HPLC 法同時測定桑白皮中5 種成分

袁 婷, 鄭甜碧, 謝魯靈楓, 成勝榮, 魏 淵, 歐陽 臻

(江蘇大學(xué)藥學(xué)院,江蘇 鎮(zhèn)江212013)

桑白皮為桑科植物桑Morus alba L.的干燥根皮,秋末葉落時至次春發(fā)芽前采挖根部,刮去黃棕色粗皮,縱向剖開, 剝?nèi)「? 曬干, 其性甘、寒,歸肺經(jīng),具有瀉肺平喘、利水消腫的功效,主要用于治療肺熱喘咳、水腫脹滿、尿少、面目肌膚浮腫等疾?。?］,含有黃酮類、茋類、多羥基生物堿類、Diels-Alder 型加合物、三萜、甾體、多糖、氨基酸等多種化學(xué)成分［2-6］?，F(xiàn)代藥理研究表明,桑白皮具有利尿、鎮(zhèn)咳、平喘、降血壓、降血糖、抗癌等多種藥理活性［7-11］,但2015 版《中國藥典》桑白皮僅以外觀性狀、顯微、薄層鑒別作為質(zhì)量控制的標(biāo)準(zhǔn),未對內(nèi)在成分進行分析。本研究前期通過高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-MS) 法對桑白皮藥材甲醇提取物進行分析,鑒定出7 個化合物,分別是綠原酸、二氫桑色素、氧化白藜蘆醇、桑辛素O、桑根酮C、桑根酮醇A 和桑根皮醇,選擇其中5 個含有量較高的(綠原酸、二氫桑色素、氧化白藜蘆醇、桑辛素O、桑根酮C) 進行測定,建立HPLC 法同時測定其含有量。桑白皮傳統(tǒng)上以色白、皮厚、粉性足者為佳［12］,本實驗選擇桑白皮藥材厚度作為指標(biāo),分析桑白皮藥材厚度與這5 種成分之間的相關(guān)性,以期為其質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料

安捷倫1260 高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)；HH-S 數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠)；ZF 超聲波清洗機(上海致豐科技有限公司)；DHG-9240A 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科技有限公司)；FA1204B 分析天平(上海精科-上海天平儀器廠)。

對照品綠原酸(327-97-9) (南京源植生物科技有限公司)；二氫桑色素(BBW-148746) (北京百歐博偉生物技術(shù)有限公司)； 氧化白藜蘆醇(RM-0489) (成都麥德生科技有限公司)；桑辛素O(BBW-148745) (北京百歐博偉生物技術(shù)有限公司)；桑根酮C(GCB-111450) (上海穎心實驗室設(shè)備有限公司)。桑白皮購自安徽亳州、四川荷花池、河北安國、廣西玉林中藥材市場,同時在江蘇、安徽、四川等地采集,均為生品,由江蘇大學(xué)藥學(xué)院歐陽臻教授鑒定為?？浦参锷orus alba L.的干燥根皮,具體見表1。甲醇、乙腈為色譜純；其余試劑為分析純。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Dimonsiol C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流動相乙腈(A) -0.2% 甲酸(B),梯度洗脫(0 ～10 min,20%～35%A；10 ～15 min,35%～50%A；15 ～25 min,50%～60%A；25～30 min,60%A；30 ～50 min,60%～80%A)；體積流量1.0 mL/min； 柱溫30 ℃； 檢測波長340 nm；進樣量10 μL。色譜圖見圖1。

2.2 供試品溶液制備 藥材粉碎,精密稱取1 g,置于50 mL 圓底燒瓶中, 加入20 mL 甲醇, 于70 ℃水浴加熱回流1 h,濾過,定容至25 mL,過0.45 μm 微孔濾膜,即得。

2.3 對照品溶液制備 精密稱取綠原酸、二氫桑色素、氧化白藜蘆醇、桑辛素O、桑根酮C 對照品0.52、0.77、0.86、0.30、1.79 mg,甲醇溶解并定容于5 mL 量瓶中,即得。

2.4 線性關(guān)系考察 按“2.3” 項下方法制備對照品溶液,逐級吸取1 mL 定容至2 mL,稀釋成不同質(zhì)量濃度的6 份溶液,分別進樣10 μL。以峰面積為縱坐標(biāo) (Y), 對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X),進行回歸,結(jié)果見表2。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

表2 各成分線性關(guān)系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.5 精密度試驗 取同一供試品溶液,在“2.1”項條件下連續(xù)進樣6 次,每次10 μL,測得各成分峰面 積 RSD 分 別 為 1.99%、 0.86%、 0.87%、1.09%、0.96%,表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗 取同一批樣品6 份,按“2.2”項下方法平行制備6 份供試品溶液,在“2.1” 項條件下進樣10 μL,測得各成分峰面積RSD 分別為0.80%、2.76%、 1.98%、 1.57%、 0.79%, 表明該方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液,在“2.1”項條件下于0、1、2、4、8、16、24 h 各進樣10 μL,測得各成分峰面積RSD 分別為1.99%、1.95%、1.37%、2.30%、0.92%,表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 加樣回收率試驗 取含有量已知的同一批藥材,精 密 加 入 含0.822、 0.208、 0.232、 0.084、0.718 mg/mL 綠原酸、二氫桑色素、氧化白藜蘆醇、桑辛素O、桑根酮C 的對照品溶液0.60、0.80、1.00 mL,按“2.2” 項下方法制備供試品溶液,在 “2.1” 項條件下進樣, 計算回收率,見表3。

