一測多評(píng)法同時(shí)測定蘇黃止咳膠囊中7 種成分

王加良, 張艷麗, 范景輝, 李海燕

(牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院,黑龍江 牡丹江157011)

蘇黃止咳膠囊是由牛蒡子、紫蘇葉、紫蘇子、前胡、五味子、麻黃、地龍、蜜枇杷葉、蟬蛻等中藥材加工而成的中成藥復(fù)方制劑,收載于國家食品藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)(YBZ00172008) 中［1］,方中紫蘇葉、麻黃止咳平喘,疏風(fēng)宣肺,為君藥；五味子、蟬蛻止咳化痰,收斂肺氣,為臣藥；紫蘇子、枇杷葉、地龍、前胡止咳化痰,利咽,牛蒡子利咽止癢,為佐藥。但蘇黃止咳膠囊現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅對(duì)其所含的鹽酸麻黃堿進(jìn)行定量檢測,而姚琴等［2］采用HPLC 法測定其中紫蘇醛含有量,尚無多成分同時(shí)測定的報(bào)道。

中成藥復(fù)方制劑組成復(fù)雜,單一成分定量測定難以全面控制其質(zhì)量和療效一致性,多指標(biāo)成分測定已成為相關(guān)質(zhì)量評(píng)價(jià)的發(fā)展趨勢。蘇黃止咳膠囊中君藥紫蘇葉和紫蘇子主要含有黃酮、迷迭香酸、咖啡酸、阿魏酸等成分,以迷迭香酸為主；臣藥五味子主要含有木脂素、萜類、多糖、有機(jī)酸等成分,以五味子醇甲、五味子醇乙等木脂素為主；佐藥牛蒡子主要含有牛蒡苷、牛蒡苷元等木脂素,前胡主要含有白花前胡甲素、白花前胡乙素、白花前胡E 素等香豆素。為全面有效地控制該制劑質(zhì)量,本實(shí)驗(yàn)采用一測多評(píng)法,以迷迭香酸為內(nèi)標(biāo),建立該成分與牛蒡子苷、牛蒡子苷元、白花前胡甲素、白花前胡乙素、白花前胡E 素、五味子醇甲的相對(duì)校正因子,并計(jì)算各成分含有量,以期為其質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器 Waters 2695 型高效液相色譜儀(美國Waters 公司)；AL204 型電子天平［梅特勒-托利多儀器(上海) 有限公司］；SK5200H 型超聲波清洗器(上海科導(dǎo)儀器有限公司)。

1.2 試藥 白花前胡甲素(111711-201703,含有量98.8%)、迷迭香酸 (111871-201706, 含有量90.5%)、白花前胡乙素(111904-201203,含有量98.0%)、五味子醇甲 (110857-201714, 含有量99.9%) 對(duì)照品均購自中國食品藥品檢定研究院；牛蒡子苷(20362-31-6)、牛蒡子苷元 (7770-78-7)、白花前胡E 素(78478-28-1) 對(duì)照品均購自上海純優(yōu)生物科技有限公司。蘇黃止咳膠囊(每粒裝0.45 g,批號(hào)17120812、18040311、18042111)購自揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)北京海燕藥業(yè)有限公司。甲醇為色譜純；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Hypersil ODS C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流動(dòng)相甲醇-0.1%冰醋酸,梯度洗脫［3-6］(0 ～9.0 min,45.0%A；9.0 ～19.0 min,45.0%→52.0%A； 19.0 ～26.0 min, 52.0%→59.0%A； 26.0 ～38.0 min, 59.0%→72.0%A；38.0 ～44.0 min, 72.0% →78.0% A； 44.0 ～50.0 min,78.0%→45.0%A)；0 ～19.0 min 時(shí)在280 nm［6-9］波長下檢測牛蒡子苷和牛蒡子苷元,19.0～38.0 min 時(shí)在321 nm［7,10-12］波長下檢測迷迭香酸、白花前胡甲素、白花前胡乙素、白花前胡E素,38.0～50.0 min 時(shí)在250 nm［7,13］波長下檢測五味子醇甲；體積流量1.0 mL/min；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱取牛蒡子苷、牛蒡子苷元、迷迭香酸、白花前胡甲素、白花前胡乙素、白花前胡E 素、五味子醇甲對(duì)照品適量,甲醇分別制成 1.918、 0.882、 0.526、 0.994、 0.266、 0.372、0.418 mg/mL,各精密吸取2.5 mL于同一50 mL 量瓶中,甲醇定容,即得(質(zhì)量濃度分別為95.9、44.1、26.3、49.7、13.3、18.6、20.9 μg/mL)。

