姜黃素提取分離及其體內(nèi)外分析方法的研究進(jìn)展

侯雯清, 岑愉萍, 范國(guó)榮, 沈報(bào)春*, 李 霽*

(1.昆明醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院暨云南省天然藥物藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,云南昆明650500；2.上海市松江市場(chǎng)監(jiān)管局,上海201600；3.上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院,上海200025)

姜黃素是從姜科、天南星科植物根莖中提取出的一種酚類物質(zhì),分子式為C21H20O6,長(zhǎng)期以來(lái)被用作香料和天然著色劑,如今是WHO 和FDA 公認(rèn)的食品、化妝品的天然添加劑,如抗氧化劑、食用色素等［1］,在中國(guó)和印度被用作傳統(tǒng)藥物使用,具有降血脂、抗腫瘤、抗炎、利膽、抗氧化、抗肝細(xì)胞毒性、抗風(fēng)濕、抑菌等廣泛藥理作用,而且毒性較低,臨床應(yīng)用潛力良好,已成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)［2］。

本文對(duì)近10 年來(lái)有關(guān)姜黃素的國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)進(jìn)行歸納,總結(jié)評(píng)價(jià)其提取、分離、體外分析方法,以期為更好地開發(fā)利用姜黃這一藥食同源的傳統(tǒng)中藥提供參考。此外,姜黃素生物利用度較低,本文也對(duì)近幾年其體內(nèi)分析方法進(jìn)行比較,為其體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究及今后相關(guān)新藥研發(fā)提供借鑒,也使其能更安全有效地應(yīng)用于臨床治療、食品添加劑、美容護(hù)膚品等領(lǐng)域。

1 提取、分離制備

1.1 提取 姜黃素主要來(lái)源于姜黃根莖,也可從莪術(shù)、郁金、生姜中提取,在姜黃中含有量最高,約3%～6%,莪術(shù)次之,郁金最低。提取姜黃素的方法一般為有機(jī)溶劑提取法、酸堿提取法、酶提取法、超臨界CO2流體提取法、水楊酸鈉法、閃式提取法等,其中有機(jī)溶劑提取法最常用。楊柳等［3］已對(duì)中文文獻(xiàn)中常用提取方法進(jìn)行總結(jié),但未涉及外文文獻(xiàn),故本文補(bǔ)充近10 年來(lái)外文文獻(xiàn)報(bào)道的姜黃素提取方法,以及該綜述中未曾引用的新方法。

加速溶劑萃取(ASE) 又稱快速溶劑萃取,是一種密閉容器內(nèi)在提高溫度(50 ～200 ℃) 和壓力(6.89 ～20.7 MPa) 的條件下,用溶劑從固體、半固體基質(zhì)中提取分析物的新型萃取技術(shù)。Yadav［4］采用該方法對(duì)乙醇、乙酸乙酯、丙酮作為萃取溶劑的性能進(jìn)行了比較,發(fā)現(xiàn)乙醇(8.4%) 提取率最高,其次為乙酸乙酯(7.4%) 和丙酮(6.6%)；姜黃素純度以丙酮(46.2%) 提取最好,其次為乙醇(43.4%) 和乙酸乙酯(38.8%)。ASE 技術(shù)較常規(guī)提取方法,具有省時(shí)、消耗溶劑少、提取效率高、操作模式多樣化、過程自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)。

D'Archivio 等［5］以響應(yīng)面法優(yōu)化乳酸乙酯提取效率,通過增強(qiáng)的單純形-質(zhì)心混合物設(shè)計(jì)來(lái)監(jiān)測(cè)提取效率與提取介質(zhì)(水、乙醇和乳酸乙酯) 中3 種溶劑的比例相關(guān)性,發(fā)現(xiàn)乳酸乙酯將是一種提取姜黃素類化合物的良好溶劑；Shirsath 等［6］綜合比較了溶劑類型、萃取時(shí)間、萃取溫度、固體與溶劑比例、粒徑、超聲功率等操作參數(shù)對(duì)萃取率的影響,發(fā)現(xiàn)1 h 內(nèi)可獲得72%提取產(chǎn)率。Kwon［7］采用亞臨界溶劑萃取法,通過改變溫度(110～150 ℃)、時(shí)間(1 ～10 min)、壓力(5 ～100 MPa)、固-溶比,從姜黃中提取3種姜黃色素,發(fā)現(xiàn)其最大產(chǎn)率為13.58%,該方法更快更有效,有可能開發(fā)出用于提取類姜黃素的商業(yè)方法。