2.9 樣品含有量測定 按“2.2” 項下方法制備供試品溶液,在“2.1” 項條件下進樣,測定各樣品中綠原酸、二氫桑色素、氧化白藜蘆醇、桑辛素O、桑根酮C 的含有量,結(jié)果見表4,可知各種成分含有量差異較大。

2.10 外觀性狀與化學(xué)成分相關(guān)性 以藥材厚度為外觀性狀指標(biāo)進行測定,結(jié)果見表5；采用SPSS 20.0 軟件對各成分與藥材厚度進行相關(guān)性分析,結(jié)果見表6,表明藥材厚度與二氫桑色素、桑辛素O 含有量呈顯著正相關(guān),與桑根酮C 含有量呈極顯著正相關(guān)。

表3 各成分加樣回收率試驗結(jié)果（n=6）Tab.3 Results of recovery tests for various constituents（n=6）

表4 各成分含有量測定結(jié)果（mg/g）Tab.4 Results of content determination of various constituents（mg/g）

續(xù)表4

表5 各樣品厚度（mm，Tab.5 Thickness of various samples（mm，

表5 各樣品厚度（mm，Tab.5 Thickness of various samples（mm，

樣品 厚度 樣品 厚度 樣品 厚度S1 3.4±0.89 S17 3.3±0.88 S33 2.3±0.59 S2 3.3±0.94 S18 3.0±0.86 S34 2.3±0.72 S3 1.9±0.63 S19 3.0±1.37 S35 4.5±0.73 S4 1.4±0.39 S20 2.9±0.86 S36 2.4±0.57 S5 1.5±0.43 S21 2.7±1.01 S37 2.5±0.43 S6 1.7±0.41 S22 2.6±0.83 S38 2.5±0.95 S7 2.4±0.61 S23 2.6±0.80 S39 2.7±1.06 S8 2.5±0.92 S24 3.0±0.65 S40 1.9±0.50 S9 3.2±1.08 S25 2.6±0.99 S41 1.2±0.24 S10 2.2±0.81 S26 2.3±0.67 S42 2.5±0.57 S11 1.2±0.32 S27 2.4±0.55 S43 2.7±0.76 S12 1.1±0.27 S28 2.9±0.74 S44 2.5±0.91 S13 1.2±0.30 S29 1.6±0.42 S45 2.4±0.75 S14 2.9±1.14 S30 3.2±1.11 S46 3.0±0.80 S15 2.7±0.76 S31 2.7±0.83 S16 3.2±1.09 S32 2.6±0.56

表6 各樣品外觀性狀與化學(xué)成分相關(guān)性Tab.6 Correlation of appearance and chemical composition of various samples

3 討論

3.1 提取溶劑選擇［13-15］本實驗考察了甲醇和70%乙醇溶劑的提取效果,比較各成分的峰形和含有量,最終選擇甲醇作為提取溶劑。

3.2 檢測波長選擇 為了提高方法的準(zhǔn)確度和靈敏度,在358、340、280 nm 波長下進行考察,發(fā)現(xiàn)340 nm 波長下色譜圖峰形良好,基線平穩(wěn),故選擇其作為檢測波長。

3.3 流動相選擇［13-15］本實驗考察了甲醇-0.2%醋酸、乙腈-0.2%醋酸2 種流動相體系,發(fā)現(xiàn)乙腈-0.2%醋酸洗脫時峰形良好,各成分能有效分離。

3.4 中藥質(zhì)量標(biāo)志物選擇 中藥質(zhì)量標(biāo)志物是中藥材和中藥產(chǎn)品中固有或加工制備過程中形成的、與中藥的功能屬性密切相關(guān)的化學(xué)物質(zhì),作為反映中藥安全性和有效性的標(biāo)示性物質(zhì)進行質(zhì)量控制［16-17］。本研究前期通過LC-MS 法對桑白皮甲醇提取物進行分析,選擇了其中含有量較高的5 個化合物,其中綠原酸具有抗癌、抗病毒作用［13］,二氫桑色素、氧化白藜蘆醇具有抗氧化、神經(jīng)保護作用［18］,桑辛素O 具有抗癌作用［19］,桑根酮C 具有降血壓作用［20］。

2015 版《中國藥典》 無桑白皮內(nèi)在成分指標(biāo),傳統(tǒng)上以色白、皮厚、粉性足者為佳。本實驗建立HPLC 法分析了46 批樣品中5 種成分的含有量,發(fā)現(xiàn)其厚度與二氫桑色素、桑辛素O 含有量呈顯著正相關(guān),與桑根酮C 含有量呈極顯著正相關(guān),表明藥材厚度與化學(xué)成分之間存在一定相關(guān)性。因此,建議將二氫桑色素、桑辛素O、桑根酮C 作為桑白皮質(zhì)量控制指標(biāo)成分,含有量分別不低于0.12、0.05、0.31 mg/g。