獨活的質(zhì)量評價

王計瑞, 譚 均, 李隆云*, 丁 剛

(1.重慶市中藥研究院,重慶市中藥良種選育與評價工程技術研究中心,重慶市中藥資源學重點實驗室,重慶400065；2.中國中醫(yī)科學院中藥資源中心,重慶400065；3.西南大學藥學院,重慶400716)

獨活為傘形科植物重齒毛當歸Angelica pubescens Maxim.f.biserrata Shan et Yuan 的干燥根,其性微溫,味辛、苦,具有祛風除濕、通痹的作用［1］。它主要為栽培品,在重慶、湖北、陜西等地廣泛種植［2］。

現(xiàn)代藥理研究表明,獨活中二氫歐山芹醇具有抗炎、修復紫外損傷的角質(zhì)細胞等作用［3-5］；異歐前胡素具有鎮(zhèn)痛作用,能顯著減少醋酸所致小鼠的扭體次數(shù)［6-7］；揮發(fā)油具有抗炎、鎮(zhèn)痛作用［8］,均與獨活通痹止痛的藥理作用密切相關；此外也有研究報道醇提物具有抗腫瘤、抗血管生成作用［9-10］。2015 年版《中國藥典》 主要從性狀、鑒別、檢查,以及蛇床子素、二氫歐山芹醇當歸酸酯2 種香豆素類成分含有量方面對獨活質(zhì)量進行檢驗,未涉及浸出物、揮發(fā)油及二氫歐山芹醇、 異歐前胡素含有量［1］。

本研究對獨活藥材、飲片2 種規(guī)格進行水分、灰分、浸出物、揮發(fā)油、二氫歐山芹醇、蛇床子素、異歐前胡素、二氫歐山芹醇當歸酸酯含有量測定,并運用統(tǒng)計學方法進行分析評價,探究其相關性及各樣品之間質(zhì)量差異性,以期為更全面地評價該藥材質(zhì)量提供依據(jù)。

1 材料

Agilent 1260 高效液相色譜儀(DAD 檢測器,美國安捷倫科技公司)；UV2600 紫外分光光度計(日本島津公司)；Milli-Q Integral5 純水儀(美國密里博公司)；BT224S 電子天平［萬分之一,賽多利斯科學儀器(北京) 有限公司］；CPA225D電子天平［十萬分之一,賽多利斯科學儀器(北京) 有限公司］；SB-4200DTD 超聲波清洗機(寧波新芝生物科技股份有限公司)；8-10 馬弗爐(沈陽市節(jié)能電爐廠)；KDM 可調(diào)控溫電熱套(山東鄄城華魯電熱儀器有限公司)；XMTB 數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋(上海躍進醫(yī)療器械有限公司)；G2X-9240MBE 電熱鼓風干燥箱(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠)。

乙腈(色譜純,美國Tedia 公司)；其他試劑均為優(yōu)級純或分析純；水為超純水。對照品蛇床子素(批號MUST-16012417)、二氫歐山芹醇當歸酸酯(批號MUST-16022403)、異歐前胡素 (批號MUSY-16032410) 均購自成都曼斯特生物科技有限公司；二氫歐山芹醇(批號Z08A7S12651) 購自上海源葉生物科技有限公司,含有量＞98%。

獨活藥材采收于重慶、湖北、陜西等地或購自成都荷花池藥材市場,飲片購自各地區(qū)大藥房,共18 批,經(jīng)重慶市中藥研究院李隆云研究員鑒定為傘形科植物重齒毛當歸Angelica pubescens Maxim.f.biserrata Shan et Yuan 的干燥根,具體見表1。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法與結果

2.1 水分、灰分及揮發(fā)油檢測 按照《中國藥典》 第四部相關方法進行檢測,結果見表2。

表2 樣品常規(guī)項檢查結果（%）Tab.2 Results of routine tests of samples（%）

結果表明,18 批樣品水分含有量在3.00%～11.00%之間,有1 批(YP-8) 略超出 《中國藥典》 規(guī)定,可能是在銷售過程中密封不當所致,其他批次均符合《中國藥典》 規(guī)定；總灰分含有量在4.30%～7.44%之間,酸不溶性灰分含有量在0.73%～2.55%之間,各批樣品均符合 《中國藥典》 要求。另外,揮發(fā)油含有量在0.30%～0.35%之間,藥材與飲片差異不大。

