大黃素對慢性壓迫性損傷大鼠脊髓細(xì)胞因子的影響

王 琛, 吳智兵, 林興棟, 陳 鵬

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué),廣東 廣州510400；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,廣東 廣州510400；3.貴州中醫(yī)藥大學(xué),貴州貴陽550000)

慢性壓迫性損傷動物模型為外周單一神經(jīng)損傷模型［1］,其癥狀與人類因外周神經(jīng)損傷而引起痛覺過敏相似,故該模型常用來進(jìn)行神經(jīng)病理性疼痛藥物療效評估及機(jī)制研究［2］,許多研究者對不同種類細(xì)胞因子在神經(jīng)病理性疼痛中的作用表現(xiàn)出越來越多的關(guān)注［3］。

大黃是具有活血祛瘀、清泄?jié)駸嶙饔玫闹兴?其成分中以大黃素為代表的蒽醌類物質(zhì)具有顯著調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞因子(如IL-1β、IL-10 等) 表達(dá)的作用［4-6］。前期課題組［7］報道,大黃素對慢性壓迫性損傷大鼠具有一定鎮(zhèn)痛作用；目前已有研究者發(fā)現(xiàn),大黃素可抑制慢性壓迫性損傷模型中初級感覺神經(jīng)元受體表達(dá),從而起到了改善疼痛的作用［8］。因此,本實(shí)驗(yàn)探討大黃素對慢性壓迫性損傷大鼠脊髓的影響,為其鎮(zhèn)痛機(jī)制研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

SPF 級雄性健康SD 大鼠,體質(zhì)量180～220 g,購于廣州中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心,實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號SCXK(粵) 2013-0034。 大黃素 (含 有量＞98%, 批號MUST-15042711) 購于成都曼斯特生物科技有限公司。IL-1β、IL-10 抗體購于英國Abcam 公司；BCA 蛋白濃度測定試劑盒、固定液等試劑購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司。2390 系列von Frey 電子測痛儀、390 爪刺激痛覺測試儀(美國IITC-Life Science 公司)；BX-60 光學(xué)顯微鏡、顯微攝像儀(日本Olympus 公司)；IPP6.0 軟件。

2 方法

2.1 分組、造模及給藥 42 只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、大黃素組,每組14 只,按照文獻(xiàn)［9］ 方法進(jìn)行造模,在坐骨神經(jīng)分叉處上5 mm 采用4-0 絲線間隔約1.0 mm進(jìn)行4 次結(jié)扎。從術(shù)后第1 天開始,按照前期研究確定的劑量給藥［7］,大黃素(50 mg/kg) 灌胃,1 次/d,共15 d。

2.2 行為學(xué)測試 分別于造模前2 d 及造模后第3、7、11、15 天進(jìn)行機(jī)械痛覺和熱痛覺測試以評估疼痛情況。上午10 點(diǎn)至下午6 點(diǎn)將大鼠置于檢測環(huán)境30 min 后,由不同實(shí)驗(yàn)人員進(jìn)行行為學(xué)測試,參考文獻(xiàn)［10］ 方法,將大鼠置于有機(jī)玻璃箱(22 cm×12 cm×22 cm) 中,底部為金屬網(wǎng),電子測痛儀垂直刺激大鼠左側(cè)足底正中,逐漸加壓至其出現(xiàn)疼痛反應(yīng),表現(xiàn)為抬足或舔足,主機(jī)顯示屏上的機(jī)械縮足反射閾值。休息2 h 以上后參照文獻(xiàn)［11］ 方法,將大鼠置于有機(jī)玻璃箱(20 cm×15 cm×18 cm) 中,底部為玻璃板,熱輻射刺激儀移動到其后足正下方,按下開始鍵,大鼠感覺到疼痛出現(xiàn)抬足時停止,主機(jī)屏幕時間為熱縮足潛伏期,時間上限設(shè)置為20 s。每足機(jī)械縮足反射閾值、熱縮足潛伏期均測量5 次,每次間隔10 min,取平均值。

2.3 脊髓IL-1β、IL-10 陽性標(biāo)記檢測 行為學(xué)測試后每組隨機(jī)取6 只大鼠,腹腔注射水合氯醛(350 mg/kg) 麻醉,暴露心臟,插管灌流固定,先以0.9%氯化鈉溶液沖洗至流出液澄清,再以4%多聚甲醛灌流至四肢僵硬,暴露脊髓后,取出L4～L6 損傷側(cè)組織,浸泡在4%多聚甲醛溶液中固定24 h；剩余大鼠于術(shù)后15 d 取材完畢。處理后的組織石蠟包埋,切片(片厚4 μm),放入片盒后于-20 ℃冰箱中保存。石蠟切片脫蠟水化后,PBS 緩沖液沖洗3 次,每次5 min 進(jìn)行抗原修復(fù)。適當(dāng)比例稀釋IL-1β、IL-10 一抗,37 ℃下孵育1 h 以上,PBS 緩沖液沖洗3 次,每次5 min,再加入生物素標(biāo)記二抗,37 ℃下反應(yīng)30 min。DAB 顯色,蘇木素復(fù)染5 min,鹽酸酒精分化,梯度酒精脫水,二甲苯透明,晾干,中性樹脂封片,用顯微鏡及顯微攝像儀對染色組織切片進(jìn)行觀察,圖片通過IPP 6.0 軟件進(jìn)行分析,每個切片隨機(jī)取5 個視野(×400),計算出陽性顆粒的平均光密度值。

