Ki-67表達(dá)與原發(fā)性肝癌根治性切除術(shù)后行預(yù)防性肝動(dòng)脈化療栓塞患者預(yù)后的關(guān)系

魏復(fù)群，羅柳平，梁東，林承杰，王壘，曾永毅

（福建醫(yī)科大學(xué)孟超肝膽醫(yī)院 肝膽外科，福建 福州 350025）

原發(fā)性肝癌（以下簡(jiǎn)稱肝癌）是全世界發(fā)生率及病死率最高的惡性腫瘤之一，隨著外科技術(shù)的發(fā)展，越來越多的肝癌患者受益于根治性手術(shù)切除，但術(shù)后5年復(fù)發(fā)率仍高達(dá)70%[1]；術(shù)后預(yù)防性肝動(dòng)脈化療栓塞（transarterial chemoembolization，TACE）是肝癌根治性切除術(shù)后常用的預(yù)防復(fù)發(fā)手段之一，TACE能提早發(fā)現(xiàn)微病灶、微轉(zhuǎn)移，殺死殘留癌組織，提早治療，有效防止復(fù)發(fā)，提高生存率[2-4]；腫瘤增殖細(xì)胞的比例是其生物侵蝕性的重要標(biāo)志，核抗原Ki-67免疫組化檢測(cè)是評(píng)估細(xì)胞增殖最常用的方法[5]；目前許多研究已報(bào)道Ki-67的表達(dá)與肝癌預(yù)后密切相關(guān)[6-7]；而Ki-67評(píng)分與肝癌根治性切除術(shù)后行預(yù)防性TACE患者預(yù)后關(guān)系未曾被報(bào)道。因此，本文采用免疫組化法對(duì)我院150例肝癌根治性切除術(shù)后行預(yù)防性TACE患者的肝癌組織進(jìn)行Ki-67檢測(cè)，探討Ki-67評(píng)分與預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 病例資料

采用回顧性隊(duì)列研究，收集150例肝癌根治性切除術(shù)后行預(yù)防性TACE患者的臨床病理資料，其中男130例，女20例，中位年齡55（26～76）歲。Ki-67陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)波動(dòng)于2%～97%，平均（20.42±1.24）%，中位數(shù)為20%；根據(jù)Ki-67

陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)的中位數(shù)進(jìn)行分組：Ki-67評(píng)分≤20%為低表達(dá)組，Ki-67評(píng)分＞20%為高表達(dá)組，低表達(dá)組44例，高表達(dá)組106例。納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴ 術(shù)后病理確診為肝細(xì)胞性肝癌；⑵ 術(shù)前肝功能Child-Pugh分級(jí)A級(jí)；⑶ 手術(shù)為根治性手術(shù)；⑷ 術(shù)后只接受1次TACE；⑸ 術(shù)前未接受其他抗腫瘤治療（如射頻、TACE、免疫治療等）；⑹ 沒有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或手術(shù)禁忌。排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴ 術(shù)前發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；⑵ 合并其他原發(fā)性惡性腫瘤；⑶ 合并影像學(xué)及肉眼可見的膽管或血管癌栓；⑷ 術(shù)前接受其他非手術(shù)治療；⑸ 臨床病理資料不全。復(fù)發(fā)標(biāo)準(zhǔn)：增強(qiáng)CT、增強(qiáng)MRI及超聲造影中兩項(xiàng)檢查發(fā)現(xiàn)肝癌典型“快進(jìn)快出”特征確診。本研究通過醫(yī)院倫理委員會(huì)審批，批號(hào)為（No.2018-042-01）。

1.2 方法

1.2.1 肝癌根治性切除術(shù)中判斷標(biāo)準(zhǔn)：⑴ 肝靜脈、門靜脈、膽管以及下腔靜脈未見肉眼癌栓；⑵ 無鄰近臟器侵犯，無肝門淋巴結(jié)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；⑶ 肝臟切緣距腫瘤邊界＞1 cm；如切緣＜1 cm，但切除肝斷面組織學(xué)檢查無腫瘤細(xì)胞殘留，即切緣陰性。術(shù)后判斷標(biāo)準(zhǔn)：⑴ 術(shù)后2個(gè)月行超聲、CT、MRI（必須有其中兩項(xiàng)）檢查未發(fā)現(xiàn)腫瘤病灶；⑵ 如術(shù)前AFP升高，則要求術(shù)后2個(gè)月AFP定量測(cè)定，其水平在正常范圍[8]。