2.2 浸出物檢測

2.2.1 浸提方法優(yōu)化 按照《中國藥典》 第四部(通則2201) 方法,分別用冷浸法和熱浸法制備乙醇浸出物,并測定2 種方法所得浸出物中總香豆素提取率［11-12］和浸膏得率,結果見表3。

結果表明,采用熱浸法的浸膏得率和總香豆素提取率均高于冷浸法,故選擇其作為獨活浸出物的制備方法。

表3 不同浸出方法對樣品的影響n=3）Tab.3 Effects of different leaching methods on samples，n=3）

表3 不同浸出方法對樣品的影響n=3）Tab.3 Effects of different leaching methods on samples，n=3）

方法 浸膏得率/% 總香豆素提取率/%冷浸法 11.18±0.43 2.32±0.04熱浸法 23.14±0.96 2.74±0.04

2.2.2 浸提溶劑優(yōu)化 按照《中國藥典》 第四部(通則2201) 熱浸法, 以無水乙醇、80%乙醇、60%乙醇、50%乙醇、40%乙醇、20%乙醇、純水作為浸提溶劑,測定各組浸出物中總香豆素提取率和浸膏得率,結果見表4。

表4 不同浸出溶劑對樣品的影響，n=3）Tab.4 Effects of different leaching solvents on samples，n=3）

表4 不同浸出溶劑對樣品的影響，n=3）Tab.4 Effects of different leaching solvents on samples，n=3）

注：同一指標不同小寫字母表示有顯著差異(P＜0.05)

提取溶劑 浸膏得率/% 總香豆素提取率/%1 8 6 5 4 2 0 0 0 0 0 0 0純%%%%%%乙乙乙乙乙水乙醇醇醇醇醇醇 2 4 4 4 4 5 5 3 2 7 8 9 0 2.......1 7 4 2 2 8 5 4 7 5 4 5 7 8±±±±±±±0 0 0 0 0 2 0.......9 6 4 2 1 9 3 6 9 5 5 9 0 2 edcbaaa bb c c 2 3 4 4 3 2 1.......7 4 8 0 8 3 2 1 7 1 0 7 0 3±±±±±±±0 0 0 0 0 0 0.......0 0 2 1 0 0 0 9 7 0 3 6 5 4 dcabbef

結果表明,隨著浸出溶劑中水比例的增加,浸膏得率增加,其中以40%～60%乙醇為溶劑所得的浸膏量無顯著性差異(P＞0.05)；總香豆素提取率則是先升后降,60%乙醇顯著優(yōu)于其他組 (P ＜0.05)。最終,選擇60%乙醇作為熱浸法的浸出溶劑。

2.2.3 浸出物測定 采用熱浸法,以60%乙醇作為浸提溶劑,檢測18 批樣品浸出物含有量,結果見表2。 由表可知,60%乙醇浸出物含有量在40.67%～51.69%之間,整體上飲片高于藥材。

2.3 香豆素類成分含有量測定

2.3.1 色譜條件 SWELL ChromplusTMC18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流動相乙腈(A)-水(B),梯度洗脫 (0 ～6 min,45%A；6 ～7 min,45% ～49%A；7 ～35 min,49%A；35 ～38 min,49%～ 45%A；38 ～40 min,45%A)； 體積流量1.0 mL/min；檢測波長325 nm；柱溫25 ℃；進樣量10 μL。色譜圖見圖1。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.3.2 對照品溶液制備 精密稱取二氫歐山芹醇、蛇床子素、異歐前胡素、二氫歐山芹醇當歸酸酯適量,加甲醇制成相應溶液,分別量取適量,甲醇定容,搖勻,即得(質(zhì)量濃度分別為36.80、568.40、22.60、168.80 μg/mL),再稀釋得到梯度溶液。

