達(dá)的HCC患者總生存率顯著低于miR-942-5p低表達(dá)患者，提示miR-942-5p是一個(gè)潛在的HCC預(yù)后分子標(biāo)志物。功能試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)沉默miR-942-5p顯著抑制HCCLM3和MHCC97H細(xì)胞遷移和侵襲能力，提示miR-942-5p在HCC中發(fā)揮促癌功能。通過(guò)StarBase V3.0網(wǎng)站預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)FBLN5 3'UTR存在miR-942-5p潛在互補(bǔ)結(jié)合序列，熒光素酶報(bào)道基因分析提示miR-942-5p可以直接結(jié)合FBLN5 3'UTR上的互補(bǔ)結(jié)合序列，提示FBLN5是一個(gè)m i R-9 4 2-5 p的直接下游靶點(diǎn)。我們既往研究[25]證實(shí)FBLN5通過(guò)下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶7（matrix metalloproteinase 7，MMP-7）表達(dá)抑制HCC細(xì)胞遷移和侵襲。同時(shí)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)干擾miR-942-5p導(dǎo)致HCCLM3和MHCC97H細(xì)胞中FBLN5表達(dá)明顯升高，提示miR-942-5p可能通過(guò)靶向調(diào)控FBLN5促進(jìn)HCC細(xì)胞遷移和侵襲。

綜上所述，本研究表明HCC組織中miR-942-5p異常高表達(dá)與惡性臨床特征和患者預(yù)后不良密切相關(guān)。miR-942-5p可能通過(guò)直接靶向FBLN5促進(jìn)HCC細(xì)胞遷移和侵襲。miR-942-5p的異常高表達(dá)可能是HCC發(fā)生進(jìn)展的重要驅(qū)動(dòng)因素，更重要的是，miR-942-5p/FBLN5軸可能是抗HCC治療的潛在靶點(diǎn)。