六味葛藍(lán)降脂片HPLC 指紋圖譜建立及5 種成分測(cè)定

周雅琪, 蔣 林, 魏博偉, 李曉梅, 李芳嬋, 隨家寧, 郭勇秀

(廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,廣西 南寧530001)

高脂血癥為臨床上的多發(fā)病及常見(jiàn)病,是引發(fā)脂肪肝、心腦血管疾病的重要病因之一［1］,中醫(yī)藥在防治該疾病上具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì),可多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)綜合降脂,而且毒副作用小,相關(guān)中藥或保健食品市場(chǎng)前景良好［2-8］。

六味葛藍(lán)降脂片是由廣西中醫(yī)藥大學(xué)制藥廠擬開(kāi)發(fā)的具有輔助降血脂功效的保健食品,由絞股藍(lán)、火麻仁、決明子、葛根、沙棘、荷葉6 味藥食兩用藥材配伍而成,通過(guò)扶正祛邪、補(bǔ)中益氣來(lái)調(diào)節(jié)機(jī)體代謝機(jī)能,從而達(dá)到降血脂作用［9-10］。方中葛根和決明子發(fā)揮主要作用,前者所含異黃酮是重要藥效物質(zhì)［11］,葛根素、大豆苷、大豆苷元等［12］具有擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈血管、增加冠狀動(dòng)脈血流量作用,同時(shí)可降血脂［13-14］；后者具有降血脂、降血壓等療效,可抑制血清膽固醇,以降血脂效果更顯著［15-16］,其主要有效成分為蒽醌［17］,代表性成分有橙黃決明素、大黃酚,為瀉下、降血脂作用的主要成分［18-19］。

本實(shí)驗(yàn)建立六味葛藍(lán)降脂片HPLC 指紋圖譜,并測(cè)定其中葛根素、大豆苷、大豆苷元、橙黃決明素、大黃酚的含有量,為完善該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

1 材料

Agilent 1260 高效液相色譜儀,配置UV 型紫外檢測(cè)器；TGL-16G 離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；KQ5200B 超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；SQP 電子天平［百萬(wàn)分之一,賽多利斯科學(xué)儀器(北京) 有限公司］；超純水(密思博超純水機(jī)制備)。 六味葛藍(lán)降脂片共10 批(批號(hào)20170501、20170601、20170602、20170603、20170701、20170801、 20170802、 20170803、 20170901、20171001),2 g/片,由廣西中醫(yī)藥大學(xué)制藥廠提供,原藥材均購(gòu)自廣西玉林市祥生中藥飲片有限責(zé)任公司,經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)制藥廠質(zhì)量保證部專(zhuān)家鑒定為正品。葛根素對(duì)照品(170109,含有量＞98%,上海融禾醫(yī)藥科技有限公司)； 大豆苷(MUST-17092780, 含 有 量99.46%)、 大 豆 苷 元(MUST-17101202,含有量99.99%)、橙黃決明素(111900-201303, 含 有 量 99.1%)、 大 黃 酚(MUST-17041310,含有量99.50%) 對(duì)照品 (成都曼思特生物科技有限公司)。乙腈為色譜純(美國(guó)Fisher 公司)；甲醇、磷酸為分析純(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Phenomenex Gemini C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流動(dòng)相乙腈(A) -0.1%磷酸(B),梯度洗脫(0 ～8 min,15%A；8 ～20 min,30%A；20 ～40 min,55%A；40 ～45 min,60%A；45～55 min,70%A；55 ～60 min,85%A)；體積流量1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱(chēng)取葛根素、大豆苷、大豆苷元、橙黃決明素、大黃酚對(duì)照品適量,甲醇分別制成1.210 0、0.750 0、0.635 0、0.570 0、0.315 0 mg/mL,取適量置于同一量瓶中,甲醇稀釋,即得 (質(zhì)量濃度分別為0.164 1、0.067 3、0.034 4、0.054 9、0.028 9 mg/mL),置于冰箱中貯存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 供試品溶液 取本品20 片,研細(xì),精密稱(chēng)取約2 g,置于具塞錐形瓶中,精密加入20 mL 甲醇,稱(chēng)定質(zhì)量,超聲(200 W、40 kHz) 30 min,冷卻至室溫,甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量,搖勻,濾過(guò),續(xù)濾液離心,取上清液,即得。

