枸杞HPLC 指紋圖譜的建立及3 種成分測(cè)定

白光燦, 李婭琦, 張澤坤, 郭慧清, 王梓軒, 李 月, 馬長(zhǎng)華

(北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院,北京100102)

枸杞為茄科植物寧夏枸杞Lycium barbarum L.的干燥成熟果實(shí),是我國(guó)傳統(tǒng)名貴藥材,具有調(diào)節(jié)免疫功能、保肝、抗氧化損傷、抗腫瘤等藥理作用［1-3］,一般認(rèn)為與其所含枸杞多糖、類胡蘿卜素和黃酮等活性成分相關(guān)［4-6］。早期研究主要針對(duì)枸杞多糖和黃酮類,近年來(lái)開(kāi)始關(guān)注類胡蘿卜素類,并發(fā)現(xiàn)其在人體內(nèi)的多種生物活性,作為VA的來(lái)源治療皮膚角化癥、猝滅單線態(tài)氧、清除自由基、防止細(xì)胞膜損傷、調(diào)控機(jī)體免疫應(yīng)答等［7］。目前,枸杞質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)未對(duì)類胡蘿卜素類含有量進(jìn)行限量要求,文獻(xiàn)也主要集中在不同成熟度、加工方式枸杞中其含有量變化方面［8-10］,但關(guān)于其指紋圖譜及不同產(chǎn)地聚類分析的研究較少［11］。本實(shí)驗(yàn)從指紋圖譜和指標(biāo)成分含有量測(cè)定2 方面同時(shí)對(duì)枸杞質(zhì)量進(jìn)行定性和定量評(píng)價(jià),旨在為藥材質(zhì)量的全面評(píng)價(jià)提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Thermo Scientific Ultimate 3000 高效液相色譜儀(美國(guó)賽默飛公司)；KQ-400KDE 高功率數(shù)控超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司)；Mettler AE240 電子分析天平(十萬(wàn)分之一,法國(guó)施耐德電器有限公司)；Sartorius AG BS電子分析天平(萬(wàn)分之一,法國(guó)施耐德電器有限公司)。

1.2 試藥與試劑 二氯甲烷、正己烷、乙腈、甲醇(色譜級(jí),美國(guó)Fisher 公司)； 石油醚、 丙酮 (色譜純, 德國(guó)Merck 公司)；甲醇、無(wú)水乙醇,分析純(北京化工廠)；娃哈哈純凈水(杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司)。對(duì)照品玉米黃素(河南省標(biāo)物生物科技有限公司,批號(hào)170417,含有量≥98%)、β-胡蘿卜素(河南省標(biāo)物生物科技有限公司,批號(hào)170108,含有量≥98%)、玉米黃素雙棕櫚酸酯(上海同田生物技術(shù)股份有限公司,批號(hào)144-67-2,含有量≥98%)。

1.3 藥材 收集寧夏、甘肅、新疆、青海和內(nèi)蒙古5 個(gè)產(chǎn)地共35 批枸杞樣品,經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)劉春生教授鑒定鑒定為茄科植物寧夏枸杞Lyciumbarbarum L.的干燥成熟果實(shí)。信息見(jiàn)表1。

表1 樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Diamonsil C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流動(dòng)相乙腈-甲醇-正己烷-二氯甲烷 (40 ∶15 ∶20 ∶20)； 體積流量1 mL/min； 柱溫25 ℃； 檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm；進(jìn)樣量10 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 取玉米黃素、β-胡蘿卜素適量,分別精密稱定1.04、2.13 mg,加入二氯甲烷溶解后,流動(dòng)相分別定容于10、100 mL 量瓶中；取玉米黃素雙棕櫚酸酯適量,精密稱定9.21 mg,加入玉米黃素、β-胡蘿卜素對(duì)照品溶液各1 mL 后,流動(dòng)相定容于5 mL 量瓶中,即得。玉米黃素、β-胡蘿卜素、玉米黃素雙棕櫚酸酯質(zhì)量濃度分別為20.80 μg/mL、4.26 μg/mL、1.84 mg/mL。

