雞矢藤提取物對2 型糖尿病大鼠胰腺β 細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響

徐 錦, 梁志敏, 劉智君, 梁 韜, 鄭 妮, 陳 歡*

(1.玉林市中西醫(yī)結(jié)合骨科醫(yī)院,廣西 玉林537000；2.廣西醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院,廣西 南寧530021；3.南方醫(yī)科大深圳醫(yī)院,廣東深圳518000)

糖尿病是一種由多種病因造成機(jī)體內(nèi)高血糖的慢性代謝性紊亂疾病,發(fā)病率隨著人們生活質(zhì)量提高、生活方式及飲食結(jié)構(gòu)改變而升高,據(jù)國際糖尿病基金會(huì)預(yù)計(jì),2030年我國糖尿病患者將增加到1.3 億,占總?cè)丝?2.1%［1］。2型糖尿病約占糖尿病患者總數(shù)的80%,而機(jī)體外周組織胰島素抵抗、胰島β 細(xì)胞功能衰竭是其發(fā)展的兩大重要環(huán)節(jié)。胰島β 細(xì)胞具有高度發(fā)達(dá)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng),對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激極為敏感,故其所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是細(xì)胞功能衰竭的重要因素［2-3］,也是2 型糖尿病發(fā)病的重要環(huán)節(jié)。由于糖尿病是以高血糖為基本特征的全身性疾病,發(fā)病過程中會(huì)出現(xiàn)許多并發(fā)癥,對患者、家庭、社會(huì)造成了不小的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)及壓力,故研發(fā)具有靶向性的相關(guān)藥物有著重要現(xiàn)實(shí)意義。

雞矢藤是茜草科草質(zhì)藤本植物雞矢藤Paederia scandens(Lour.)Merr.干燥全草,其味甘、微苦,性平［4］,具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗風(fēng)濕、抗痛風(fēng)、降血糖等藥理活性,在抗糖尿病治療上有著良好的效果,但其作用機(jī)制尚未明確［5］。本實(shí)驗(yàn)考察雞矢藤提取物對2 型糖尿病大鼠胰腺β 細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響,為深入研究其機(jī)理提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 試藥 雞矢藤購自廣西玉林市藥材市場,經(jīng)廣西中醫(yī)藥研究院專家鑒定為茜草科多年生草質(zhì)藤本植物雞矢藤Paederia scandens(Lour.)Merr.干燥全草,其提取物由本實(shí)驗(yàn)室采用乙醇提取法制得。鏈脲佐菌素(STZ) 購自美國Sigma 公司,批號SO170-100 mg；二甲雙胍片購自北京京豐制藥有限公司,批號170622。胰島素ELISA 試劑盒購自美國Millipore 公司,批號C17084；一氧化氮(NO)、核因子-κB(NF-κB) ELISA 試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司,批號1756725、1709124；活性氧(ROS) ELISA試劑盒購自上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司公司,批號1705246；兔抗Tribble 同源蛋白3(TRIB3) 多克隆抗體購自德國Calbiochem 公司,批號17054；兔抗大鼠C/EBP 同源蛋白(CHOP) 高親和性單克隆抗體購自美國Sigma 公司,批號BI852。

1.2 儀器 卓越型血糖儀,購自瑞士羅氏公司；電泳儀,購自美國Bio-Rad 公司；9602A 酶標(biāo)儀,購自北京艾普生物設(shè)備有限公司。

1.3 動(dòng)物 SPF 級SD 大鼠,體質(zhì)量(200±20) g,雌雄各半,由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,合格證號SCXK(桂)2015-0005。

2 方法

2.1 造模、分組及給藥［6］大鼠造模前12 h 禁食不禁水,尾靜脈注射鏈脲佐菌素(60 mg/kg) 后高脂飼料喂養(yǎng)30 d。第31 天尾部取血,測定空腹血糖,以≥11.1 mol/L 為造模成功。大鼠隨機(jī)分為模型組、二甲雙胍組(320 mg/kg)、雞矢藤提取物組(1.25、2.5、5.0 g/kg),每組10 只,另設(shè)空白組10 只大鼠,普通飼料喂養(yǎng),各組灌胃給藥4 周。

2.2 提取物制備 藥材干燥粉碎后,浸泡于10 倍量80%乙醇中1 h,75 ℃回流提取1 h,共2 次,濾過,合并濾液,減壓回收乙醇,真空條件下低溫干燥,即得。