2.3 HPLC 指紋圖譜建立

2.3.1 精密度試驗(yàn) 取供試品溶液 (批號(hào)20170501),在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6次,以7 號(hào)峰的保留時(shí)間和色譜峰面積為參照,測(cè)得其余11 個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD 在0.05%～0.24%之間,相對(duì)峰面積RSD 在0.89%～2.0%之間,表明儀器精密度良好,符合相關(guān)要求和規(guī)定。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液 (批號(hào)20170501),于0、2、4、8、12、24 h 在 “2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定,以7 號(hào)峰保留時(shí)間和色譜峰面積為參照,測(cè)得其余11 個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD 在0.09%～1.1%之間,相對(duì)峰面積RSD在0.64%～2.0%之間,表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好,符合相關(guān)要求和規(guī)定。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取本品(批號(hào)20170501) 約2 g,按“2.2.2” 項(xiàng)下方法制備6 份供試品溶液,在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定,以7 號(hào)峰保留時(shí)間和色譜峰面積為參照,測(cè)得其余11 個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD 在0.10%～0.34%之間,相對(duì)峰面積RSD 在1.2%～1.9%之間,表明該方法重復(fù)性良好,符合相關(guān)要求和規(guī)定。

2.3.4 建立方法 取10 批樣品,按“2.2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液,在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定,見(jiàn)圖1,再通過(guò)“中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件” (2012.130723 版) 進(jìn)行分析,平均數(shù)法生成對(duì)照?qǐng)D譜,多點(diǎn)校正法建立指紋圖譜,見(jiàn)圖2。共標(biāo)示出12 個(gè)共有峰,由于7 號(hào)峰(大豆苷元) 保留時(shí)間適中,穩(wěn)定性好,峰面積較大,故選擇其作為參照峰(S)；10 批樣品相似度均大于0.997,表明其質(zhì)量相對(duì)穩(wěn)定,共有成分基本一致,但含有量上有差異。

圖1 10 批樣品HPLC 指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprints of ten batches of samples

圖2 共有峰HPLC 色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of common peaks

2.3.5 主要特征峰歸屬 精密吸取“2.2.1” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液,在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定,記錄色譜圖。結(jié)果,共指認(rèn)出5 個(gè)特征峰(2、4、7、8、12 號(hào)),分別為葛根素、大豆苷、大豆苷元、橙黃決明素、大黃酚。

2.4 5 種成分含有量測(cè)定

2.4.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 取對(duì)照品、供試品、陰性對(duì)照溶液,在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定,結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖可知,對(duì)照品、供試品在相同保留時(shí)間處都有特征色譜峰, 而陰性對(duì)照未發(fā)現(xiàn),拖尾因子均在0.95 ～1.05 之間,表明其他成分對(duì)測(cè)定無(wú)干擾, 理論塔板數(shù)以大豆苷元計(jì)為6 800。

圖3 各成分HPLC 色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of various constituents