2.4 脊髓IL-1β、IL-10 蛋白表達(dá)檢測 行為學(xué)測試后每組隨機(jī)取6 只大鼠,腹腔注射水合氯醛(350 mg/kg) 麻醉,取出左側(cè)L4～L6 段脊髓,尖鑷于冰生理鹽水中將軟脊膜剝離,放入-80 ℃超低溫冰箱中備用；術(shù)后15 d 同法取出各組剩余大鼠損傷側(cè)脊髓。在脊髓組織中加入RIPA(強(qiáng))裂解液(1 mg 組織∶20 μL 裂解液) 充分混勻、研磨,超聲裂解后,加入5×Loading Buffer 蛋白上樣緩沖液(5 ∶1),100 ℃煮沸5 min使其變性,13 000 r/min 離心5 min,取上清液,BCA 法進(jìn)行蛋白定量。電泳分離蛋白后,轉(zhuǎn)膜至PVDF 膜,于脫脂牛奶室溫?fù)u床下封閉1 h,4 ℃搖床下孵育IL-1β 抗體(1 ∶1 000)、IL-10(1 ∶1 000)、GAPDH 抗體(1 ∶1 000) 過夜,TBST 漂洗3 次,每次10 min,加入1∶40 000 稀釋二抗中,室溫下?lián)u床孵育1 h,TBST 再漂洗3次,每次10 min,ECL 發(fā)光液顯色曝光,圖片通過IPP 6.0軟件進(jìn)行分析。

2.5 統(tǒng)計學(xué)分析 通過SPSS 21.0 軟件進(jìn)行重復(fù)測量方差分析,數(shù)據(jù)以表示,滿足方差齊性者組間比較采用LSD 法,不滿足者采用Dunnett's T3 法。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 行為學(xué)測試 表1 ～2、圖1 顯示,術(shù)后3、7、11 d,模型組大鼠機(jī)械痛、熱痛閾值較假手術(shù)組顯著降低(P＜0.01),大黃素組兩者較模型組顯著升高(P＜0.05,P＜0.01)；術(shù)后15 d,模型組兩者仍較假手術(shù)組顯著降低(P＜0.01),而大黃素組與模型組相比顯著升高 (P ＜0.01)。

表1 各組大鼠機(jī)械痛閾值比較（g，n=14）

表1 各組大鼠機(jī)械痛閾值比較（g，n=14）

注：與假手術(shù)組比較,＃＃P＜0.01；與模型組比較,*P＜0.05,**P＜0.01

組別 基礎(chǔ)值 術(shù)后3 d 術(shù)后7 d 術(shù)后11 d 術(shù)后15 d假手術(shù)組 53.69±1.33 53.76±2.70 53.63±1.10 53.04±1.76 53.43±1.90模型組 54.31±1.23 34.17±3.75＃＃ 37.56±2.95＃＃ 35.79±1.88＃＃ 34.17±3.75＃＃大黃素組 54.11±0.90 40.72±3.06＃＃* 41.43±2.46＃＃** 42.58±1.64＃＃** 44.34±2.34＃＃**

表2 各組大鼠熱痛閾值比較（s，，n=14）

表2 各組大鼠熱痛閾值比較（s，，n=14）

注：與假手術(shù)組比較,＃＃P＜0.01；與模型組比較,*P＜0.05,**P＜0.01

組別 基礎(chǔ)值 術(shù)后3 d 術(shù)后7 d 術(shù)后11 d 術(shù)后15 d假手術(shù)組 14.67±1.95 14.27±1.55 14.63±2.00 13.91±1.76 15.03±2.28模型組 15.22±1.84 7.72±0.80＃＃ 7.30±0.67＃＃ 7.86±0.68＃＃ 8.23±1.13＃＃大黃素組 15.13±1.79 8.53±1.16＃＃* 8.96±0.82＃＃** 9.43±1.43＃＃* 12.13±1.47＃＃**

圖1 各組大鼠機(jī)械痛閾值（A） 與熱痛閾值（B）

3.2 IL-1β、IL-10 陽性標(biāo)記 圖2 ～3 顯示,術(shù)后7 d,模型組、大黃素組IL-1β 表達(dá)與假手術(shù)組相比顯著升高(P＜0.05),大黃素組IL-10 表達(dá)顯著高于假手術(shù)組、模型組(P＜0.05)；術(shù)后15 d,模型組IL-1β 表達(dá)仍顯著高于假手術(shù)組(P＜0.05),而大黃素組較假手術(shù)組、模型組顯著降低(P＜0.05),同時大黃素組、模型組IL-10 表達(dá)均較假手術(shù)組顯著降低(P＜0.05)。

