厚皮香酚性成分及其鎮(zhèn)痛活性

李驊軒, 崔淑君, 肖朝江, 董 相, 沈 怡, 姜 北

(大理大學藥物研究所藥學與化學學院,云南 大理671000)

山茶科厚皮香屬植物主要分布于中美洲、南美洲、西南太平洋各島嶼、非洲及亞洲等泛熱帶和亞熱帶地區(qū),我國有14 個種,廣泛分布于長江以南各省區(qū),多數(shù)種產(chǎn)于廣東、廣西及云南等省區(qū)［1］。厚皮香Ternstroemia gymnanthera(Wight et Arn.)Beddome 為多年生常綠喬木或灌木,始載于《植物名實圖考》,云“生云南山中,小樹滑葉,如山梔子,開五瓣白花……”,廣泛分布于長江以南各省區(qū)；據(jù)《中華本草》 記載,厚皮香的葉或全株可入藥,性苦、凉,具有清熱解毒、散瘀消腫之功效［2］。有關厚皮香的研究早在上個世紀就已開始,分離鑒定了原花青定苷以及萜類、酚酸類、苯乙醇類等化合物［3-5］；在前期開展的云南藥用植物鎮(zhèn)痛活性篩選研究工作中發(fā)現(xiàn),厚皮香提取物具有較好的鎮(zhèn)痛活性。為了全面了解厚皮香中的相關活性成分,本實驗從該植物95%乙醇提取物乙酸乙酯部位中分離得到8 個酚類化合物,其中化合物1 ～3、5～8 均為首次從該植物中分離得到,1、3、5、7 ～8 為首次從該屬植物中分離得到,1、4、7 具有顯著的鎮(zhèn)痛活性。

1 材料

1.1 儀器與試劑 Bruker Avance Ⅲ-400 型核磁共振儀(德國Bruker 公司)；Agilent 1260 型高效液相色譜儀(美國Agilent 公司)；LC-20 制備型高效液相色譜儀(日本島津公司)；小鼠獨立通氣籠(蘇杭科技器材有限公司)；柱層析硅膠和GF254(青島海洋化工廠)；Sephadex LH-20(瑞典Amersham Biosciences 公司)；反相硅膠RP18(日本Fuji公司)。冰醋酸(上海國藥集團化學試劑責任有限公司)；無菌生理鹽水(天津市風船化學試劑科技有限公司)；阿司匹林(沈陽奧吉娜藥業(yè)有限公司)；石油醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、甲醇等均為工業(yè)級,重蒸后使用。SPF 級昆明種(KM) 小鼠,雌雄各半,許可證號SCXK(湘) 2016-002,體質量18～22 g。

1.2 藥材 樣品于2017 年7 月采自云南省漾濞縣秀嶺,由大理大學姜北教授鑒定為厚皮香Ternstroemia gymnanthera(Wight et Arn.)Beddome,標本(20151008-6) 存放于大理大學藥物研究所姜北教授研究組。

2 提取與分離

厚皮香干燥地上部分(14 kg) 用95%乙醇冷浸提取8 次, 提取液合并濃縮, 得到提取物2.3 kg。將其分散于水中,依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取,得到石油醚、乙酸乙酯、正丁醇部位。

乙酸乙酯部位加入適量粗硅膠(80 ～100 目)拌樣, 經(jīng)300 ～400 目硅膠柱層析, 氯仿-甲醇(1 ∶0～0 ∶1) 溶劑系統(tǒng)梯度洗脫,劃分成7 個部分(A～G)。

B 組分經(jīng)MCI 柱脫色素、 反復硅膠柱色譜(石油醚-丙酮、石油醚-乙酸乙酯、氯仿-丙酮、氯仿-甲醇)、 Sephadex LH-20、 制備型高效液相純化,經(jīng)重結晶處理后得化合物1 (600 mg)、2(1.0 g)、3(1.8 g)、4(148 mg)、7(7 mg)。

D 組分經(jīng)反復硅膠柱色譜(氯仿-丙酮、氯仿-甲醇)、Sephadex LH-20、制備型高效液相純化后得化合物5(5 mg)、6(5 mg)、8(6.5 mg)。

3 結構鑒定

化合物1：黃色結晶 (丙酮)。1H-NMR(400 MHz,CD3COCD3)δ：8.82(1H,s,7-OH),7.85(1H,d,J ＝9.5 Hz,H-4),7.20(1H,s,H-5),6.80(1H,s,H-8),6.18(1H,d,J ＝9.5 Hz,H-3),3.90(3H,s,-OCH3)；13C-NMR(100 MHz,CD3COCD3)δ：161.2(C-2),113.2(C-3),144.6(C-4),112.0(C-4a),109.8(C-5),145.9(C-6),151.7(C-7),103.6(C-8),151.0(C-8a),55.6(-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻［6］ 基本一致,故鑒定為東莨菪內(nèi)酯。

