基于網絡藥理學的宮外孕Ⅱ號方治療異位妊娠作用機制

陳 思, 李 凈, 劉曉榮, 鄧高丕

(1.廣州中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院,廣東 廣州510405；2.廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院,廣東 廣州510405)

異位妊娠是指受精卵著床于子宮體腔以外的部位,其主要臨床表現(xiàn)為停經、陰道流血、腹痛,甚至暈厥與休克［1］,發(fā)病率占妊娠女性的2%,其所致的輸卵管破裂出血可致孕婦死亡,是一種十分兇險的婦科急腹癥,占妊娠死亡的2.7%［2］。臨床上對異位妊娠的治療可分為藥物及手術,甲氨蝶呤為最經典的藥物,但有一定的副作用,如胃腸道反應、腹痛加重、肝酶升高、脫發(fā)等；手術包括輸卵管開窗術及輸卵管切除術,前者雖然創(chuàng)傷較小,但術后有8%～9%的患者發(fā)生持續(xù)異位妊娠,而后者有一定幾率影響后續(xù)宮內妊娠率［3］,對于有生育要求的育齡期婦女產生不良的影響。

中醫(yī)認為,異位妊娠發(fā)病機理為少腹血瘀［4］,臨床上可采用化瘀消癥殺胚類中藥治療,一方面最大程度保全育齡期婦女的生育功能,另一方面治療早期輸卵管妊娠的成功率可達88.9%［5］。宮外孕Ⅱ號方由丹參、赤芍、桃仁、三棱、莪術5 味藥材組成,方中丹參、桃仁、赤芍活血化瘀,從而達到消積作用；三棱、莪術行氣止痛,消癥散結,諸藥合用,共奏活血化瘀、消癥殺胚功效,可改善局部血液微循環(huán),抑制血小板聚集,促進包塊消散吸收,減輕病灶周圍的粘連［4］,是中醫(yī)治療異位妊娠的經典方劑,為活血化瘀、消癥殺胚的代表方,臨床療效明顯,對甲氨蝶呤聯(lián)合米非司酮具有增效減毒作用,患者HCG 水平恢復正常時間及盆腔包塊消失時間明顯小于單用西藥,還能提高患者心理健康、活動評分等生活質量［6-8］；現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn),該方可通過抑制滋養(yǎng)細胞的增殖［9］或拮抗雌孕激素來使絨毛組織因缺乏雌孕激素而變性、壞死,達到治療異位妊娠的作用［10-11］,同時能消炎抗菌,減少炎癥反應,消除輸卵管粘連,為有效恢復輸卵管功能及縮小包塊體積提供良好的基礎條件,另一方面促進微循環(huán),從而達到消除瘀血、減少不良反應的效果［12］。

中醫(yī)藥特色體現(xiàn)在中藥復方對疾病的整體治療調節(jié),通過多種中藥配伍組方來達到治療疾病的作用。網絡藥理學作為藥物研究的新模式,包括系統(tǒng)生物學、多向藥理學、生物信息等多種學科,其整體性、系統(tǒng)性的特點與中醫(yī)藥整體觀念、辨證論治、組方配伍的原則不謀而合［13］,可從多靶點的研究策略出發(fā),將藥物-靶點網絡與生物系統(tǒng)網絡相結合,為研究藥物機制與靶點提供新策略與方向,并可從大量生物信息資源和中藥數(shù)據(jù)信息中提取相關數(shù)據(jù),建立疾病-基因或蛋白質靶標-中藥活性成分的相互作用網絡,并進行數(shù)據(jù)挖掘,對中藥治療疾病的機制進行分析預測［14］。因此,本研究將通過網絡藥理學對宮外孕Ⅱ號方的有效成分進行研究,建立“化合物-靶點-通路” 網絡,探究其治療異位妊娠的作用機制,為后續(xù)研究提供參考和依據(jù)。

1 方法

1.1 化學成分檢索 通過中藥系統(tǒng)藥理學技術平臺(TCMSP) (http： //ibts.hkbu.edu.hk/LSP)檢索宮外孕Ⅱ號方中丹參、赤芍、桃仁、三棱、莪術化學成分,共搜集了996 種,其中丹參404 種、赤芍238 種、 桃仁132 種、 三棱60 種、 莪術162 種。