2.3 指標(biāo)檢測 血糖儀、ELISA 試劑盒法分別檢測初次給藥前及末次給藥后1 h 大鼠空腹血糖、血清胰島素水平。末次給藥前,大鼠禁食不禁水12 h,給藥后1 h 腹主動(dòng)脈取血,高速離心分離血清。切取大鼠胰腺部分組織,浸泡于4%甲醛中固定1 周,石蠟包埋切片,HE 染色,顯微鏡下觀察。再切除部分胰腺組織,勻漿后ELISA 試劑盒法檢測NO、ROS、NF-κB 水平,Western blot 法檢測胰腺組織TRIB3、CHOP 蛋白表達(dá)。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過SPSS 18.0 軟件進(jìn)行處理,數(shù)據(jù)以表示,方差齊者組間比較采用t 檢驗(yàn),方差不齊者采用矯正t 檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 雞矢藤提取物對空腹血糖的影響 表1 顯示,與空白組比較,模型組空腹血糖顯著升高(P＜0.05)；與模型組比較,雞矢藤提取物組空腹血糖顯著下降(P＜0.05),并呈一定劑量依賴性。

表1 雞矢藤提取物對空腹血糖的影響n=10）

表1 雞矢藤提取物對空腹血糖的影響n=10）

注：與空白組比較,*P＜0.05；與模型組比較,＃P＜0.05

組別 (g劑·k量g-/1)給藥空前腹 血糖/(mmo給l·L藥-1后)空白組 — 7.56±0.84 7.41±1.08模型組 — 13.81±1.14* 14.52±1.29*二甲雙胍組 0.32 13.45±1.22* 10.47±1.81*＃雞矢藤提取物組 1.25 12.98±1.63* 11.45±1.26*＃雞矢藤提取物組 2.5 13.26±1.49* 10.93±1.18*＃雞矢藤提取物組 5.0 13.17±1.58* 10.38±1.46*＃

3.2 雞矢藤提取物對大鼠胰腺組織的影響 圖1 顯示,空白組大鼠胰腺組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整飽滿；模型組大鼠胰腺細(xì)胞有大量結(jié)構(gòu)變形及萎縮情況,并伴有炎性細(xì)胞浸潤；二甲雙胍組、雞矢藤提取物組大鼠胰島細(xì)胞結(jié)構(gòu)變形、萎縮情況有所改善,損傷胰島有所減緩。

圖1 各組大鼠胰腺組織病理變化（×400）

3.3 雞矢藤提取物對血清胰島素的影響 表2 顯示,與空白組比較,模型組血清胰島素水平顯著降低(P＜0.05)；與模型組比較,雞矢藤提取物組其水平顯著升高 (P ＜0.05)。

表2 雞矢藤提取物對血清胰島素的影響n=10）

表2 雞矢藤提取物對血清胰島素的影響n=10）

注：與空白組比較,*P＜0.05；與模型組比較,＃P＜0.05

組別 劑量/(g·kg-1) 胰島素/(mIU·mL-1)空白組 — 22.86±4.72模型組 — 10.73±2.05*二甲雙胍組 0.32 18.45±3.81*＃雞矢藤提取物組 1.25 13.36±4.06*＃雞矢藤提取物組 2.5 15.09±2.79*＃雞矢藤提取物組 5.0 18.51±2.57*＃

3.4 雞矢藤提取物對NO、ROS、NF-κB 水平的影響 表3顯示,與空白組比較,模型組NO、ROS、NF-κB 水平顯著升高(P＜0.05)；與模型組比較,雞矢藤提取物組三者水平顯著降低(P＜0.05)。

3.5 雞矢藤提取物TRIB3、CHOP 蛋白表達(dá)的影響 表4、圖2 顯示,與空白組比較,模型組TRIB3、CHOP 蛋白表達(dá)顯著升高(P＜0.05)；與模型組比較,雞矢藤提取物組兩者蛋白表達(dá)顯著下降(P＜0.05),并呈一定劑量依賴性。

4 討論

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成、加工修飾、質(zhì)量監(jiān)控的重要場所,能保持細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)平衡,確保細(xì)胞功能正常運(yùn)行［7］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是真核細(xì)胞的一種保護(hù)性應(yīng)激反應(yīng),但使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)持續(xù)性處于應(yīng)激狀態(tài)時(shí)則可激活細(xì)胞的凋亡通路,觸發(fā)細(xì)胞凋亡［8-9］。胰島β 細(xì)胞具有高度發(fā)達(dá)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng),其蛋白質(zhì)合成和分泌功能旺盛,使得β 細(xì)胞對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激極為敏感,在2 型糖尿病發(fā)展中它長期處于高糖環(huán)境下,會(huì)造成其細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)處于持續(xù)性、長期性應(yīng)激反應(yīng),誘導(dǎo)細(xì)胞功能衰竭,減少細(xì)胞數(shù),故內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在2型糖尿病病程中可引起胰島β 細(xì)胞功能衰竭及凋亡。

