雷公藤甲素對子宮內(nèi)膜癌Ishikawa 細(xì)胞的影響

關(guān)崇麗, 鄭 婧, 王惠玲

(甘肅省婦幼保健院,甘肅 蘭州730050)

子宮內(nèi)膜癌是生殖系統(tǒng)最常見的婦科惡性腫瘤之一,近年來隨著人們生活節(jié)奏加快,生活方式、飲食習(xí)慣等改變,發(fā)病人群趨于年輕化,發(fā)病率逐年升高［1］,其病死率在女性惡性腫瘤中僅次于卵巢癌［2］,嚴(yán)重威脅女性生命安全。子宮內(nèi)膜癌按病理特征大致分為與雌激素有關(guān)的內(nèi)膜樣癌和與雌激素?zé)o關(guān)的漿液性癌［3］,臨床上絕大多數(shù)患者處于早期階段,常規(guī)手術(shù)切除、術(shù)后化療可獲得較好的療效和較滿意的預(yù)后,但對于處于早期且要求保留生育能力,或處于中、晚期復(fù)發(fā)型患者仍缺乏有效治療措施,亟需相關(guān)新型藥物出現(xiàn)。

雷公藤甲素是一種具有多種生理作用的三萜類成分,對多種腫瘤具有明顯抑制作用,如胰腺癌［4］、乳腺癌［5］、卵巢癌［6］、宮頸癌［7］,可能作用機(jī)制有通過PI3K-AkTmTOR 誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡［7-9］,抑制p53 激活,并與轉(zhuǎn)錄因子的亞基共價結(jié)合,抑制RNA 聚合酶參與轉(zhuǎn)錄,進(jìn)而誘導(dǎo)腫瘤凋亡與自噬的發(fā)生［6,10］, 但是否能基于PI3K-AktmTOR 通路對子宮內(nèi)膜癌Ishikawa 細(xì)胞誘導(dǎo)發(fā)生自噬、凋亡尚不清楚。因此,本實(shí)驗(yàn)探討雷公藤甲素對子宮內(nèi)膜癌Ishikawa 細(xì)胞的影響。

1 材料

人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa 細(xì)胞株購自北京協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞中心。雷公藤甲素(批號SMB00354,含有量≥98%) 購自江西省欣和科技開發(fā)公司,無菌三蒸水溶解至所需濃度, 過濾滅菌保存。 RPMI 1640 (批號AD15805337) 購自美國Life Sciences 公司；胎牛血清(批號11011-8611)、MTT(批號6041051)、胰蛋白酶(批號J150021)、BCA 試劑盒(批號P0037)、碘化丙啶(批號20160914)、 β-actin (批 號17112701)、 PI3Kp85 (批 號40912)、 p-AkT (批 號70265)、 AkT (批號80354)、 pmTOR(批號30465)、mTOR(批號20179)、兔抗鼠單克隆抗體購自英國Abcam 公司；HRP-山羊抗兔二抗(批號062017170905) 購自美國Cell Signaling Technology 公司；Trizol 試 劑 (批 號AA6901-1)、 逆 轉(zhuǎn) 錄 試 劑 盒 (批 號AK4802)、熒光擴(kuò)增試劑盒(批號AKA905) 均購自日本TaKaRa 公司。引物由寶生物工程(大連) 有限公司合成。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa 細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每2 d 更換一次培養(yǎng)基,待細(xì)胞融合至80%時用0.25%胰蛋白酶消化、傳代,取對數(shù)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2.2 細(xì)胞增殖抑制率檢測 采用MTT 法。取對數(shù)生長期的人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa 細(xì)胞,0.25%胰蛋白酶消化,調(diào)整細(xì)胞密度為1×104/孔,接種于96 孔板內(nèi),培養(yǎng)24 h 后加入0、0.5、2.0、8.0、32.0、128.0 nmol/L 雷公藤甲素,設(shè)置5 個復(fù)孔,加藥后24、48、72 h 后吸棄含藥上清,更換含10%胎牛血清的PRMI-1640 培養(yǎng)基, 每孔再加入20 μL(5 mg/mL) MTT 溶液,于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h 后小心吸棄去孔內(nèi)培養(yǎng)基,每孔加入150 μL二甲基亞砜,酶標(biāo)儀測定波長490 nm 處各孔光密度(OD)值,計算增殖抑制率。