1.2 活性化合物篩選 口服生物利用度是藥物吸收、分布、代謝、排泄(ADME) 特性中最重要的藥物代謝動力學參數(shù)之一,表示口服的藥物達到血液循環(huán)所占口服劑量的比例,其比例高者一般是決定生物活性分子(即有效作用分子) 類藥性的關鍵指標；類藥性是指化合物分子與已知藥物分子的相似性,是藥物理化性質(相對分子質量、脂水分配系數(shù)、溶解度等)、結構特征(如環(huán)結構、氫鍵受體、可旋轉鍵數(shù)目和給體數(shù)等)、藥物分子在體內的綜合反映(如血腦屏障滲透性、口服生物利用度等合理的藥代動學性質和毒性)。本研究中丹參、赤芍、桃仁、三棱、莪術中的化合物口服生物利用度篩選閾值均≥30%,化合物類藥性篩選閾值均≥0.18,得到符合條件的候選化合物。

1.3 靶點和疾病預測 基于TCMSP 數(shù)據(jù)庫,將宮外孕Ⅱ號方的有效化合物逐一配對潛在靶點。同時, 通過蛋白質數(shù)據(jù)庫 (Uniprot Database,http： //www.uniprot.org/) 獲得與候選化合物相關的靶點蛋白信息,并在TCMSP 數(shù)據(jù)庫中篩選靶點-靶點對應的疾病。

1.4 化合物-靶點網絡構建 將宮外孕Ⅱ號方中化合物及其相關靶點蛋白通過Cytosacape 3.5.1 軟件(http： //www.cytoscape.org/) 構建化合物-靶點網絡,使兩者關系可視化,并對其進行網絡拓撲學分析。其中,靶點度值(Degree) 是拓撲結構中的中藥參數(shù),可用于評價方中的有效化合物、靶點的重要程度。

1.5 PPI 網絡構建 為了闡明靶點蛋白的相互作用,本研究利用string 數(shù)據(jù)庫將靶點蛋白所對應的基因構建PPI 網絡,并根據(jù)結果統(tǒng)計靶蛋白關聯(lián)頻次,導出可視化同行進行研究分析。 再通過cytocape 軟件中的bytohubba 插件,獲取度值為前10 的hub 蛋白。

1.6 GO 功能、KEGG 通路富集分析 GO 功能富集分析是指對差異基因的生物途徑進行注釋及分類并進行富集統(tǒng)計學分析；KEGG 通路富集分析是東京大學和京都大學共同研制的數(shù)據(jù)庫,可查詢通路,并與David 數(shù)據(jù)庫相關聯(lián)。本研究通過David v6.7數(shù)據(jù)庫(http： //david.ncifcrf.gov/) 對PPI網絡中的蛋白進行GO 功能、KEGG 通路富集分析,以“P ＜0.05,FDR ＜0.05,基因數(shù)大于10”作為條件進行篩選,得出宮外孕Ⅱ號方中化合物的靶點蛋白在基因功能和信號通路中的作用,并利用Cytoscape 3.5.1 軟件對GO-BP 富集分析中的GO條目和KEGG 通路富集分析中的通路繪制條形圖。

2 結果

2.1 活性化合物 宮外孕Ⅱ號方中有996 個化合物,OB≥30%、DL≥0.18 者有125 個(丹參65個、赤芍29 個、桃仁23 個、三棱5 個、莪術3個),其中丹參與赤芍有共同化合物1 個,赤芍、桃仁與三棱有共同化合物1 個,赤芍與三棱有共同化合物1 個,桃仁、三棱與莪術中有共同化合物1個。見表1。

表1 宮外孕Ⅱ號方中活性化合物Tab.1 Active compounds in No.2 Gongwaiyun Decoction

續(xù)表1

2.2 靶點和化合物-靶點網絡 宮外孕Ⅱ號方中候選化合物125 個,有119 個可在TCMSP 數(shù)據(jù)庫中匹配,化合物-靶點網絡見圖1。由圖可知,網絡中共有230 個節(jié)點,其中化合物節(jié)點100 個,靶點節(jié)點130 個、1 181 條邊,每條邊表示化合物與靶點直接的關系；度值表示鏈接該節(jié)點的條數(shù),度值越大,表示該節(jié)點與其他節(jié)點的相互作用越廣泛,在網絡中起到樞紐的重要作用,度值前6 的化合物為β-谷甾醇 (M358)、1,2,5,6-四氫丹參酮(M1601)、4-亞 甲 丹 參 新 酮(M7049)、 豆 甾 醇(M449)、2-異丙基-8-甲基菲-3,4-二酮(M7041)、鼠尾草酚酮 (M7145),對應的作用靶點分別為46、42、42、40、40、40 個。