2.2.2 供試品溶液 提取方法參考陳敏［12］報(bào)道并進(jìn)行調(diào)整。稱取1 g 枸杞粉末,精密稱定,加入0.01%BHT(二丁基羥基甲苯),15 mL 石油醚-丙酮(2 ∶1) 混合溶劑常溫提取3 次至殘?jiān)鼰o(wú)色,每次30 min,合并提取液,轉(zhuǎn)入分液漏斗,蒸餾水洗去水溶性成分,石油醚層用無(wú)水硫酸鈉干燥,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干,石油醚定容至25 mL,微孔濾膜過(guò)濾,取續(xù)濾液,即得。提取過(guò)程避光。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液10 μL,在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6 次,以1 號(hào)峰玉米黃素為參照峰,得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD 0.44%～2.57%,相對(duì)峰面積RSD 0.94%～2.84%,表明儀器精密度良好。

2.3.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次枸杞粉末6 份,制備供試品溶液,精密吸取10 μL,在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣,以1 號(hào)峰玉米黃素為參照峰,各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD 1.32%～2.93%,相對(duì)峰面積RSD 1.21%～2.85%,表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液,在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下于0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣,各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD 0.98%～2.59%,相對(duì)峰面積RSD 1.41%～2.52%,表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4 指紋圖譜建立

2.4.1 相似度評(píng)價(jià) 選取寧夏、甘肅、青海、新疆每個(gè)產(chǎn)地各3 批次枸杞藥材的HPLC 圖,導(dǎo)入中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)中,選擇中位數(shù)計(jì)算方法,確定最佳時(shí)間窗寬度為0.1 min,采用多點(diǎn)校正,經(jīng)過(guò)色譜峰自動(dòng)匹配,生成對(duì)照?qǐng)D譜,進(jìn)行色譜峰整體相似性評(píng)價(jià),見(jiàn)圖1,不同產(chǎn)地12 批樣品HPLC 色譜圖整體峰形一致,相似度0.924 ～0.991,見(jiàn)表2,表明不同產(chǎn)地枸杞化學(xué)成分相近,具有較好的均一性。共標(biāo)定9 個(gè)共有峰,保留時(shí)間為2.01 min 處的1 號(hào)色譜峰響應(yīng)較高,分離良好,故選作參照峰。

圖1 12 批樣品HPLC 指紋圖譜

2.4.2 聚類分析 采用SPSS 22.0 軟件將35 批樣品9 個(gè)共有峰峰面積作為原始數(shù)據(jù)進(jìn)行系統(tǒng)分析,結(jié)果見(jiàn)圖2,可知主要分為2 大類,其中產(chǎn)地為寧夏、青海的聚為一類,新疆、甘肅、內(nèi)蒙古的聚為一類,表明青海、寧夏枸杞在化學(xué)成分方面具有較高的一致性。

2.5 含有量測(cè)定

2.5.1 色譜條件 在“2.1” 項(xiàng)下色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定,色譜圖見(jiàn)圖3。

2.5.2 溶液制備 按“2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品、對(duì)照品溶液。

2.5.3 線性關(guān)系考察 取“2.2.1” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液2、1、0.5、0.25、0.1 mL,定容于5 mL 量瓶中,包括未稀釋的混合對(duì)照品溶液共6 個(gè)不同質(zhì)量濃度,在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣。以峰面積為縱坐標(biāo)(Y),質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X) 進(jìn)行回歸,結(jié)果見(jiàn)表3,表明各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖2 35 批樣品聚類樹(shù)狀圖

圖3 各成分HPLC 色譜圖

表3 各成分線性關(guān)系

2.5.4 精密度試驗(yàn) 精密吸取玉米黃素、β-胡蘿卜素、玉米黃素雙棕櫚酸酯對(duì)照品溶液各10 μL,在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6 次,測(cè)得峰面積RSD 0.45%～1.39%,表明儀器精密度良好。