目前,對(duì)于姜黃素的提取已開發(fā)出多種技術(shù),發(fā)展得也較為成熟。其中,酸堿水提取需在強(qiáng)酸、強(qiáng)堿條件下轉(zhuǎn)換以使目標(biāo)物析出,使得姜黃素性質(zhì)不夠穩(wěn)定,并且提取后有大量淀粉存在而影響進(jìn)一步精制；酶提取是在堿水提取基礎(chǔ)上作進(jìn)一步改進(jìn)以縮短提取時(shí)間,提高提取率,但反應(yīng)條件及堿度難以控制,不易在生產(chǎn)上推廣使用；超臨界CO2流體提取溶劑經(jīng)濟(jì)無(wú)毒,不易參加反應(yīng),易于分離,但提取壓力、溫度、CO2消耗量、夾帶劑等因素顯著影響萃取率；傳統(tǒng)醇提取工藝簡(jiǎn)單,反應(yīng)條件易于控制,環(huán)境友好,容易在生產(chǎn)中推廣應(yīng)用,但提取時(shí)間往往較長(zhǎng),提取效率、收率較低；超聲提取可明顯提高收率,操作簡(jiǎn)便易行,但受超聲波衰減因素制約,其有效作用區(qū)域?yàn)橐画h(huán)形,如果提取罐直徑太大,在罐周壁就會(huì)形成超聲空白區(qū),不利于提取完整而影響回收率；加速溶劑萃取法操作簡(jiǎn)便,耗時(shí)短,測(cè)定結(jié)果偏差小,回收率高,適合在生產(chǎn)中推廣使用。由此可知,在提取技術(shù)研發(fā)中提取溶劑、提取方法聯(lián)用是發(fā)展趨勢(shì),開發(fā)出一種經(jīng)濟(jì)高效的提取方法并應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn),將是姜黃素今后開發(fā)利用的重要步驟。

1.2 分離制備 經(jīng)過粗提取所得姜黃素中常含有姜黃脂肪、姜黃樹脂等,使其純度較低,所含雜質(zhì)也影響后期使用,故必須對(duì)粗品作進(jìn)一步分離純化。傳統(tǒng)分離純化方法通常為酸堿沉淀法、溶劑萃取法、活性炭吸附柱層析法、硅膠色譜法、聚酰胺吸附法、正丙醇重結(jié)晶法、大孔樹脂吸附法,近年來(lái)高速逆流色譜技術(shù)、分子印跡技術(shù)快速發(fā)展,并應(yīng)用到姜黃色素的分離純化中。

Inoue 等［8］采用高速逆流色譜法(HSCCC),以正己烷-氯仿-甲醇-水(5 ∶10 ∶7.5 ∶2.5) 組成的簡(jiǎn)單兩相溶劑系統(tǒng)分離純化姜黃素、去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素,從25 mg 姜黃粉中可分離得到1.1 mg 姜黃素、0.6 mg 去甲氧基姜黃素、0.9 mg 雙去甲氧基姜黃素(含有量＞98%)。該方法最大優(yōu)點(diǎn)是每次進(jìn)樣量比較大,可達(dá)到毫克級(jí),甚至克級(jí),而且是無(wú)載體的分離,故不存在載體吸附,樣品利用率很高。

分子印跡技術(shù)是結(jié)合高分子化學(xué)、生物化學(xué)等學(xué)科發(fā)展起來(lái)的一門邊緣學(xué)科,是具備特異識(shí)別功能的新興技術(shù),分子印跡聚合物是基于抗原-抗體結(jié)合原理制得的具有預(yù)定性、穩(wěn)定性及特異性識(shí)別功能的一種新技術(shù)材料。Wulandari 等［9］以姜黃素作為模板,N-(2-氨基乙基) 甲基丙烯酰胺(EAMA) 為功能單體,乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA) 為交聯(lián)劑,乙腈/二甲基亞砜(90%) 為致孔劑,通過非共價(jià)結(jié)合法制備對(duì)姜黃素具有靶向選擇性的分子印跡聚合物,用于分離純化姜黃提取液中該成分,測(cè)得聚合物對(duì)姜黃素的IF 值為3.5；Sedghi 等［10］在分子印跡聚合物基礎(chǔ)上輔以四氧化三鐵納米粒子,以丙烯酸修飾后β-環(huán)糊精和NIPAM 為功能單體,姜黃素為目標(biāo)靶分子,制備含磁性納米粒子的熱敏分子印跡聚合物(TMMIP),它結(jié)合了磁性材料的良好超順磁性和分子印跡聚合物的高選擇性吸附,在特異性吸附過程完成后通過外加磁場(chǎng),即可實(shí)現(xiàn)對(duì)吸附劑與吸附液的分離,并且省去離心步驟,具有快速、高效、低成本的優(yōu)點(diǎn)。

