以壞死并血管侵犯為關(guān)鍵要素的肝細(xì)胞癌T“N”M分期系統(tǒng)的建立及其準(zhǔn)確性初步評估

王志明，何東任，鐘鑒宏，王棟，胡寬，李娟妮，陶一明

（中南大學(xué)湘雅醫(yī)院 1.普通外科 3.病理科，湖南 長沙410008；2.廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 肝膽外科，廣西 南寧530021）

分期系統(tǒng)對于指導(dǎo)肝細(xì)胞癌（HCC，以下簡稱肝癌）治療和預(yù)測患者生存時(shí)間尤為重要[1-2]。新近美國癌癥聯(lián)合委員會(huì)（AJCC）將肝癌TNM分期更新至第8版，本次更新特色推動(dòng)了新一輪肝癌臨床預(yù)后和預(yù)測評價(jià)體系的完善和提高。TNM分期系統(tǒng)指出，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況是腫瘤手術(shù)中一個(gè)明確的預(yù)后因素，對患者的長期生存影響顯著。但AJCC第8版肝癌分期系統(tǒng)并未對N（區(qū)域淋巴結(jié)）和M（遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移）進(jìn)行更新[3]。鑒于伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肝癌在臨床少見，檢測率低，故N在分期系統(tǒng)中的預(yù)測價(jià)值可能存在一定局限性，是否存在其他臨床病理指標(biāo)能更好的彌補(bǔ)TNM分期N分期標(biāo)準(zhǔn)的預(yù)測效能不足，目前尚不清楚。筆者前期的研究已經(jīng)證實(shí)，肝癌有或者無出血壞死病理改變和腫瘤侵襲表型存在一定內(nèi)在關(guān)系，是腫瘤微環(huán)境和腫瘤異質(zhì)性的一種重要病理學(xué)標(biāo)志物，與肝癌預(yù)后不良相關(guān)[4-5]。因此，中南大學(xué)湘雅醫(yī)院肝癌治療與研究團(tuán)隊(duì)以腫瘤壞死（necrosis）是否伴有血管侵犯為關(guān)鍵因素，首次提出并嘗試構(gòu)建T（腫瘤）“N”（壞死+血管侵犯）M（遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移）新的分期系統(tǒng)，以期為肝癌的精準(zhǔn)臨床分期提供參考。

1 資料與方法

1.1 肝癌組織樣本收集

本課題研究內(nèi)容已報(bào)中南大學(xué)湘雅醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)和廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院倫理委員會(huì)審批備案，同意實(shí)施（編號N201303033；GXTH802）。肝癌確診根據(jù)2010年版世界衛(wèi)生組織（WHO）病理診斷標(biāo)準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：未接受過診斷性穿刺活檢和治療（介入、射頻消融、放療和抗血管分子靶向藥物）。TNM分期研究隊(duì)列共236例，為2010年1月—2011年3月間于中南大學(xué)湘雅醫(yī)院肝臟外科行手術(shù)切除的肝癌患者。微血管侵犯研究驗(yàn)證隊(duì)列共102例，為2017年10月—2018年5月間于廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院肝膽外科行手術(shù)切除的肝癌患者，均已被告知并簽署書面知情同意書。

1.2 肝癌切除術(shù)后隨訪

術(shù)后定期隨訪的監(jiān)測內(nèi)容：主要是肝臟B超、CT及MRI等影像學(xué)檢查、甲胎蛋白（AFP）和肝功能檢查。隨訪頻率：術(shù)后2年內(nèi)每3個(gè)月1次；2年以后，每6個(gè)月1次。隨訪方式：主要通過患者家屬電話、單位工會(huì)及實(shí)地隨訪等，無1例失訪。