2.3.3 供試品溶液制備 精密稱取干燥藥材粉末(過5 號篩) 0.5 g, 置具塞錐形瓶中, 加甲醇20 mL,稱定質(zhì)量,于25 ℃超聲(功率400 W、頻率40 kHz) 處理20 min,冷卻,甲醇補足減失的質(zhì)量,搖勻,0.45 μm 微孔濾膜過濾,即得。

2.3.4 線性關系考察 在“2.3.1” 項色譜條件下,將對照品溶液進樣測定。以各對照品溶液峰面積為縱坐標(Y),質(zhì)量濃度為橫坐標(X) 進行回歸,結果見表5。

2.3.5 檢測限與定量限 配制不同質(zhì)量濃度的對照品溶液,在“2.3.1” 項色譜條件下進樣,以信噪比為3 ∶1 時考察檢測限,10 ∶1 時考察定量限,結果見表5。

2.3.6 精密度試驗 取同一對照品溶液, 在“2.3.1” 項色譜條件下連續(xù)進樣6 次,測得二氫歐山芹醇、蛇床子素、異歐前胡素、二氫歐山芹醇當歸酸酯峰面積RSD 分別為0.10%、 0.04%、0.68%、0.06%,表明儀器精密度良好。

2.3.7 重復性試驗 取同一藥材,按“2.3.3”項下方法平行制備6 份供試品溶液,在“2.3.1”項色譜條件下進樣,測得二氫歐山芹醇、蛇床子素、異歐前胡素、二氫歐山芹醇當歸酸酯峰面積RSD 分別為1.03%、0.29%、0.44%、0.33%,表明該方法重復性良好。

表5 各成分線性關系及檢測限、定量限Tab.5 Linear relationships of various constituents，LOQs and LODs

2.3.8 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液, 在“2.3.1” 項色譜條件下于0、2、4、8、12、24 h進樣,測得二氫歐山芹醇、蛇床子素、異歐前胡素、二氫歐山芹醇當歸酸酯峰面積RSD 分別為1.09%、0.71%、0.51%、3.23%,表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.9 加樣回收率試驗 精密稱取含有量已知的同一藥材9 份,每份0.25 g,精密加入一定量二氫歐山芹醇、蛇床子素、異歐前胡素、二氫歐山芹醇當歸酸酯對照品溶液,按“2.3.3” 項下方法制備供試品溶液,在“2.3.1” 項色譜條件下進樣,計算回收率,結果見表6。

表6 各成分加樣回收率試驗結果（n=9）Tab.6 Results of recovery tests for various constituents（n=9）

2.3.10 樣品含有量測定 按“2.3.3” 項下方法平行制備3 份供試品溶液,在“2.3.1” 項色譜條件下進樣,計算含有量,結果見表7。

表7 各成分含有量測定結果，n=3）Tab.7 Results of content determination of various constituentsn=3）

表7 各成分含有量測定結果，n=3）Tab.7 Results of content determination of various constituentsn=3）