2.3 細(xì)胞周期檢測 采用流式細(xì)胞術(shù)。取對數(shù)生長期人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa 細(xì)胞,懸液調(diào)整細(xì)胞密度為1.0×105/mL,置于6 孔板中,每孔2 mL。待細(xì)胞貼壁后移去上清液,不含血 清 培 養(yǎng)12 h 后, 加 入0、 0.5、 2.0、 8.0、 32.0、128.0 nmol/L雷公藤甲素,每組平行3 份,培養(yǎng)24 h后胰酶消化細(xì)胞使其變成單個細(xì)胞,離心收集細(xì)胞,棄上清,預(yù)冷PBS 清洗3 次,預(yù)冷70%乙醇在4 ℃下固定過夜,離心收集 細(xì) 胞, 清 洗, 重 懸, 加 入50 μg/mL RNA 酶 和100 μg/mL PI,300 目濾網(wǎng)過濾后,上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。

2.4 蛋白表達(dá)檢測 采用Western blot 法。0、0.5、2.0、8.0、32.0、128.0 nmol/L 雷公藤甲素干預(yù)對數(shù)生長期人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa 細(xì)胞24 h,PBS 清洗2 次,加入300 μL細(xì)胞RIPA 裂解液,冰上裂解15 min,EP 管收集細(xì)胞裂解液,12 000 r/min、4 ℃離心15 min,取上清液,BCA 法進(jìn)行蛋白定量,按比例加入蛋白上樣緩沖液(4 ∶1),沸水浴10 min 使蛋白充分變性。根據(jù)蛋白樣品濃度計算上樣量,12%分離膠、10%濃縮膠轉(zhuǎn)膜90 min,5%脫脂奶粉室溫封閉1 h,1 ∶1 000 標(biāo)記一抗,4 ℃過夜,1 ∶10 000 孵育辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗,室溫孵育2 h,暗室中滴加超敏發(fā)光液,感光膠片曝光,采集圖片,Image J 軟件分析。

2.5 mRNA 表達(dá)檢測 采用熒光定量PCR 法。0、0.5、2.0、8.0、32.0、128.0 nmol/L 雷公藤甲素干預(yù)對數(shù)生長期的人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa 細(xì)胞24 h,總RNA 提取方法為用PBS 清洗2 次,加入1 mL Trizol 裂解液,吸管吹打后轉(zhuǎn)至EP 管,再加入0.2 mL 氯仿,渦旋振蕩,12 000 r/min、4 ℃離心15 min,吸取上清至新EP 管,加入等體積異丙醇,靜置、離心、棄上清后加與異丙醇等體積的75%乙醇洗滌沉淀,最后加適量DEPC 處理水溶解RNA。取已提取的總RNA 1 μL,超微量分光光度計檢測,測得A260/A280比值為1.8 ～2.0,表明RNA 質(zhì)量較好,去基因組DNA 后,采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,以cDNA 為模板進(jìn)行熒光PCR 擴(kuò)增。采用SYBR Premix Ex TaqⅡ試劑盒,在Agilent(Mx3000P) PCR 儀上進(jìn)行實(shí)時熒光定量,分別擴(kuò)增PI3Kp85、AKT、mTOR、LC3ⅡmRNA(引物序列見表1),重復(fù)3 次。反應(yīng)條件為預(yù)變性,95 ℃2 min,1 個循環(huán)；熱循環(huán),95 ℃15 s,60 ℃15 s,72 ℃30 s,40 個循環(huán),擴(kuò)增結(jié)束后由擴(kuò)增曲線和溶解曲線確認(rèn)數(shù)據(jù)可信性,計算基因相對表達(dá)量2-△△Ct。

表1 引物序列

2.6 統(tǒng)計學(xué)分析 通過SPSS 21.0 軟件進(jìn)行處理,數(shù)據(jù)以表示,采用單因素方差分析,數(shù)據(jù)滿足正態(tài)分布和方差齊性時,采用LSD 法進(jìn)行多組間兩兩比較；方差不齊性時,采用Dunnett'T3 法進(jìn)行多組間兩兩比較。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 雷公藤甲素對Ishikawa 細(xì)胞增殖的影響 表2、圖1顯示,與雷公藤甲素0 nmol/L 組比較,其他劑量組均能顯著抑制Ishikawa 細(xì)胞增殖(P＜0.05,P＜0.01),并隨其濃度增大、作用時間延長,抑制作用也加強(qiáng)。