1.2.2 解剖性肝切除與非解剖性肝切除解剖性肝切除標(biāo)準(zhǔn)：進(jìn)腹后行術(shù)中B超定位，確定擬切除的肝實(shí)質(zhì)范圍。在對(duì)第一肝門進(jìn)行解剖時(shí)，根據(jù)預(yù)切除肝臟的范圍，解剖、離斷預(yù)切除肝臟的肝動(dòng)脈、門靜脈。若行肝右前、右后葉、左內(nèi)葉、左外葉、左半肝、右半肝和右三葉切除時(shí)應(yīng)在第一肝門處離斷供應(yīng)上述肝實(shí)質(zhì)的門靜脈及肝動(dòng)脈分支。肝實(shí)質(zhì)離斷用鉗夾法。常規(guī)在切肝時(shí)與Glisson鞘一起離斷肝管，而不在肝門處游離。對(duì)肝斷面一般不縫合處理。非解剖性肝切除標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)預(yù)切除肝臟的部位和大小相應(yīng)的肝血管阻斷方法，本組所有患者均采用Pringle入肝血流阻斷法。在距離腫瘤邊界1～2 cm處電刀電凝標(biāo)記出預(yù)切除線。鉗夾法離斷肝實(shí)質(zhì)切除腫瘤[9]。

1.2.3 預(yù)防性TACE采用Seldinger法，即經(jīng)皮穿刺右股動(dòng)脈，先超選至肝固有動(dòng)脈，注入化療藥物 5-FU 750 mg 及奧沙利鉑 150 mg，微導(dǎo)管超選至腫瘤供血分支，注入碘油與表柔比星30 mg的混合乳液，可加用明膠海綿顆粒，根據(jù)病灶大小，血供情況還可以選擇載藥微球，PVA栓塞顆粒等栓塞材料，栓塞以腫瘤滋養(yǎng)血管不顯影為度；TACE治療時(shí)間為根治性切除術(shù)后2個(gè)月內(nèi)。

圖1 免疫組化檢測(cè)Ki-67在肝癌中組織中的表達(dá) A：Ki-67低表達(dá)（×200）；B：Ki-67高表達(dá)（×200）；C：Ki-67低表達(dá)（×400）；D：Ki-67高表達(dá)（×400）Figure1 Immunohistochemical staining for Ki-67expression of in liver cancer tissue A:Low Ki-67 expression (×200)；B:High Ki-67 expression (×200)；C:Low Ki-67 expression (×400)；D:High ki-67 expression (×400)

1.2.4 Ki-67檢測(cè)所有患者的腫瘤組織樣本均采用免疫染色法[10]進(jìn)行分析。所有肝癌的組織標(biāo)本均經(jīng)過10%甲醛固定，常規(guī)脫水包埋，切成4 μm厚切片，以小鼠抗人Ki-67單克隆抗體（MIB-1，福州邁新）進(jìn)行Ki-67免疫染色，低溫孵育過夜，漂洗后用3，3'-二氨基聯(lián)苯胺（DAB，美國 DAKO 公司）顯色，最后切片用蘇木精復(fù)染。結(jié)果判定：由兩個(gè)有經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)師共同閱片，光學(xué)顯微鏡下（×400，Olympus BX53，日本）觀察細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為Ki-67陽性細(xì)胞，每張切片選取5個(gè)高倍視野隨機(jī)觀察，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，計(jì)算出每個(gè)視野的陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)，取其平均值（圖1）。

1.2.5 隨訪采用住院復(fù)查和門診電話方式進(jìn)行隨訪，患者預(yù)防性TACE術(shù)后第1年每3個(gè)月復(fù)查1次CT或MRI和血清AFP，1年后每半年復(fù)查1次CT或MRI，一旦診斷復(fù)發(fā)，根據(jù)情況行再次手術(shù)、射頻、TACE、保守治療，死亡為隨訪終止時(shí)間，隨訪時(shí)間截至2018年1月31日。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用χ2檢驗(yàn)對(duì)分類數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，用Kaplan-Merier方法估算無病生存期（DFS）和總生存期（OS），采用多變量Cox回歸模型的正演方法，進(jìn)行單因素及多因素分析。P＜0.05均被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 22.0進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1 臨床病理資料分析