2.5.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按“2.2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液,于0、2、4、6、8、12、24 h 在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣,測(cè)得各成分峰面積RSD 0.33%～3.84%,表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.6 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批枸杞6 份, 按“2.2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液,在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣,測(cè)得各成分含有量RSD 1.15%～4.61%,表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.7 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取含有量已知的寧夏1 號(hào)樣品0.5 g,平行6 份,精密加入一定量(近似1 ∶1) 對(duì)照品溶液,按 “2.2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液,在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣,計(jì)算回收率。結(jié)果,玉米黃素、β 胡蘿卜素、玉米黃素雙棕櫚酸酯平均加樣回收率分別為96.50%、 97.23%、 103.2%, RSD 分 別 為2.71%、2.94%、3.73%。

2.5.8 樣品含有量測(cè)定 精密稱取不同批次枸杞粉末各1 g,平行3 份,按“2.2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液,在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其含有量,結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 各成分含有量測(cè)定結(jié)果

3 討論與結(jié)論

3.1 條件選擇 枸杞中的類胡蘿卜素類成分主要包括類胡蘿卜素和類胡蘿卜素酯兩大部分［12］。本實(shí)驗(yàn)首先對(duì)甲醇-乙腈(45 ∶55) 流動(dòng)相體系進(jìn)行了研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲醇-乙腈體系無(wú)法洗脫出枸杞中的類胡蘿卜素酯類成分,這可能是由于類胡蘿卜酯類成分極性太小的原因。通過(guò)向流動(dòng)相中添加一定比例的正己烷和二氯甲烷,可以有效地洗脫出類胡蘿卜素酯類成分。值得注意的是,常規(guī)反相高效液相色譜儀的在線脫氣裝置對(duì)正向溶劑的耐受性較差,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)調(diào)整流動(dòng)相流路,使流動(dòng)相不經(jīng)過(guò)在線脫氣裝置直接進(jìn)入泵元件,避免了溶劑對(duì)儀器原件的損害。流動(dòng)相在使用前,需要提前混合均勻并超聲脫氣。

3.2 結(jié)果分析 由于玉米黃素雙棕櫚酸脂色譜峰占總色譜峰面積的70%以上,給相似度計(jì)算帶來(lái)較大誤差,故進(jìn)行指紋圖譜相似度匹配時(shí)舍去此峰。不同產(chǎn)地12 批樣品HPLC 色譜圖的整體峰形一致,相似度0.924～0.991。利用平均數(shù)法計(jì)算平均圖譜,作為HPLC 對(duì)照指紋圖譜為枸杞類胡蘿卜素類成分質(zhì)量評(píng)價(jià)的依據(jù)。此外,35 批樣品的聚類分析表明,寧夏、青海枸杞聚為一類,表明2 個(gè)產(chǎn)地枸杞化學(xué)成分更為相近,具有較好的均一性。

含有量測(cè)定結(jié)果表明,不同產(chǎn)地枸杞中含有的化學(xué)成分種類差異不大,但本實(shí)驗(yàn)測(cè)定的3 種成分含有量具有較大差異,最高的為玉米黃素雙棕櫚酸酯(21.03 mg/mL),以青海德令哈(S23、S18)、寧夏中寧(S8) 較高；其次為玉米黃素(0.141 8 mg/mL),以寧夏中寧(S11)、青海德令哈(S24) 較高；β-胡蘿卜素最低(0.010 6 mg/mL),以青海德令哈(S23、S24) 較高,這是由于玉米黃素和β胡蘿卜素為玉米黃素雙棕櫚酸酯的生物合成前體,隨著枸杞的生長(zhǎng)成熟,枸杞中玉米黃素雙棕櫚酸酯的含有量逐漸增加,而且是類胡蘿卜素積累的主要形式,也是成熟枸杞的特征類胡蘿卜素［9］。因此,本實(shí)驗(yàn)選擇該3 種成分作為枸杞質(zhì)量評(píng)價(jià)的指標(biāo)。

此外,通過(guò)測(cè)定不同產(chǎn)地枸杞中類胡蘿卜素含有量發(fā)現(xiàn),產(chǎn)于寧夏和青海的較高,并且更為接近,表明兩地枸杞質(zhì)量更為相似,與聚類分析結(jié)果一致。

綜上所述,本研究建立枸杞HPLC 指紋圖譜,并測(cè)定3種成分的含有量,該方法簡(jiǎn)便準(zhǔn)確,重復(fù)性好,可為該藥材質(zhì)量控制提供參考。