2 含有量測(cè)定

2.1 中藥材及其提取物中 中藥材及其中藥提取物中姜黃素含有量測(cè)定方法主要有分光光度法、薄層色譜法、高效液相色譜法、高效液相色譜法串聯(lián)熒光或質(zhì)譜檢測(cè)、氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜、高效毛細(xì)管區(qū)帶電泳法等。楊海玲等［11］采用RP-HPLC 并建立一測(cè)多評(píng)法對(duì)廣西姜黃飲片中3 種姜黃素含有量進(jìn)行測(cè)定,方法簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確,能夠在對(duì)照品短缺的情況下用于姜黃多指標(biāo)成分測(cè)定；Anubala［12］建立了一種簡(jiǎn)便、快速、高效的非水毛細(xì)管電泳法(NACE)來(lái)同時(shí)測(cè)定姜黃草藥中3 種姜黃素,通過超聲提取出色素粗提液,過濾后直接注射在具有反向極性的熔融石英毛細(xì)管中,輔以28 kV 的電壓進(jìn)行分離測(cè)定,3 種姜黃色素的檢出限和定量限分別小于5、14.6 μg/mL；Shen 等［13］以加壓液相萃取法萃取姜黃素,液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定莪術(shù)、郁金中3 種姜黃素含有量,分析時(shí)間明顯縮短,溶劑消耗少。

2.2 中藥制劑中 嚴(yán)建偉等［14］采用熒光分光光度法測(cè)定姜黃膠囊制劑中姜黃素含有量,以四氫呋喃為溶劑,姜黃素的激發(fā)波長(zhǎng)、發(fā)射波長(zhǎng)分別為442、475 nm,線性范圍0.010～0.40 μg/mL,最低檢測(cè)濃度5 ng/mL,該方法簡(jiǎn)便、快速、靈敏,但所用溶劑為四氫呋喃,毒性較大,不易回收,不符合綠色化學(xué)的要求,故有一定局限性；黃寶美等［15］通過毛細(xì)管電泳柱端安培檢測(cè)法對(duì)脂可平膠囊中姜黃素含有量進(jìn)行測(cè)定,以微Pt 為工作電極,電位為+1.0 V,以甲醇-乙醇-水(5 ∶2 ∶3) 為非水介質(zhì),磷酸二氫鉀和硼砂(pH 9.5) 為緩沖體系,與高效液相色譜法相比具有簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、消耗試劑少、測(cè)試費(fèi)用低、不污染環(huán)境等優(yōu)點(diǎn)。然而,以上2 種方法操作繁瑣,檢測(cè)靈敏度不高,在后續(xù)發(fā)展中并未被廣泛使用。

近年來(lái),HPLC 法已被默認(rèn)為中藥制劑含有量首選測(cè)定方法,如肖會(huì)敏［16］采用HPLC 法測(cè)定復(fù)方姜黃片制劑中姜黃素含有量,具有分析速度快、方法重復(fù)性好、專屬性強(qiáng)的特點(diǎn)。而且該成分含有量測(cè)定方法不斷更新發(fā)展,如庫(kù)倫滴定法、薄層掃描法、紫外分光光度法、液相色譜聯(lián)用質(zhì)譜法、氣相色譜聯(lián)用質(zhì)譜法等,體外分析方法見表1。