2.4.2 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液,甲醇稀釋,制得含葛根素0.065 7、0.131 3、0.016 41、0.197 0、0.229 8、0.262 6 mg/mL,大豆苷0.026 9、0.053 8、0.067 3、0.080 7、0.094 2、0.107 6 mg/mL, 大 豆 苷 元0.013 8、 0.027 5、0.034 4、 0.041 3、 0.048 2、 0.010 76 mg/mL,橙黃決明素0.022 0、0.043 9、0.054 9、0.065 9、0.076 9、0.087 9 mg/mL,大黃酚0.011 6、0.023 2、0.028 9、0.034 7、0.040 5、0.046 3 mg/mL 的對(duì)照品溶液,在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo) (X),峰面積為縱坐標(biāo)(Y) 進(jìn)行回歸,結(jié)果見(jiàn)表1,可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各成分線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.4.3 精密度試驗(yàn) 取“2.2.1” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液,在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次,測(cè)得葛根素、大豆苷、大豆苷元、橙黃決明素、大黃酚峰面積RSD 分別為1.7%、1.6%、1.6%、1.7%、1.6%,表明儀器精密度良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取本品(批號(hào)20170501) 適量,按“2.2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液,于0、2、4、8、12、24 h 在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定,測(cè)得葛根素、大豆苷、大豆苷元、橙黃決明素、 大黃酚峰面積RSD 分別為1.3%、 1.1%、1.9%、1.9%、2.0%,表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.5 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱(chēng)取本品 (批號(hào)20170501)6 份,每份2.0 g,按“2.2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液,在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定,測(cè)得葛根素、大豆苷、大豆苷元、橙黃決明素、大黃酚含有量RSD 分別為0.61%、1.4%、1.6%、1.6%、1.0%,表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱(chēng)取本品(批號(hào)20170501) 約1.0 g(葛根素、大豆苷、大豆苷元、橙黃決明素、大黃酚平均含有量分別為1.788 5、0.616 9、0.379 6、0.603 3、0.158 4 mg/g),共6份,分別精密加入葛根素、大豆苷、大豆苷元、橙黃決明素、 大黃酚對(duì)照品1.800 0、0.620 0、0.380 0、0.600 0、0.160 0 mg,按“2.2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液,在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定,計(jì)算回收率。結(jié)果,葛根素、大豆苷、大豆苷元、橙黃決明素、大黃酚平均加樣回收率分別為 98.1%、 102.6%、 98.0%、 96.0%、 97.7%,RSD 分別為0.72%、1.1%、1.7%、0.54%、0.72%。

2.4.7 樣品含有量測(cè)定 精密稱(chēng)取10 批片劑,每批約2 g,按“2.2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液,在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定,計(jì)算含有量,結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各成分含有量測(cè)定結(jié)果（mg/g，n=2）Tab.2 Results of content determination of various consti-tuents（mg/g，n=2）

3 討論

本實(shí)驗(yàn)考察供試品溶液制備方法時(shí),以甲醇、水、乙醇為提取溶劑,比較了超聲、回流提取,以及提取時(shí)間、溶劑用量、提取次數(shù)對(duì)含有量測(cè)定的影響,發(fā)現(xiàn)在取樣量2 g、甲醇20 mL、超聲30 min條件下供試品溶液中5 種成分總含有量較高,分離度較好,而且操作簡(jiǎn)便。然后,采用二極管陣列檢測(cè)器分析不同波長(zhǎng)下色譜圖,發(fā)現(xiàn)在280 nm處各成分較穩(wěn)定,含有量較高,并與其他雜質(zhì)峰達(dá)到良好的分離效果。

指紋圖譜是一種具有整體性、模糊性、專(zhuān)屬性等特點(diǎn)的質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)方法［20］,能全面呈現(xiàn)樣品復(fù)雜性,近年來(lái)廣泛應(yīng)用于中藥研究中［21］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),10 批六味葛藍(lán)降脂片HPLC 指紋圖譜相似度均大于0.9,具有很好的一致性。另外,中藥材有著多成分、多功效的特點(diǎn),只對(duì)其單一成分或特征性成分進(jìn)行研究無(wú)法全面控制其質(zhì)量［22-24］,故本實(shí)驗(yàn)采用HPLC 法同時(shí)測(cè)定六味葛藍(lán)降脂片中葛根素、大豆苷、大豆苷元、橙黃決明素、大黃酚含有量,發(fā)現(xiàn)其均存在一定差異,可能是由于藥材種植、地域等因素所致。因此,控制藥材源頭、規(guī)范生產(chǎn)工藝是保證保健食品質(zhì)量穩(wěn)定的重要措施。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立六味葛藍(lán)降脂片HPLC 指紋圖譜,并測(cè)定其中葛根素、大豆苷、大豆苷元、橙黃決明素、大黃酚的含有量,該方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確,重復(fù)性好,專(zhuān)屬性強(qiáng),既考察了該制劑中多種有效成分的含有量,又通過(guò)指紋圖譜整體相似度為其全面質(zhì)量評(píng)價(jià)提供可靠依據(jù)。