表2 雷公藤甲素對Ishikawa 細(xì)胞增殖的影響（%，n=3）

表2 雷公藤甲素對Ishikawa 細(xì)胞增殖的影響（%，n=3）

注：與雷公藤甲素0 nmol/L 組比較,△P＜0.05,△△P＜0.01

組別 24 h 48 h 72 h雷公藤甲素0 nmol/L 組 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00雷公藤甲素0.5 nmol/L 組 17.76±1.35△ 29.76±3.46△ 31.58±2.02△雷公藤甲素2.0 nmol/L 組 28.37±2.05△ 38.97±2.61△ 42.17±3.01△雷公藤甲素8.0 nmol/L 組 46.24±2.56△△ 53.26±4.58△△ 58.12±2.14△△雷公藤甲素32.0 nmol/L 組 59.12±3.14△△ 68.79±3.78△△ 71.24±2.56△△雷公藤甲素128.0 nmol/L 組 65.32±2.98△△ 75.65±5.24△△ 76.22±1.25△△

3.2 雷公藤甲素對Ishikawa 細(xì)胞周期的阻滯作用 表3 顯示,雷公藤甲素對Ishikawa 細(xì)胞周期有阻滯作用,可將其阻滯在S 期和G2/M 期,并隨著濃度增加,阻滯在G2 期的比例逐漸增高；與雷公藤甲素0 nmol/L 組比較,2.0、8.0、32.0、128.0 nmol/L 組比例顯著增加(P＜0.05,P＜0.01)。

3.3 雷 公 藤 甲 素 對PI3Kp85、 p-AkT、 AkT、 p-mTOR、mTOR 蛋白表達(dá)的影響 表4、圖2 顯示,與雷公藤甲素0 nmol/L組比較,2.0、8.0、32.0、128.0 nmol/L 組均能顯著降低PI3Kp85、p-AkT、p-mTOR 蛋白表達(dá)(P＜0.05,P＜0.01),并隨濃度增加而更明顯,但各組AkT、mTOR 蛋白表達(dá)無顯著差異(P＞0.05)。

3.4 雷公藤甲素對PI3Kp85、AkT、mTOR、LC3ⅡmRNA 表達(dá)的影響 表5 顯示,與雷公藤甲素0 nmol/L 組比較,2.0、8.0、32.0、128.0 nmol/L 組均能顯著降低PI3Kp85、AkT、mTOR mRNA 表達(dá)(P ＜0.05,P ＜0.01),顯著升高LC3ⅡmRNA 表達(dá)(P＜0.05,P＜0.01),并與其濃度呈正相關(guān)。

圖1 雷公藤甲素對Ishikawa 細(xì)胞增殖的影響

表3 雷公藤甲素對Ishikaw 細(xì)胞周期的影響n=3）

表3 雷公藤甲素對Ishikaw 細(xì)胞周期的影響n=3）

注：與雷公藤甲素0 nmol/L 組比較,△P＜0.05,△△P＜0.01

組別 (G0/G1 期)/% S 期/% (G2/M 期)/%雷公藤甲素0 nmol/L 組 73.81±2.15 19.45±2.18 6.56±1.25雷公藤甲素0.5 nmol/L 組 68.45±3.65 23.89±3.25 7.24±1.33雷公藤甲素2.0 nmol/L 組 60.13±2.34△ 28.62±3.44△ 10.56±1.09△雷公藤甲素8.0 nmol/L 組 57.28±4.17△△ 31.18±2.56△△ 11.44±1.23△雷公藤甲素32.0 nmol/L 組 49.05±3.49△△ 35.82±0.13△△ 15.01±1.11△雷公藤甲素128.0 nmol/L 組 37.81±3.29△△ 45.56±0.25△△ 13.86±1.32△△