1.3 肝癌組織樣本研究

擴(kuò)大肝癌組織標(biāo)本采集方法，即手術(shù)切除肝癌標(biāo)本最大直徑截面，厚度約1.0～1.5 cm，腫瘤及癌旁肝組織完整取材，分割成全框石蠟包埋大小，切片進(jìn)行蘇木素染色和Mason染色，封片。使用Pannoramic Scan數(shù)字切片掃描儀（3DHISTECH，Budapest，Hungary）高通量玻片掃描，CaseViewer圖像處理軟件分析閱片。肝癌腫瘤出血、壞死標(biāo)準(zhǔn)參考Hu等[6]文獻(xiàn)報(bào)道。微血管侵犯病理診斷標(biāo)準(zhǔn)參考Roayaie等[7]文獻(xiàn)報(bào)道。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用Log-rank檢驗(yàn)修改版T“N”M分期和美國AJCC第8版TNM分期法對預(yù)后的影響，計(jì)算對數(shù)線性趨勢χ2檢驗(yàn)（linear trend χ2test）以及C指數(shù)（C-index）、赤池準(zhǔn)則（Akaike information criterion，AIC）、受試者操作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC）來評估兩者不同分期系統(tǒng)的檢驗(yàn)效能大小。

2 結(jié) 果

2.1 肝癌患者腫瘤壞死和微血管侵犯發(fā)生率

通過采用擴(kuò)大肝癌腫瘤及癌旁肝組織采集范圍的生物樣本研究方法，病理組織學(xué)檢查腫瘤壞死和微血管侵犯（圖1），中南大學(xué)湘雅醫(yī)院和廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院肝癌隊(duì)列組織標(biāo)本，腫瘤組織壞死發(fā)生率分別為75.4%（177/236）、59.8%（61/102）；微血管侵犯檢出率分別為71.6%（169/236）、86.2%（88/102）（圖2）。

圖1 擴(kuò)大腫瘤及癌旁肝組織采集檢測腫瘤壞死和微血管侵犯Figure1 Expanded tumor and adjacent liver tissue collection to detect tumor necrosis and microvascular invasion

圖2 湘雅隊(duì)列和廣西隊(duì)列肝癌微血管侵犯陽性診斷率Figure2 Positive diagnosis rate of microvascular invasion in HCC tissues from Xiangya and Guangxi cohort

2.2 肝癌患者肝切除伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率的文獻(xiàn)分析

以醫(yī)學(xué)主題標(biāo)題（MeSH）“Hepatocellular carcinoma”和“Lymph Node Metastases”為關(guān)鍵詞，文獻(xiàn)檢索肝癌伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)文獻(xiàn)：PubMed（174篇）、Cochrane Library（11篇），Springer（195篇），Embase數(shù)據(jù)庫（71篇）、CBM（138篇）、CNKI（211篇）、VIP（56篇）。結(jié)果顯示，肝癌肝切除治療過程中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生率為0.8%～8.33%（表1）。

2.3 腫瘤壞死和血管侵犯預(yù)測預(yù)后的價(jià)值

以壞死、血管侵犯情況為狀態(tài)變量分析湘雅醫(yī)院236例肝癌隨訪生存數(shù)據(jù)，繪制ROC曲線，壞死和血管侵犯聯(lián)合預(yù)測復(fù)發(fā)及1、3、5年整體生存（OS）的ROC曲線下面積分別為0.940、0.834、0.748、0.721，高于壞死或血管侵犯單獨(dú)應(yīng)用的預(yù)測效能（表2），壞死和血管侵犯聯(lián)合提高了對肝癌患者存活率的預(yù)測能力。

表1 文獻(xiàn)報(bào)道肝癌伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移發(fā)生率Table1 Incidence of HCC with lymph node metastasis reported in the literature

表2 ROC曲線評價(jià)壞死和血管侵犯對肝癌患者復(fù)發(fā)和OS預(yù)測Table2 ROC curve assessment of the predictive effect of necrosis and vascular invasion for recurrence and OS in HCC patients

2.4 T“N”M分期與第8版TNM分期比較

基于上述研究結(jié)果，筆者嘗試在AJCC肝癌TNM分期系統(tǒng)中排除T分期中血管侵犯因素，以“N”分期（壞死+血管侵犯）替換N分期（淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移），建立修改版的T“N”M分期（表3-4）。與第8版TNM分期系統(tǒng)相比較，Kaplan-Meier分析OS結(jié)果顯示，修改版T“N”M分期方法能夠有效區(qū)分236例肝癌中Ia和Ib、IIIa和IIIc期患者預(yù)后（圖3）。

表3 肝癌AJCC第8版TNM分期系統(tǒng)與修改版T“N”M分期系統(tǒng)區(qū)別Table3 Differences between the AJCC 8th edition TNM staging system and the modified T“N”M staging system for HCC