化合物2：黃色油狀物。1H-NMR(400 MHz,CD3COCD3)δ：7.52(1H,d,J ＝2.1 Hz,H-2),7.43(1H,dd,J ＝8.4,2.1 Hz,H-6),7.00(1H,d,J ＝8.4 Hz,H-5),3.91(3H,s,-OCH3)；13CNMR(100 MHz,CD3COCD3)δ：186.0(-COOH),165.8(-C ＝O),125.6(C-1),116.3(C-2),146.1(C-3),153.1(C-4),116.2(C-5),125.4(C-6),52.8(-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻［7］ 基本一致,故鑒定為4-hydroxy-3-(methoxycarbonyl) benzoic acid。

化合物3：無色針晶 (甲醇)。1H-NMR(400 MHz,CD3COCD3)δ：9.76(1H,s,-CHO),7.43(1H,d,J ＝2.0 Hz,H-2),7.36(1H,dd,J ＝8.1,2.0 Hz,H-6),7.03(1H,d,J ＝8.1 Hz,H-5)；13C-NMR (100 MHz, CD3COCD3) δ： 192.0 (-CHO),130.5(C-1),115.1(C-2),146.3(C-3),152.5(C-4),116.0(C-5),125.8(C-6)。以上數(shù)據(jù)與文獻［8］ 基本一致,故鑒定為原兒茶醛。

化 合 物4： 黃 色 固 體。1H-NMR (400 MHz,CD3OD)δ：6.79(1H,d,J ＝2.0 Hz,H-2′),6.72(1H,d,J ＝8.1 Hz,H-5′),6.68(1H,dd,J ＝8.1,2.0 Hz,H-6′),4.64(1H,s,H-2),3.64(3H,s,1-OCH3),3.27(3H,s,2-OCH3)；13C-NMR(100 MHz,CD3OD)δ：173.4(C-1),83.1(C-2),128.8(C-1′),115.4(C-2′),147.0(C-3′),146.5(C-4′), 116.2 (C-5′), 120.4 (C-6′), 52.6 (1-OCH3),57.0(2-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻 ［4］基本一致,故鑒定為methyl 2-methoxy-2-(3,4-dihydroxyphenyl) acetate。

化合物5：褐色油狀物。1H-NMR(400 MHz,CD3OD)δ：6.67(1H,d,J ＝8.0 Hz,H-5),6.65(1H,d,J ＝2.1 Hz,H-2),6.52(1H,dd,J ＝8.0,2.1 Hz,H-6),3.66(2H,t,J ＝7.2 Hz,H-2′),2.66(2H,t,J ＝7.2 Hz,H-1′)；13C-NMR(100 MHz,CD3OD) δ：131.7 (C-1),116.3 (C-2),146.1(C-3),144.6(C-4),117.0(C-5),121.2(C-6),39.7(C-1′),64.6(C-2′)。以上數(shù)據(jù)與文獻［9］ 基本一致,故鑒定為3,4-二羥基苯乙醇。

化合物6：褐色油狀物。1H-NMR(400 MHz,CD3OD)δ：6.70(1H,d,J ＝2.1 Hz,H-2),6.69(1H,d,J ＝8.1 Hz,H-5),6.56(1H,dd,J ＝8.1,2.1 Hz,H-6),3.65(3H,s,-OCH3),3.46(2H,s,H-1′)；13C-NMR(100 MHz,CD3OD)δ：126.9(C-1),116.3(C-2),146.2(C-3),145.4(C-4),117.3(C-5),121.6(C-6),41.1(C-1′),174.6(C-2′),52.4(-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻 ［10］基本一致,故鑒定為3,4-二羥基苯乙酸甲酯。

化合物7： 白色羽狀結晶 (甲醇)。1H-NMR(400 MHz,CD3COCD3)δ：9.85(1H,s,-CHO),7.80(2H,d,J ＝8.7 Hz,H-2,6),7.00(2H,d,J ＝ 8.7 Hz, H-3, 5)；13C-NMR (100 MHz,CD3COCD3) δ： 191.0 (-CHO), 130.4 (C-1),132.8(C-2,6),116.7(C-3,5),163.9(C-4)。以上數(shù)據(jù)與文獻［11］ 基本一致,故鑒定為對羥基苯甲醛。

化 合 物8： 白 色 固 體。1H-NMR (400 MHz,CD3COCD3)δ：6.81(1H,d,J ＝2.2 Hz,H-2),6.75(1H,d,J ＝8.1 Hz,H-5),6.62(1H,dd,J ＝8.1, 2.2 Hz, H-6)；13C-NMR (100 MHz,CD3COCD3)δ：127.2(C-1),115.8(C-2),145.6(C-3),144.7(C-4),117.2(C-5),121.5(C-6),40.7,(C-1′),173.4(C-2′)。 以 上 數(shù) 據(jù) 與 文 獻［12］ 基本一致,故鑒定為3,4-二羥基苯乙酸。