表4 雷公藤甲素對PI3Kp85、p-AkT、AkT、p-mTOR、mTOR 蛋白表達(dá)的影響n=3）

表4 雷公藤甲素對PI3Kp85、p-AkT、AkT、p-mTOR、mTOR 蛋白表達(dá)的影響n=3）

注：與雷公藤甲素0 nmol/L 組比較,△P＜0.05,△△P＜0.01

組別 PI3Kp85 AkT p-AkT mTOR p-mTOR雷公藤甲素0 nmol/L 組 2.77±0.11 5.68±0.05 4.13±0.16 4.19±0.10 3.86±0.05雷公藤甲素0.5 nmol/L 組 1.75±0.03 5.23±0.25 4.66±0.06 3.98±0.23 3.44±0.09雷公藤甲素2.0 nmol/L 組 1.70±0.03△ 5.04±0.19 3.79±0.25△ 3.66±0.15 3.02±0.01△雷公藤甲素8.0 nmol/L 組 1.36±0.01△ 4.89±0.23 3.04±0.14△ 3.48±0.14 2.56±0.08△雷公藤甲素32.0 nmol/L 組 0.74±0.02△△ 4.65±0.15 1.32±0.33△△ 3.55±0.21 2.02±0.06△雷公藤甲素128.0 nmol/L 組 0.56±0.08△△ 4.58±0.24 1.12±0.13△△ 3.77±0.11 1.69±0.07△△

圖2 各組PI3Kp85、p-AkT、AkT、p-mTOR、mTOR 蛋白表達(dá)

表5 雷公藤甲素對PI3Kp85、p-AkT、AkT、p-mTOR、mTOR mRNA 表達(dá)的影響n=3）

表5 雷公藤甲素對PI3Kp85、p-AkT、AkT、p-mTOR、mTOR mRNA 表達(dá)的影響n=3）

注：與雷公藤甲素0 nmol/L 組比較,△P＜0.05,△△P＜0.01

組別 PI3Kp85 Akt mTOR LC3Ⅱ雷公藤甲素0 nmol/L 組 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00雷公藤甲素0.5 nmol/L 組 0.85±0.02 0.75±0.09 0.82±0.05 1.26±0.09雷公藤甲素2.0 nmol/L 組 0.72±0.07△ 0.68±0.06 0.76±0.03 1.37±0.08△雷公藤甲素8.0 nmol/L 組 0.68±0.09△ 0.62±0.01 0.67±0.05 1.68±0.01△雷公藤甲素32.0 nmol/L 組 0.49±0.07△△ 0.51±0.06 0.60±0.03 1.93±0.27△△雷公藤甲素128.0 nmol/L 組 0.37±0.01△△ 0.41±0.02 0.47±0.02 2.41±0.22△△

4 討論

近年來科研工作者發(fā)現(xiàn),腫瘤發(fā)生發(fā)展與細(xì)胞異常增殖密切相關(guān),細(xì)胞不能程序性生長、凋亡,導(dǎo)致異常發(fā)生的原因很多,而自噬異常是重要因素之一。磷脂酰肌醇-3/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(PI3K-Akt-mTOR)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路受內(nèi)外界活化信號刺激后異常激活,可抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移、血管形成,其中磷脂酰肌醇-3(PI3K) 具有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶和磷脂酰肌醇激酶活性蛋白,由調(diào)節(jié)亞基p85 和催化亞基p110 亞基構(gòu)成,胞質(zhì)中PI3K 激活后將胞膜上的磷脂酰肌醇家族成員磷酸化,其累積到一定程度后激活下游信號分子蛋白激酶B(PKB,即AkT),有3 種亞基,是PI3K信號傳導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵靶激酶［11］；哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR) 是AkT 重要底物之一,以mTOR1、mTOR2 兩種形式存在,其是否被磷酸化會影響轉(zhuǎn)錄和翻譯；PI3K、AkT 是mTOR 的上游調(diào)控因子,前者激活后者后可通過磷酸化mTOR、NF-κB 等一系列底物,進(jìn)而影響細(xì)胞周期、增殖、分化、凋亡、代謝等生理生化過程。研究表明,PI3K-AkT 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被視為是調(diào)控細(xì)胞氧化、生存、凋亡的最關(guān)鍵的信號通路之一［12］。