注：＃表示低于藥典規(guī)定

編號 二氫歐山芹醇/% 蛇床子素/% 異歐前胡素/% 二當氫歸歐酸山酯芹/%醇主合成得分分分排析序綜YC-1 0.010 6±0.000 1 0.805 5±0.005 3 0.019 5±0.000 1 0.158 4±0.001 0 13 YC-2 0.066 6±0.000 6 0.785 6±0.003 6 0.027 7±0.000 1 0.290 4±0.001 8 3 YC-3 0.480 5±0.004 9 1.477 6±0.015 8 0.066 1±0.000 5 0.173 6±0.001 9 1 YC-4 0.005 6±0.000 0 0.578 1±0.001 3 0.016 6±0.000 0 0.081 2±0.000 2 18 YC-5 0.024 3±0.000 2 1.799 9±0.014 0 0.032 1±0.000 3 0.224 5±0.001 8 2 YC-6 0.066 7±0.001 2 1.258 6±0.007 7 0.023 5±0.000 1 0.129 7±0.008 7 7 YC-7 0.025 1±0.000 1 1.241 1±0.032 7 0.016 3±0.000 4 0.111 0±0.004 0 15 YC-8 0.024 1±0.000 5 0.714 0±0.008 5 0.032 8±0.000 4 0.216 8±0.002 7 5 YC-9 0.023 0±0.000 7 0.668 9±0.012 2 0.039 6±0.000 9 0.062 4±0.002 0＃ 12 YP-1 0.037 1±0.000 1 0.565 8±0.004 2 0.030 5±0.000 2 0.077 8±0.001 1＃ 17 YP-2 0.029 3±0.000 2 0.707 3±0.027 6 0.025 4±0.001 1 0.249 8±0.010 1 6 YP-3 0.048 6±0.002 5 0.814 2±0.025 7 0.024 1±0.000 6 0.145 2±0.002 5 9 YP-4 0.023 8±0.000 2 0.683 7±0.005 8 0.038 7±0.000 4 0.099 2±0.004 8 8 YP-5 0.041 1±0.000 1 0.508 6±0.000 8 0.025 5±0.000 2 0.160 4±0.004 5 10 YP-6 0.044 9±0.000 2 0.654 7±0.001 7 0.022 1±0.000 2 0.318 4±0.001 4 4 YP-7 0.040 0±0.000 9 0.669 4±0.018 2 0.027 7±0.000 8 0.125 8±0.003 0 11 YP-8 0.028 5±0.000 1 0.781 5±0.004 4 0.024 0±0.000 2 0.119 1±0.000 4 14 YP-9 0.014 4±0.000 3 0.667 6±0.007 6 0.030 3±0.000 3 0.086 6±0.000 4 16藥典規(guī)定 - 0.50 - 0.08 -

結果表明,18 批樣品中蛇床子素含有量為0.508 6%～1.799 9%,均符合《中國藥典》 標準；二氫歐山芹醇當歸酸酯含有量為0.062 4%～0.318 4%,藥材、飲片各有1 批低于《中國藥典》標準,均為市場購買所得；二氫歐山芹醇含有量為0.005 6% ～0.480 5%, 異歐前胡素含有量為0.016 3%～0.066 1%。

2.4 化學計量學方法分析

2.4.1 相關性分析 影響中藥材質(zhì)量的各指標并不只是孤立的個體,它們之間往往具有一定的相關性,浸出物、揮發(fā)油和香豆素類成分含有量是評價獨活質(zhì)量的重要指標。本研究運用SPSS 20.0 軟件,對影響獨活質(zhì)量的6 個指標(60%乙醇浸出物、揮發(fā)油、二氫歐山芹醇、蛇床子素、異歐前胡素和二氫歐山芹醇當歸酸酯含有量) 進行相關性分析,結果見表8,可知15 對指標組合中僅有3對具有顯著(P＜0.05) 或極顯著(P＜0.01) 相關性,其中揮發(fā)油分別與二氫歐山芹醇、異歐前胡素呈現(xiàn)顯著、極顯著正相關性,二氫歐山芹醇與異歐前胡素呈現(xiàn)極顯著正相關性。

表8 相關性分析結果Tab.8 Results of correlation analysis

2.4.2 聚類分析 運用SPSS 20.0 軟件,以余弦距離作為度量標準,以6 個指標為變量,對18 批樣品進行系統(tǒng)聚類分析,共被分為2 大類,結果見圖2,可知飲片樣品和半數(shù)原藥材樣品歸為Ⅰ類,有4 批原藥材樣品被歸為第Ⅱ類。由此表明,飲片樣品之間質(zhì)量較均一,原藥材樣品質(zhì)量差異性較大,表明通過飲片加工過程可使獨活質(zhì)量趨于均一。