表4 修改版肝癌T“N”M分期系統(tǒng)Table4 The modified T“N”M staging system for HCC

圖3 第8版AJCC分期和修改版T“N”M分期進(jìn)行分組的肝癌患者各期生存曲線Figure3 Survival curves of HCC patients grouped by the AJCC 8th edition staging system and the modified T“N”M staging system

2.5 修改版T“N”M分期與第8版TNM分期預(yù)測效能比較

與第8版TNM分期系統(tǒng)相比較，修改版T“N”M分期5年生存率的C指數(shù)和對數(shù)線性趨勢χ2檢驗(yàn)值高于第8版TNM分期系統(tǒng)的對應(yīng)值（0.672/0.537；0.732/0.626），而AIC值（1 798.142）則小于他們的對應(yīng)值（1 806.256）。

3 討 論

自法國人Pierre Denoix首次提出至1977年美國癌癥聯(lián)合委員會(huì)（AJCC）第1版癌癥TNM分期系統(tǒng)發(fā)行至今已歷時(shí)50余年。TNM分期系統(tǒng)是目前國際上最為通用的腫瘤分期系統(tǒng)，每一種腫瘤的TNM分期系統(tǒng)各不相同。目前已經(jīng)成為臨床醫(yī)生和醫(yī)學(xué)研究人員對于惡性腫瘤進(jìn)行分期的標(biāo)準(zhǔn)方法。TNM病理分期可以幫助更加正確的理解患者的疾病特點(diǎn)而指導(dǎo)治療。隨著人們對肝癌認(rèn)知的不斷加深，TNM分期系統(tǒng)也在不斷的得以調(diào)整和改進(jìn)。最新AJCC第8版TNM分期系統(tǒng)的再次更新，主要對肝癌原發(fā)瘤（T）的定義在第7版的基礎(chǔ)上做出了不同程度的細(xì)化和修訂。但AJCC第8版肝癌分期系統(tǒng)并未對區(qū)域淋巴結(jié)（N）和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（M）進(jìn)行更新。

N分期和M分期是TNM分期系統(tǒng)兩大構(gòu)成要素。國際抗癌聯(lián)盟（IUCC）腫瘤分期系統(tǒng)指出，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況是腫瘤手術(shù)中一個(gè)明確的判斷惡性腫瘤預(yù)后因素，是確定疾病程度和指導(dǎo)臨床治療的重要依據(jù)。本研究分析文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)，肝癌肝切除治療過程中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生率為0.8%～8.33%。而在尸檢中發(fā)現(xiàn)肝癌合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者為25.5%[8]。但在肝癌分期系統(tǒng)中的作用甚少提及，說明淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移作為TNM分期金標(biāo)準(zhǔn)可能存在一定局限性而常被忽略。此外美國SEER數(shù)據(jù)庫研究顯示：肝外轉(zhuǎn)移（extrahepatic metastasis）發(fā)生率為14.3%（342例），最常見的部位是肺部（39.5%），其次是骨骼（25.4%）和腎上腺（8.8%）及腦（1.2%）[9-10]。多項(xiàng)研究結(jié)果顯示：70%～89%肝癌合并肝外轉(zhuǎn)移患者死于肝內(nèi)腫瘤進(jìn)展所致的肝衰竭，而非肝外轉(zhuǎn)移[11]。而臨床實(shí)際中發(fā)現(xiàn)，肝癌仍以發(fā)生肝內(nèi)轉(zhuǎn)移擴(kuò)散模式和血管受累最為常見。眾所周知，肝癌的腫瘤生物學(xué)異質(zhì)性是影響預(yù)測患者預(yù)后的關(guān)鍵。例如腫瘤大小，數(shù)量，位置，MVI和是否存在包膜。這些病理特征被廣泛接受為肝癌的重要預(yù)后指標(biāo)[12]。