β-谷甾醇促進腫瘤細胞凋亡和抑制腫瘤增生的藥理活性明顯［15-16］,對腫瘤防治有重要作用,可抗胰腺癌、宮頸癌、肝癌、結腸癌,其機制為可增加細胞內鈣離子水平使腫瘤細胞凋亡,或通過上調或下調與癌癥發(fā)生相關靶基因TP53、 JNK1 表達［17-18］；1,2,5,6-四氫丹參酮、4-亞甲丹參新酮、2-異丙基-8-甲基菲-3,4-二酮、鼠尾草酚酮均屬于丹參酮類化合物,具有抗菌、消炎、抗腫瘤作用,還可改善外周血液循環(huán)、加快微循環(huán)血液流通［19］,此外丹參酮還具有雌激素樣活性,可通過影響ERα、ERβ 表達來發(fā)揮作用,其機制與降低Bcl-2/bax 比例或誘導p53 表達相關［20-21］； 豆甾醇［22-23］具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎癥等藥理活性,在宮外孕Ⅱ號方治療異位妊娠的機制中可通過這些機制起到了治療的作用,也與PPI 網絡中的靶點分析及KEGG 富集分析中的信號通路集合相關聯(lián)。

圖1 宮外孕Ⅱ號方化合物-靶點網絡Fig.1 Compound-target network for No.2 Gongwaiyun Decoction

另外,度值前5 的靶點蛋白分別為M4 型乙酰膽堿受體(CHRM4)、多巴胺受體D1 (DRD1)、骨骼肌內胰島素受體 (INSR)、磷酸二酯酶3A(PDE3A)、α1B-腎上腺素受體(ADRA1B),度值分別為80、77、68、67、63。

2.3 PPI 網絡及Hub 蛋白提取 將130 個靶點蛋白對應的基因輸入String 數(shù)據(jù)庫,獲取PPI 網絡,網絡中含有118 個節(jié)點、864 條相互作用關系,見圖2,根據(jù)節(jié)點的高低繪制出前10 對應基因的網絡,見圖3。

圖2 宮外孕Ⅱ號方相關靶點的PPI 網絡Fig.2 PPI network for the relevant targets of No.2 Gongwaiyun Decoction

圖3 宮外孕Ⅱ號方PPI 網絡中靶點基因Fig.3 Target genes in PPI network for No.2 Gongwaiyun Decoction

然后,通過cytohubba 插件中的Degree 算法篩選出前11 的蛋白,作為Hub 蛋白,根據(jù)其得分由大至小依次分為腫瘤抑制因子p53(TP53)、轉錄因子激活蛋白1 (JUN)、 血管內皮生長因子A(VEGFA)、白介素-6(IL6)、絲裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)、表皮生長因子受體(EGFR)、腫瘤壞死因子(TNF)、雌激素受體1(ESR1)、凝血酵素(F2)、B 淋巴細胞瘤-2(Bcl-2),分別聯(lián)系51、50、47、45、43、42、42、40、40、38 個蛋白。其中,TP53 可通過轉錄調控p21、Bax 等許多靶基因的表達來抑制細胞增殖,誘導細胞凋亡,參與DNA 修復維持基因穩(wěn)定,抑制腫瘤血管生成［24］；Bcl-2 可通過與該家族的促凋亡蛋白結合而抑制細胞凋亡,也可通過抑制細胞色素C 從而保護細胞不發(fā)生凋亡［25］；TNF 靶點可通過介導細胞凋亡的細胞表面分子來誘導細胞凋亡［26］；研究表明,化瘀消癥殺胚復方可從受體水平拮抗雌孕激素,通過促進輸卵管蛻膜溶解來加速絨毛組織壞死,從而治療異位妊娠［11］,而雌激素受體ESR 可與雌激素結合,主要作用為促進女性生殖器官的發(fā)育,并對心血管系統(tǒng)、神經系統(tǒng)、胰島功能、骨代謝、腫瘤等多種系統(tǒng)有重要影響,其功能失調可導致許多雌激素相關疾病［27-31］；MAPK1 為和轉錄調控因子,與細胞增殖、分化和凋亡有關,雌激素與ESR 結合后,可以來ESR 傳導通路調節(jié)MAPK1,進而調控相應細胞因子的表達［32］；雌激素作用于ER 后可增強VEGF 表達,同時MAPK1 也是其啟動子之一,被激活后也可增強VEGF 表達,從而促進血管發(fā)生、形成,增強微血管通透性,改善微循環(huán)［30］；有研究發(fā)現(xiàn)異位妊娠患者血清中IL-6 水平比宮內早孕婦女或正常非孕婦女高［31］,它為參與機體炎癥反應的一種重要的糖蛋白,可直接損傷血管內皮細胞,減少血管內皮前列腺環(huán)素的產生,導致血液呈高凝狀態(tài)并引起血管收縮,同時增加血管細胞黏附分子表達,產生血管收縮因子的平衡紊亂［32］。由此推測,宮外孕Ⅱ號方可通過調控細胞凋亡、拮抗雌孕激素、促進血管發(fā)生、改善微循環(huán)等方法達到治療異位妊娠的目的, 而且TP53、TNF、IL-6、MAPK1 等為今后該方藥理學研究和臨床應用提供的新的思路和依據(jù)。