表1 姜黃素體外分析方法

由表可知,在本文所統(tǒng)計(jì)的33 篇相關(guān)文獻(xiàn)中有13 篇為HPLC 法,可見該方法具有普遍實(shí)用性,檢測(cè)限可達(dá)到0.01 ng,而且該方法操作簡(jiǎn)單,檢測(cè)靈敏度比紫外分光光度法、薄層色譜法高,也比液相色譜聯(lián)用質(zhì)譜法經(jīng)濟(jì),更易被大眾接受。

2.3 體內(nèi)分析

2.3.1 樣品前處理 常用的生物樣品前處理方法有液-液萃取法、蛋白沉淀法、固相萃取法,而目前應(yīng)用于姜黃素的主要為液-液萃取法和蛋白沉淀法。許漢林等［43］以乙酸乙酯進(jìn)行液-液萃取,而袁凱龍等［44］以二氯甲烷進(jìn)行液-液萃取,它作為萃取劑時(shí)相對(duì)其他有機(jī)溶劑更有效,但其毒性較大,有一定局限性；蛋白沉淀法常用乙腈或甲醇等有機(jī)溶劑使蛋白沉淀,與液液萃取相比其前處理速度快,但樣品濃度容易被稀釋,易造成色譜柱堵塞等問題,Li 等［45］用乙腈在96 孔板上將血漿樣品進(jìn)行沉淀,該方法簡(jiǎn)便易行,處理速度快,樣品濃度稀釋倍數(shù)少,滿足FDA 對(duì)靈敏度的要求,并且蛋白沉淀完全,對(duì)色譜柱損傷減少,故在一定程度略優(yōu)于液液萃取。

2.3.2 分析方法建立 相對(duì)于體內(nèi)分析,體外分析方法大多針對(duì)基體較簡(jiǎn)單的體系,而并非復(fù)雜的生物樣品。對(duì)姜黃素進(jìn)行藥動(dòng)學(xué)研究后發(fā)現(xiàn),該成分幾乎不溶于水,體內(nèi)吸收較差,易被代謝,故急需建立其體內(nèi)分析方法。目前,體內(nèi)分析應(yīng)用較多的方法是HPLC 法,也是姜黃素主要分析方法,此外還有LC/MS-MS、UPLC/MS-MS、毛細(xì)管電泳法等,見表2。

表2 姜黃素體內(nèi)分析方法

高效毛細(xì)管電泳(CE) 是快速、簡(jiǎn)便、靈敏的分離技術(shù),相對(duì)于HPLC 毛細(xì)管電泳具有耗時(shí)短、高效、進(jìn)樣量少、經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn),但其重復(fù)性較差；熒光分光光度法具有分析靈敏度高、選擇性好、樣品用量少、操作簡(jiǎn)便的特點(diǎn),但其根據(jù)物質(zhì)熒光譜線位置及其強(qiáng)度進(jìn)行定性鑒定和定量測(cè)定,而中藥材及其復(fù)方制劑成分復(fù)雜,具有熒光性的物質(zhì)可能不只有一個(gè),故該方法推廣使用具有局限性；GC/MS-MS 檢測(cè)限、靈敏度均較高,可經(jīng)譜庫(kù)檢索,精準(zhǔn)定量,但所分析物質(zhì)必須為可氣化、易揮發(fā)性,故通常需要衍生化樣品,導(dǎo)致前處理復(fù)雜且費(fèi)時(shí)；HPLC/MS-MS 法靈敏度高,專屬性好,干擾少,而且UPLC/MS-MS 法較其靈敏度更高,可有效縮短分析周期,但是LC/MS-MS 儀器價(jià)格昂貴,消耗大,基質(zhì)效應(yīng)難以克服；Li 等［45］所采用的HPLC-UV 法雖然靈敏度不如LC/MS-MS,但符合FDA 要求,并且分析周期僅為3 min,與常規(guī)LC/MS-MS 分析周期接近,性價(jià)比更高。

3 結(jié)語(yǔ)

目前,姜黃素依仍然是當(dāng)今藥學(xué)、食品科學(xué)等方面的研究熱點(diǎn),有關(guān)該成分提取分離方法、體內(nèi)外分析技術(shù)已有大量文獻(xiàn)報(bào)道,但都各有優(yōu)劣。因此,需不斷發(fā)掘更新,彌補(bǔ)不足,以期開發(fā)出一種更經(jīng)濟(jì)、環(huán)保、高效的方法來(lái)提取分離、分析測(cè)定姜黃素。