表3 雞矢藤提取物對NO、ROS、NF-κB 水平的影響n=10）

表3 雞矢藤提取物對NO、ROS、NF-κB 水平的影響n=10）

注：與空白組比較,*P＜0.05；與模型組比較,＃P＜0.05

組別 劑量/(g·kg-1) NO/(μmol·L-1) ROS/(U·mL-1) NF-κB/(pg·mL-1)空白組 — 0.53±0.07 216.57±21.73 86.34±7.41模型組 — 1.18±0.14* 423.98±36.17* 159.27±12.73*二甲雙胍組 0.32 0.75±0.09*＃ 263.75±24.82*＃ 107.43±13.82*＃雞矢藤提取物組 1.25 1.02±0.18* 372.66±29.05*＃ 138.26±11.09*＃雞矢藤提取物組 2.5 0.88±0.11*＃ 313.51±27.38*＃ 112.95±13.64*＃雞矢藤提取物組 5.0 0.71±0.13*＃ 274.25±19.89*＃ 94.56±10.75*＃

表4 雞矢藤提取物對TRIB3、CHOP 蛋白表達(dá)的影響

表4 雞矢藤提取物對TRIB3、CHOP 蛋白表達(dá)的影響

注：與空白組比較,*P＜0.05；與模型組比較,＃P＜0.05

組別 (g劑·k量g-/1) TRIB3 CHOP空白組 — 0.35±0.04 0.78±0.14模型組 — 0.82±0.08* 1.39±0.25*二甲雙胍組 0.32 0.56±0.03*＃ 1.01±0.19*＃雞矢藤提取物組 1.25 0.67±0.05*＃ 1.15±0.15*＃雞矢藤提取物組 2.5 0.58±0.05*＃ 1.06±0.24*＃雞矢藤提取物組 5.0 0.51±0.04*＃ 0.92±0.17*＃

圖2 各組TRIB3、CHOP 蛋白表達(dá)

在2 型糖尿病狀態(tài)下,胰島組織中會(huì)有大量炎癥因子產(chǎn)生,從而出現(xiàn)炎癥級聯(lián)反應(yīng),會(huì)直接或間接作用于胰腺并損傷胰島β 細(xì)胞。NF-κB 是一種介導(dǎo)糖尿病炎癥反應(yīng)的炎癥因子,起著中心調(diào)控作用,其高表達(dá)時(shí)會(huì)促進(jìn)胰島β細(xì)胞凋亡,從而導(dǎo)致胰島功能障礙,出現(xiàn)高血糖［10］,它不僅與炎癥反應(yīng)密切相關(guān),還與細(xì)胞增殖、存活有著密切關(guān)系［11］。2 型糖尿病狀態(tài)下胰島β 細(xì)胞中,NF-κB 高表達(dá)可能啟動(dòng)組織中iNOS 因子活性,進(jìn)而誘導(dǎo)NO 生成,觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng),造成胰島β 細(xì)胞損傷,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

TRIB3 是重要的應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)蛋白,能通過調(diào)控下游的炎癥因子、氧化因子、營養(yǎng)因子等來參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、遷移、凋亡等功能,在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)下抑制其表達(dá)可明顯降低應(yīng)激損傷所造成的細(xì)胞凋亡［12］。NF-κB 是TRIB3 蛋白下游因子,后者表達(dá)能調(diào)控前者活性［13］,在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)時(shí)后者表達(dá)增加,可提高前者活性,促進(jìn)iNOS 表達(dá)進(jìn)而誘導(dǎo)NO 生成,造成胰島β 細(xì)胞損傷。另外,胰島組織中TRIB3 蛋白高表達(dá)時(shí),能使細(xì)胞內(nèi)ROS 產(chǎn)生量增多,引起胰島β 細(xì)胞生物膜脂質(zhì)過氧化,細(xì)胞內(nèi)蛋白、酶變性,DNA 損害,從而損傷β 細(xì)胞及凋亡［14］,與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果吻合。

CHOP 作為C/EBP 轉(zhuǎn)錄因子家族成員,是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激特異的轉(zhuǎn)錄因子,也是由抗調(diào)亡向促調(diào)亡轉(zhuǎn)換的主要信號分子。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)處于普通狀態(tài)時(shí),CHOP 蛋白處于低表達(dá)狀態(tài),而當(dāng)受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)其表達(dá)會(huì)增加,故其可作為衡量糖尿病動(dòng)物胰島內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的指標(biāo)［15］。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),雞矢藤提取物能顯著降低糖尿病大鼠空腹血糖,提高胰島素分泌水平,改善受損胰腺中胰島結(jié)構(gòu)及形態(tài)；胰腺組織中NO、ROS、NF-κB 水平下降,TRIB3、CHOP 蛋白表達(dá)均降低,提示其降血糖作用機(jī)制可能為下調(diào)胰腺組織TRIB3、CHOP 蛋白表達(dá),降低下游因子NF-κB活性,減少NO、ROS 水平,延緩內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對胰島造成的損傷,從而達(dá)到治療糖尿病的目的。