4 鎮(zhèn)痛活性［13-15］

采用小鼠醋酸扭體實驗模型對供試品的鎮(zhèn)痛活性進行測定。小鼠實驗前12 h 禁食不禁水,隨機分為模型組、實驗組、對照組,每組6 只,各供試品劑量為粗提物1 000 mg/kg、單體化合物50 mg/kg,灌胃給藥(0.1 mL/10 g),模型組給予等量溶劑,陽性對照組給予阿司匹林 (200 mg/kg)。 給藥40 min后,每只小鼠腹腔注射0.6%冰醋酸溶液(0.1 mL/10 g),觀察并記錄注射后15 min 內(nèi)扭體潛伏期及扭體次數(shù),按下列公式計算受試物對小鼠醋酸扭體的抑制率,以此評價鎮(zhèn)痛作用。結果見表1。

抑制率＝ ［ (模型組扭體均數(shù)-給藥組扭體均數(shù))/模型組扭體均數(shù)］ ×100%。

由表可知,厚皮香粗提物在1 000 mg/kg 劑量時顯示出一定的鎮(zhèn)痛活性,其乙酸乙酯部位在同等劑量下鎮(zhèn)痛活性有所提高,即為有效活性部位?；衔飫┝吭?0 mg/kg 時,小鼠的扭體次數(shù)較模型組明顯減少, 其中1、 4、 7 有顯著差異 (P ＜0.05),抑制率大于陽性藥阿司匹林,呈現(xiàn)出顯著的鎮(zhèn)痛活性。結合化合物2 ～3 所表現(xiàn)出的抑制小鼠醋酸扭體作用,可知所有化合物均為厚皮香鎮(zhèn)痛活性成分。

表1 鎮(zhèn)痛活性實驗抑制率n=6）Tab.1 Inhibition rates in analgesic activities testsn=6）

表1 鎮(zhèn)痛活性實驗抑制率n=6）Tab.1 Inhibition rates in analgesic activities testsn=6）

注：與模型組比較,ΔΔP＜0.01

組別 劑量/(mg·kg-1) 扭體次數(shù)/次 抑制率/%模型組 — 37.33±3.39 —阿司匹林組 200 20.50±2.52ΔΔ 45.08粗提物組 1 000 27.00±4.34 27.67乙酸乙酯部位組 1 000 25.80±2.39 30.89化合物1 組 50 17.60±4.77ΔΔ 52.86化合物2 組 50 24.75±8.34 33.70化合物3 組 50 31.60±4.10 15.35化合物4 組 50 16.40±4.51ΔΔ 56.07化合物7 組 50 19.83±5.56ΔΔ 46.88

5 討論

本研究采用小鼠醋酸扭體模型,初步考察了厚皮香粗提物、乙酸乙酯部位及化合物1 ～4、7 的鎮(zhèn)痛活性,結果發(fā)現(xiàn)所有供試品均具有一定作用,部分甚至優(yōu)于陽性藥阿司匹林,表明厚皮香鎮(zhèn)痛作用有相應的物質基礎。另一方面,本研究中分離得到的多種酚性成分在其他相關研究中也已被證實具有顯著的鎮(zhèn)痛消炎作用,如東莨菪內(nèi)酯(1) 是雪蓮、紫花前胡、月桂等藥用植物抗炎和鎮(zhèn)痛的主要活性物質［16］；原兒茶醛(3) 是活血定痛合劑、活血止痛湯中主要活性成分［17-18］；3,4-二羥基苯乙醇(5) 為炎立消片和炎立消膠囊中的主要活性成分［19］；對羥基苯甲醛(7) 為天麻重要的鎮(zhèn)痛鎮(zhèn)靜成分［20］。文獻報道,0.6%苯酚和0.45%布比卡因混合液用于膽囊切除術后鎮(zhèn)痛時,可有效減少嗎啡的用量, 顯著增加鎮(zhèn)痛效果［21］； Candido等［22］通過研究也發(fā)現(xiàn)苯酚用于治療頑固性疼痛有很好的效果,并且可以緩解阿片類受體藥物引起的副作用。此外,從鎮(zhèn)痛抗炎成分乙酰水楊酸［23］結構上看,本研究分離得到的許多成分與其具有一定的相似性,因此具有與阿司匹林相似或更好的鎮(zhèn)痛抗炎活性亦十分合理,由此更進一步明晰了厚皮香鎮(zhèn)痛活性與酚性成分之間可能存在的內(nèi)在聯(lián)系。

近年來有關小分子酚性成分生物活性方面的研究不斷涌現(xiàn),揭示了酚酸類化合物具有除鎮(zhèn)痛抗炎以外更多的生物活性,包括抗氧化、抑菌、抗腫瘤、抗病毒作用等［24-25］,如3,4-二羥基苯乙酸甲酯(6) 可抑制EV71 病毒在RD 細胞中的復制,具有抗病毒潛力［26］,因此,關于小分子酚性成分分離鑒定與活性研究十分重要。本研究豐富了厚皮香屬植物中化學成分的多樣性,為后續(xù)研究該屬植物化學成分、活性物質、潛在藥用價值等奠定了基礎,也為開發(fā)利用相關資源提供了參考。