大量研究表明,中藥有效成分能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬,抑制腫瘤細(xì)胞生長,在直接或輔助抗腫瘤方面發(fā)揮著獨(dú)特的作用。雷公藤甲素亦稱雷公藤內(nèi)酯,是從雷公藤中提取出的三萜類化合物,具有抗炎、免疫抑制、抗囊腫、抗腫瘤等多種功效［13］。Mujumdar 等［14］發(fā)現(xiàn),雷公藤甲素干預(yù)胰腺癌S2-013、S2-VP10、Hs766T 細(xì)胞株時,呈現(xiàn)出時間、濃度依賴性地細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞增殖抑制,抑制PI3K-AkT-mTOR 通路上關(guān)鍵基因和蛋白表達(dá),誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞發(fā)生自噬性死亡；Xie 等［15］報道,雷公藤甲素將肺癌A549 細(xì)胞周期明顯阻滯在S 期和G2/M 期,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡；雷公藤甲素可通過PI3K/PKB 通路干預(yù)和阻滯子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株HEC-1B 的細(xì)胞周期,發(fā)揮抗腫瘤作用［16］。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn),雷公藤甲素可將子宮內(nèi)膜癌Ishikawa 細(xì)胞阻滯在S 期和G2/M 期,呈現(xiàn)出明顯濃度依賴性,與其他學(xué)者研究結(jié)果一致,表明該成分可阻滯Ishikawa 細(xì)胞周期進(jìn)展,從而抑制其生長增殖。

聯(lián)合自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤和氯喹能增強(qiáng)雷公藤甲素誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞的死亡,通過CaMKKβ-AMPK 信號通路抑制mTOR 磷酸化,并激活ΜLK1 和Beclin1 表達(dá),最終導(dǎo)致前列腺癌細(xì)胞自噬能力增強(qiáng)［17］。Kim 等［18］發(fā)現(xiàn),雷公藤甲素聯(lián)合Hsp90 抑制劑BIIB021 可通過PI3K-AkTmTOR、NF-κB 信號通路對甲狀腺癌細(xì)胞具有協(xié)同殺傷作用；Minjung 等［19］報道,雷公藤甲素對宮頸癌細(xì)胞線粒體中的Caspase 3、Caspase 9 表達(dá)有明顯促進(jìn)作用,并能改變線粒體膜電位,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡；雷公藤甲素也可誘導(dǎo)宮頸癌Hela 細(xì)胞自噬和凋亡［20-21］；仲劍等［22］構(gòu)造裸鼠模型,將子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞種植于皮下,發(fā)現(xiàn)它對移植瘤有明顯的抑制作用；雷公藤甲素可抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株HEC-1B 侵襲轉(zhuǎn)移［23］,上調(diào)Bax/Bcl-2 比值［22］。本實(shí)驗(yàn)以雷公藤甲素干預(yù)子宮內(nèi)膜癌Ishikawa 細(xì)胞,對PI3K-AkT-mTOR信號通路中關(guān)鍵蛋白及基因PI3Kp85、AkT、mTOR 進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)該成分可下調(diào)PI3Kp85、AkT、mTOR mRNA 和蛋白表達(dá),上調(diào)LC3ⅡmRNA 表達(dá),從而影響子宮內(nèi)膜癌Ishikawa 細(xì)胞微環(huán)境,當(dāng)其累積到一定程度時,可誘導(dǎo)細(xì)胞自噬發(fā)生,最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

綜上所述,本實(shí)驗(yàn)以雷公藤甲素處理子宮內(nèi)膜癌Ishikawa 細(xì)胞,通過MTT 法觀察其對細(xì)胞增殖抑制率的影響,流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期,免疫蛋白印跡研究通路中關(guān)鍵蛋白的活化狀態(tài)及表達(dá)量,RT-PCR 從基因?qū)用骝?yàn)證關(guān)鍵蛋白對應(yīng)基因表達(dá)量變化。結(jié)果表明,雷公藤甲素處理子宮內(nèi)膜癌Ishikawa 細(xì)胞可能是通過PI3K-AkT-mTOR 通路誘導(dǎo)關(guān)鍵因子失表達(dá),增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞自噬能力,導(dǎo)致子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞凋亡發(fā)生,抑制細(xì)胞增殖。