分析結(jié)果顯示，K i-6 7評(píng)分高低與腫瘤數(shù)目、腫瘤包膜有無、是否合并微血管癌栓有明顯關(guān)系（均P＜0.05），而與性別、年齡、凝血酶原時(shí)間（PT）、總膽紅素（TBIL）水平、白蛋白（ALB）水平、HBV-DNA載量、AFP水平、是否合并肝硬化、手術(shù)方式、腫瘤部位、腫瘤大小、切緣距離、分化程度均無明顯關(guān)系（均P＞0.05）（表1）。

表1 Ki-67表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系[n（%）]Table1 Relations of Ki-67 expression with the clinicopathologic factors[n (%)]

2.2 影響肝癌根治性切除術(shù)后行預(yù)防性TACE患者DFS及OS的單因素及多因素分析

影響DFS單因素分析：AFP＞400 ng/mL、非解剖性肝切除、腫瘤多發(fā)、腫瘤大、Ki-67高表達(dá)為DFS的影響因素（均P＜0.05）；影響DFS多因素分析：腫瘤多發(fā)、腫瘤大、Ki-67高表達(dá)為影響DFS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（均P＜0.05）（表2）。影響OS單因素分析：男性、腫瘤多發(fā)、腫瘤大、腫瘤包膜不完整、合并微血管癌栓、Ki-67高表達(dá)為OS的影響因素影（均P＜0.05）；影響OS多因素分析：腫瘤多發(fā)、腫瘤大、腫瘤包膜不完整、合并微血管癌栓、Ki-67高表達(dá)為影響OS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（均P＜0.05）（表3）。

表2 原發(fā)性肝癌根治性切除術(shù)后行預(yù)防性TACE患者DSF危險(xiǎn)因素分析Table2 Analysis of the risk factors for DSF in patients with prophylactic TACE after radical hepatectomy for primary liver cancer

表3 原發(fā)性肝癌根治性切除術(shù)后行預(yù)防性TACE患者OS危險(xiǎn)因素分析Table3 Analysis of the risk factors for OS in patients with prophylactic TACE after radical hepatectomy for primary liver cancer

2.3 Ki-67評(píng)分與肝癌根治性切除術(shù)后行預(yù)防性TACE患者DFS及OS關(guān)系

低表達(dá)組和高表達(dá)組復(fù)發(fā)率分別為37.7%和57.9%，兩組患者無瘤生存期差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.777，P＜0.05）。低表達(dá)組和高表達(dá)組患者生存率分別為75.9%和45.6%，兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=8.447，P＜0.05）（圖2）。

圖2 Ki-67高表達(dá)組與低表達(dá)組患者Kaplan-Meier生存曲線 A：DFS曲線；B：OS曲線Figure2 Kaplan-Meier survival curves of the patients in high and low Ki-67 expression groups A:DFS curves；B:OS curves

3 討 論

肝癌根治性切除術(shù)后行預(yù)防性TACE能提早發(fā)現(xiàn)微病灶、微轉(zhuǎn)移，殺死殘留癌組織，改善患者預(yù)后[11-12]，且載藥微球與傳統(tǒng)碘油栓塞效果無顯著差別[13]；近年來，許多學(xué)者提出僅部分肝癌患者能從預(yù)防性TACE中獲益，研究[2,14-15]發(fā)現(xiàn)按MVI等級(jí)分組后合并MVI組更能從預(yù)防性TACE治療中獲益；Liao等[16]指出當(dāng)肝癌直徑＞5 cm更能從預(yù)防性TACE治療中獲益；Hsiao等[17]發(fā)現(xiàn)在多發(fā)性肝癌的患者中，肝內(nèi)轉(zhuǎn)移比多中心起源的患者更能從預(yù)防性TACE治療中獲益；此外，Huang等[18]結(jié)合腫瘤包膜、腫瘤大小、腫瘤數(shù)目、腫瘤切緣及MVI設(shè)計(jì)預(yù)防性TACE治療獲益評(píng)分系統(tǒng)，得分越高，越能從中獲益。本文旨在探討Ki-67評(píng)分與肝癌根治性切除術(shù)后行預(yù)防性TACE患者預(yù)后關(guān)系。