新的證據(jù)表明，壞死是許多實(shí)體腫瘤惡性病理表型，包括肺癌、腎癌、結(jié)腸癌、甲狀腺癌、乳腺癌等，壞死可以作為預(yù)測不良預(yù)后的腫瘤標(biāo)志[13]。病理組織學(xué)檢查證實(shí)，腫瘤組織中的壞死病理特征為凝固性干酪樣壞死，周圍伴有大量炎癥細(xì)胞浸潤，出現(xiàn)區(qū)域性細(xì)胞增殖表型，具有促進(jìn)腫瘤生長的作用，即壞死后和繼發(fā)性生長，也稱之為“壞死性腫瘤生長”[14-15]?，F(xiàn)已研究發(fā)現(xiàn)“N”和腫瘤缺氧的發(fā)生是驅(qū)動(dòng)血管生成的主要因素[16]。而且研究表明壞死不是孤立的病理特征，與腫瘤侵襲性特征相關(guān)，腫瘤壞死在促使腫瘤轉(zhuǎn)移中起重要作用[17]。正是由于存在這種形式的腫瘤壞死，壞死被證實(shí)是肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌（ICC）不良預(yù)后腫瘤標(biāo)志物[18]。既往的研究結(jié)果顯示，在腫瘤壞死微環(huán)境中，原發(fā)性肝癌的侵襲性腫瘤表型驅(qū)動(dòng)腫瘤生長更快，并且通常與轉(zhuǎn)移的形成相關(guān)[19]。壞死是一個(gè)肝癌重要的預(yù)后變量。例如肝癌結(jié)節(jié)經(jīng)肝動(dòng)脈化療栓塞（TACE）治療后，壞死＞90%的臨界值仍然是治療后更好生存的獨(dú)立因素。反之，部分壞死則有促進(jìn)肝癌復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)[20-21]。筆者臨床研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)“N”發(fā)生率顯著高于較N（淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移）和M（肝外轉(zhuǎn)移），存在臨床分期及預(yù)后評估實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。據(jù)此，將“N”（壞死）作為腫瘤狀況指標(biāo)和TNM分期整合一起，結(jié)果顯示能更好的進(jìn)行肝癌臨床分期?！癗”臨床病理指標(biāo)可能成為是TNM分期構(gòu)成要素的一個(gè)重要補(bǔ)充。

更新的肝癌第8版TNM分期系統(tǒng)，將原來的T1期（單發(fā)腫瘤，不伴有血管侵犯）腫瘤分為T1a（單發(fā)腫瘤直徑≤2 cm）和T1b（單發(fā)腫瘤直徑＞2 cm，不伴有血管侵犯），而T2期相應(yīng)地由單發(fā)腫瘤伴血管侵犯調(diào)整為單發(fā)腫瘤直徑＞2 cm伴血管侵犯。與研究報(bào)道結(jié)果相一致，小肝癌預(yù)后良好不受微血管侵犯的影響，而與組織學(xué)分級、隱匿的衛(wèi)星結(jié)節(jié)及肝功能有關(guān)[22]。另一方面，第8版TNM分期系統(tǒng)對III期的亞分類進(jìn)行了調(diào)整。將原來的T3a（多發(fā)腫瘤直徑＞5 cm）獨(dú)立為T3，而將原來的T3b（腫瘤侵犯門靜脈或肝靜脈的主要分支）合并到T4。與第7版相比，第8版的鑒別值略有改善；但在IB/II期和IIIB/IVA期間仍觀察到顯著的結(jié)果重疊[23]。理想的腫瘤分期系統(tǒng)應(yīng)滿足：⑴ 分期中各期相應(yīng)的最終結(jié)局差別明顯；⑵ 同一分期中臨床結(jié)局差別小。更新第8版TNM分期系統(tǒng)的合理性仍須大量臨床數(shù)據(jù)的驗(yàn)證[24]。N（區(qū)域淋巴結(jié)）在TNM分期系統(tǒng)中的臨床應(yīng)用價(jià)值的局限性已引起同道的關(guān)注[25]。筆者利用肝癌“N”（壞死+血管侵犯）和TNM分期病理指標(biāo)整合，能夠清晰區(qū)分IIIa和IIIc期肝癌患者預(yù)后，可以克服N（區(qū)域淋巴結(jié)）預(yù)測效能低及TNM分期漂移的缺點(diǎn)，達(dá)到精準(zhǔn)肝癌分期，指導(dǎo)個(gè)體化治療的目的，是腫瘤分期一個(gè)全新的領(lǐng)域。期待以后能將“N”（壞死+血管侵犯）作為腫瘤狀況指標(biāo)與加入肝功能影響綜合考慮，納入肝癌臨床分期系統(tǒng)。兼顧對肝癌分期認(rèn)識的準(zhǔn)確性和臨床診斷實(shí)踐的易行性。