圖2 18 批樣品聚類樹狀圖Fig.2 Dendrogram of eighteen batches of samples

2.4.3 主成分分析 以獨活中二氫歐山芹醇、蛇床子素、異歐前胡素、二氫歐山芹醇當歸酸酯含有量作為變量,特征值和累計貢獻率作為判定依據(jù),運用SPSS 20.0 軟件對不同產(chǎn)地獨活進行主成分分析。根據(jù)降維結果,共挑選出3 個主成分PC1、PC2、PC3,特征值分別為2.102、1.046、0.680。各成分方差貢獻值分別為52.553%、26.159%、16.991%,累積貢獻值達到95.702%,代表性強,可以用來評價獨活的質(zhì)量,結果見表9,表明PC1和PC3 主要反映的是二氫歐山芹醇、異歐前胡素、蛇床子素含有量信息,PC2 主要反映的是二氫歐山芹醇當歸酸酯含有量信息。

表9 各成分因子載荷矩陣Tab.9 Factor load matrices of various constituents

根據(jù)各因子載荷矩陣及特征值計算得分系數(shù),進一步得到PC1、PC2、PC3 及綜合得分(Y) 方程式為PC1 ＝0.642BX1+0.459BX2+0.602BX3-0.122BX4、PC2 ＝-0.096BX1+0.274BX2-0.291BX3+0.911BX4、PC3 ＝0.222BX1-0.838BX2+0.325BX3+0.378BX4,其中BX1、BX2、BX3、BX4分別為二氫歐山芹醇、蛇床子素、異歐前胡素、二氫歐山芹醇當歸酸酯的標準化值；Y＝0.549PC1+0.273PC2+0.178PC3。

利用上式計算各批獨活質(zhì)量綜合得分并按結果進行排序,見表7,得分越高,表明獨活質(zhì)量越好,排名越靠前。主成分散點圖見圖3,可知有4批原藥材(YC-3、YC-5、YC-6、YC-7) 因3 個主成分均與其他樣品有較大差異而分布較為離散；其他樣品之間PC1 和PC3 差異不大,但因PC2 不同而呈現(xiàn)縱向延伸分布。結合表9 可知,各飲片之間二氫歐山芹醇、蛇床子素、異歐前胡素含有量差異不大,但二氫歐山芹醇當歸酸酯含有量卻存在一定差異,故沿PC2 軸方向分布；藥材之間4 種成分含有量均有較大差異,故呈離散分布,表明未經(jīng)篩選、加工的原藥材質(zhì)量不如飲片穩(wěn)定,整體上分類結果與聚類分析一致。

圖3 各成分主成分分析散點圖Fig.3 Scatter diagram of principal component analysis of various constituents

3 討論

《中國藥典》 中未規(guī)定獨活的浸出物限度,但其又是反映中藥材質(zhì)量的重要指標［13-14］,代表的是多種模糊性成分的量。本研究優(yōu)化并確定了獨活浸出物的浸提方式和浸提溶劑,其60%乙醇浸出物含有量可達40%以上。

本研究建立了HPLC 法同時測定獨活中4 種成分的含有量,較《中國藥典》 多增加2 種成分,而且該方法簡單、穩(wěn)定,易于購買相應的對照品。相關性分析結果表明,增加的2 種成分與揮發(fā)油之間具有顯著相關性,這與三者均具有較好的抗炎、鎮(zhèn)痛等藥理作用相一致。因此,二氫歐山芹醇、異歐前胡素、揮發(fā)油含有量也應作為評價獨活質(zhì)量的主要指標。

浸出物和4 種成分含有量檢測結果表明,與藥材比較,飲片質(zhì)量更優(yōu)、更穩(wěn)定,2 種規(guī)格中揮發(fā)油含有量差異不大,表明獨活藥材加工成飲片后對其揮發(fā)性成分影響不明顯。飲片在聚類分析和主成分分析時表現(xiàn)出更好的聚集性,表明藥材經(jīng)過篩選和加工處理后質(zhì)量更趨均一。

原藥材質(zhì)量的不穩(wěn)定性增加了后續(xù)飲片加工和質(zhì)量控制的難度,因此應保障生產(chǎn)源頭的質(zhì)量。目前,獨活以栽培品為主,大多以個體戶形式種植,而種植、采收、初加工技術對中藥材品質(zhì)有著重要的影響［15-16］。因此,應當推廣獨活規(guī)范化種植技術,確立合理的采收時間及統(tǒng)一、有效的初加工技術,從而保證該藥材質(zhì)量的穩(wěn)定。