2.4 GO 功能富集分析 在DAVID 平臺進行GO功能富集分析,對宮外孕Ⅱ號方PPI 網絡中102 個靶點蛋白在基因功能中的作用進行研究,得到314個條目,具有顯著意義(P＜0.05) 的有14 個,從中篩選出基因數(shù)大于10 個者,共得到8 個,見圖4,包括氧化應激,促增殖抑凋亡,對藥物、毒物的反應,轉錄翻譯,信號傳導。

2.5 KEGG 通路富集分析 在DAVID 平臺進行KEGG 通路富集分析功能,對宮外孕Ⅱ號方PPI 網絡中102 個蛋白在信號通路中的作用進行研究,得到95 條信號通路,按P＜0.05、FDR＜0.05、基因數(shù)大于10 的條件篩選出6 條,見圖5,包括神經活性配體-受體相互作用信號通路、癌癥信號通路、環(huán)腺苷酸的信號通路、血清素神經突觸的信號通路、鈣離子信號通路、環(huán)磷酸鳥苷-蛋白激酶信號通路,通路上基因靶點越多,宮外孕Ⅱ號方越可能通過這些通路來達到治療作用,具體見表2。

圖4 宮外孕Ⅱ號方GO 生物學功能分析Fig.4 GO biological function analysis for No.2 Gongwaiyun Decoction

圖5 宮外孕Ⅱ號方KEGG 富集分析Fig.5 KEGG enrichment analysis for No.2 Gongwaiyun Decoction

大多數(shù)基因富集在神經活性配體-受體相互作用通路、癌癥信號通路、鈣離子信號通路上,分別有30 個(圖6)、20 個(圖7)、14 個(圖8)。其中,癌癥信號通路包含許多靶點基因, 如IL6、TP53、MAPK1、JUN、BCL2、VEGFA 等,在PPI網絡構建中發(fā)現(xiàn)它們可使宮外孕Ⅱ號方起到治療異位妊娠的作用。

表2 宮外孕Ⅱ號方PPI 網絡中的通路（P＜0.01，gene amount=Top 5）Tab.2 Pathways in PPI network for No.2 Gongwaiyun Decoction（P＜0.01，gene amount=Top 5）

3 討論

異位妊娠屬于婦產科常見的急腹癥,其發(fā)病率呈逐漸增加趨勢,考慮到患者生育能力,保證再次妊娠不受到影響,提高保守治療療效成為婦產科醫(yī)生關注的重點之一。中醫(yī)認為,異位妊娠病機為少腹血瘀證,故大多采用活血化瘀、消癥殺胚法進行治療, 以宮外孕Ⅱ號方為代表方, 臨床療效良好［8,33-34］。

圖6 神經活性配體-受體相互作用通路Fig.6 Neuroactive ligand-receptor interaction pathways

圖7 癌癥信號通路Fig.7 Cancer signaling pathways

為了進一步探索該方作用機制,本研究采用網絡藥理學方法,根據(jù)化合物、蛋白、信號通路等多個數(shù)據(jù)庫構建網絡,并對靶點功能進行富集,系統(tǒng)綜合地展現(xiàn)藥物對疾病干預和影響的機制。結果,宮外孕Ⅱ號方核心化合物有β-谷甾醇、1,2,5,6-四氫丹參酮、4-亞甲丹參新酮、豆甾醇、2-異丙基-8-甲基菲-3,4-二酮、鼠尾草酚酮等；核心Hub蛋 白 為 TP53、 JUN、 VEGFA、 IL6、 MAPK1、EGFR、TNF、ESR1、F2、BCL2 等；GO 富集分析得出其治療機制可能為通過氧化應激,促增殖抑凋亡,對藥物、毒物的反應,轉錄翻譯及信號傳導等；KEGG 通路富集分析表明該方主要作用與Neuroactive ligand-receptor interaction、 pathways in cancer、cAMP signaling pathway、 Serotonergic synapse、 Calcium signaling pathway、 cgmp-PKG signaling pathway 有關。由此預測,宮外孕Ⅱ號方可能通過調節(jié)細胞凋亡、抗炎、拮抗雌孕激素,以及改善微血管循環(huán),促進血管生成,從而改善缺血缺氧狀態(tài),達到治療異位妊娠的目的。

圖8 鈣離子信號通路Fig.8 Calcium ion signaling pathways

綜上所述,本研究通過網絡藥理學對宮外孕Ⅱ號方化合物、靶點、作用通路進行系統(tǒng)分析,初步驗證了該方治療異位妊娠的藥理作用及相關機制,為今后進一步研究奠定理論基礎。