腫瘤細(xì)胞的增殖狀態(tài)是反應(yīng)腫瘤生物學(xué)特性的重要參數(shù)[19]，影響腫瘤術(shù)后治療的有效性；Ki-67是一種傳統(tǒng)的增殖標(biāo)志物，在細(xì)胞周期的G1、S和G2期達(dá)到高峰，而在G0期缺失，在許多腫瘤中高表達(dá)，Ki-67標(biāo)志物的變化能可靠地反映正常和病變組織的增殖活性，對(duì)腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移有預(yù)測(cè)作用；眾多研究已報(bào)道Ki-67與腫瘤臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，包括：乳腺癌、垂體腺瘤、喉癌、腎上腺皮質(zhì)癌、套淋巴瘤和卵巢癌等[20-24]。目前很多研究表明Ki-67與肝癌預(yù)后密切相關(guān)[25-29]，肝癌組織Ki-67高表達(dá)常常與組織分化差、腫瘤大、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管侵犯及肝外轉(zhuǎn)移相關(guān)；有研究表明，Ki-67降低細(xì)胞間的黏附力，使腫瘤細(xì)胞從腫瘤分離并與細(xì)胞外基質(zhì)黏附，能促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移[30]，本研究同樣發(fā)現(xiàn)，在Ki-67高低表達(dá)組中，腫瘤包膜是否完整、腫瘤數(shù)目、是否合并微血管癌栓的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與上述研究結(jié)果相仿。

以往的研究中[2,15,18]表明，肝癌根治性術(shù)后合并高危因素如腫瘤大、MVI、腫瘤多發(fā)等建議行TACE術(shù)，Ki-67常常與這些肝癌復(fù)發(fā)高危因素相關(guān)[31]；然而本研究結(jié)果提示，在肝癌根治性切除術(shù)后行預(yù)防性TACE患者中，Ki-67低表達(dá)組無瘤生存期及總生存期均超過Ki-67高表達(dá)組，原因可能是預(yù)防性TACE僅僅行肝動(dòng)脈栓塞，而Ki-67高表達(dá)組微血管侵犯率高于低表達(dá)組（64.15% vs.50%，P＜0.05），導(dǎo)致早期復(fù)發(fā)，影響預(yù)后；因此，在評(píng)估原發(fā)性肝癌根治術(shù)后行預(yù)防性TACE患者預(yù)后時(shí)，Ki-67表達(dá)可能是一個(gè)重要參考指標(biāo)。

本研究多因素分析結(jié)果顯示腫瘤多發(fā)、腫瘤大、Ki-67高表達(dá)是影響肝癌根治性切除術(shù)患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，這與以往的報(bào)道相一致；研究[32]顯示腫瘤的直徑＜5 cm的肝癌患者根治術(shù)后5年生存率為58.2%、10年生存率為38.4%，而腫瘤直徑＞5 cm的肝癌患者根治術(shù)后5年生存率下降至31.4%、10年生存率降至20.43%；研究[33]顯示腫瘤單發(fā)的肝癌患者根治術(shù)后5年生存率為65.8%，而腫瘤多發(fā)的肝癌患者根治術(shù)后5年生存率下降至45.8%。

本研究仍有如下不足：⑴ 單中心并且是回顧性研究，一個(gè)前瞻、多中心、隨機(jī)的臨床試驗(yàn)是需要的；⑵ 本研究未納入丙型肝炎、酒精性肝炎及脂肪肝相關(guān)性肝癌；⑶ 患者復(fù)發(fā)后不同治療方式可能影響研究結(jié)果，需進(jìn)一步探究。

綜上所述，Ki-67高表達(dá)為肝癌根治性切除術(shù)后行預(yù)防性TACE患者預(yù)后不良因素之一。