圖2 各組大鼠脊髓IL-1β 平均光密度值（×400）

圖3 各組大鼠脊髓IL-10 平均光密度值（×400）

3.3 IL-1β、IL-10 蛋白表達(dá) 圖4 ～5 顯示,術(shù)后7 d,模型組IL-1β 蛋白表達(dá)與假手術(shù)組相比顯著升高(P＜0.05),大黃素組較假手術(shù)組、模型組顯著升高(P＜0.05)；術(shù)后15 d,模型組IL-1β 蛋白表達(dá)仍顯著高于假手術(shù)組(P ＜0.05),大黃素組較假手術(shù)組、 模型組顯著降低 (P ＜0.05),但3 組IL-10 蛋白表達(dá)無顯著差異(P＞0.05)。

圖4 各組大鼠脊髓IL-1β 蛋白表達(dá)

圖5 各組大鼠脊髓IL-10 蛋白表達(dá)

4 討論

大黃素具有有抗病毒、神經(jīng)保護(hù)、抗炎、抗腫瘤等藥理作用,是大黃主要有效成分之一,也存在于蘆薈、何首烏等常用中草藥中［12-14］。在膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎動物模型研究中發(fā)現(xiàn),大黃素能通過抑制NF-κB 途徑來抑制巨噬細(xì)胞釋放炎癥因子［15-16］；在急性胰腺炎模型中,大黃素能通過抑制ER 壓力傳感器IRE1α 及其下游分子來阻止JNK、p38 MAPK 磷酸化,進(jìn)而抑制IL-1β 釋放［17-18］,但關(guān)于大黃素鎮(zhèn)痛效果及其機(jī)制的報道相對較少。本研究將大黃素應(yīng)用于慢性壓迫性損傷大鼠的治療,發(fā)現(xiàn)它在術(shù)后7 d 開始展現(xiàn)出一定鎮(zhèn)痛效果,至術(shù)后15 d 效果明顯優(yōu)于模型組,而且對IL-1β、IL-10 有一定調(diào)節(jié)作用。

在慢性壓迫性損傷動物模型中,疼痛癥狀往往依賴于外周感覺纖維損傷后引發(fā)的脊髓背角中神經(jīng)元異常興奮性反應(yīng),以及不同類型神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的激活［19-20］。細(xì)胞因子作為膠質(zhì)細(xì)胞激活的下游因子,是一種非結(jié)構(gòu)式蛋白,根據(jù)其生物活性可分為促炎性細(xì)胞因子(如IL-1 家族) 和抗炎性細(xì)胞因子(如IL-10 家族)。其中,膠質(zhì)細(xì)胞激活后釋放促炎性細(xì)胞因子(如IL-1β 等),可增加脊髓背角神經(jīng)元興奮性,并且提高其中NMDA 受體磷酸化水平,進(jìn)而激活p38 MAPK,最終產(chǎn)生痛覺過敏癥狀［21］；IL-10 可降低NFκB 活性,導(dǎo)致包括IL-1β、TNF 在內(nèi)的促炎性細(xì)胞因子水平衰減［22］。文獻(xiàn)［23-24］ 報道,降低IL-1β 水平可達(dá)到緩解疼痛的作用,而在慢性壓迫性損傷模型和紫杉醇引起的疼痛模型中注射外源性IL-10 時,可緩解異常性疼痛,表明神經(jīng)病理性疼痛形成機(jī)制中IL-1β、IL-10 水平變化具有重要作用。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化和Western blot 技術(shù)檢測慢性壓迫性損傷大鼠脊髓中IL-1β、IL-10 水平,發(fā)現(xiàn)前者顯著升高；術(shù)后7 d 大黃素灌胃后能促進(jìn)后者,但15 d 時反而被抑制,同時在術(shù)后各個時間點(diǎn)行為學(xué)測定中,大黃素組大鼠痛覺過敏癥狀有所改善,與細(xì)胞因子檢測結(jié)果符合。由此認(rèn)為,IL-1β、IL-10 作為2 類具有不同作用的細(xì)胞因子,參與了慢性壓迫性損傷大鼠術(shù)后痛覺過敏的形成。

綜上所述,大黃素可降低促炎性細(xì)胞因子IL-1β 水平、升高抗炎性細(xì)胞因子IL-10 水平,從而產(chǎn)生綜合性的效果,改善慢性壓迫性損傷大鼠疼痛癥狀。但不同細(xì)胞因子在諸多疾病形成機(jī)制中均有重要作用,故若要驗(yàn)證大黃素抑制神經(jīng)病理性疼痛的作用靶點(diǎn),還需進(jìn)行具體通路上、下游指標(biāo)的檢測,如MAPK、NF-κB 等,從而為其作用機(jī)制探索提供更充足的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。