2.2.2 供試品溶液 取膠囊適量,傾出內(nèi)容物研細(xì),精密稱取0.2 g,置于50 mL 量瓶中,加45 mL甲醇超聲提取0.5 h,放冷,甲醇稀釋至刻度,振搖均勻,濾過,即得。

2.2.3 陰性樣品溶液 按膠囊處方和生產(chǎn)工藝要求,分別制備不含牛蒡子、紫蘇葉和紫蘇子、前胡、五味子的陰性樣品,按“2.2.2” 項(xiàng)下方法制備,即得。

2.2.4 線標(biāo)溶液 精密吸取“2.2.1” 項(xiàng)下貯備液各2.5 mL,置于同一20 mL 量瓶中,甲醇制成線標(biāo)溶液Ⅰ,精密吸取適量,甲醇分別稀釋2、5、10、20、25 倍,分別制成線標(biāo)溶液Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ,即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 系統(tǒng)適用性與專屬性試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品、供試品、陰性樣品溶液適量,在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定,結(jié)果見圖1。由圖可知,各成分均能實(shí)現(xiàn)基線分離,陰性無干擾,理論塔板數(shù)按所測成分計(jì)均大于3 500,分離度均大于1.5。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.3.2 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2.4” 項(xiàng)下線標(biāo)溶液Ⅰ～Ⅵ適量,在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X),峰面積為縱坐標(biāo)(Y) 進(jìn)行回歸,結(jié)果見表1,可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各成分線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.3.3 精密度試驗(yàn) 取“2.2.1” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液,在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定6 次,測得牛蒡子苷、牛蒡子苷元、迷迭香酸、白花前胡甲素、白花前胡乙素、白花前胡E 素、五味子醇甲峰面 積 RSD 分 別 為 0.57%、 0.68%、 0.71%、0.63%、1.01%、0.96%、0.87%,表明儀器精密度良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批膠囊 (批號(hào)17120812),按“2.2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液6 份,在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定,測得牛蒡子苷、牛蒡子苷元、迷迭香酸、白花前胡甲素、白花前胡乙素、白花前胡E 素、五味子醇甲含有 量 RSD 分 別 為 0.96%、 1.08%、 0.79%、1.05%、1.59%、1.47%、1.43%,表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液(批號(hào)17120812),于0、2、4、8、16、24 h 在 “2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定,測得牛蒡子苷、牛蒡子苷元、迷迭香酸、白花前胡甲素、白花前胡乙素、白花前胡E 素、 五味子醇甲峰面積RSD 分別為0.55%、0.62%、0.73%、0.59%、1.04%、0.92%、0.81%,表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗(yàn) 取含有量已知的同一批膠囊(批號(hào)17120812) 適量,傾出內(nèi)容物,研細(xì),精密稱取6 份,每份0.1 g,置于50 mL 量瓶中,分別精密加入牛蒡子苷、牛蒡子苷元、迷迭香酸、白花前胡甲素、白花前胡乙素、白花前胡E 素、五味子醇甲對(duì)照品溶液(質(zhì)量濃度分別為1.327、0.569、0.718、0.751、0.342、0.479、0.611 mg/mL)2.0、 2.0、 1.0、 2.0、 1.0、 1.0、 1.0 mL, 按“2.2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液,在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定,計(jì)算含有量。結(jié)果,牛蒡子苷、牛蒡子苷元、迷迭香酸、白花前胡甲素、白花前胡乙素、白花前胡E 素、五味子醇甲平均加樣回 收 率 (RSD) 分 別 為 100.1% (0.76%)、99.28% (0.94%)、 97.90% (1.33%)、 99.74%(0.61%)、96.91% (1.40%)、98.56%(1.25%)、98.69% (1.16%)。

2.4 相對(duì)校正因子計(jì)算 精密吸取“2.2.4” 項(xiàng)下線標(biāo)溶液Ⅰ～Ⅵ適量,在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定,以迷迭香酸為內(nèi)標(biāo),計(jì)算其他6 種成分相對(duì)校正因子f內(nèi)標(biāo)/其他成分, 公式為f內(nèi)標(biāo)/其他成分＝f內(nèi)標(biāo)/f其他成分＝ (W內(nèi)標(biāo)×A其他成分) / (W其他成分×A內(nèi)標(biāo)) (W為質(zhì)量濃度,A 為峰面積),結(jié)果見表2。

表2 各成分相對(duì)校正因子Tab.2 Relative correction factors of various constituents

2.5 耐用性試驗(yàn) 考察Waters 2695、Agilent 1260色譜 儀 和Kromasil C18、 Shim-pack C18、 Hypersil ODS C18色譜柱對(duì)相對(duì)校正因子的影響,結(jié)果見表3,可知均無明顯影響。

2.6 色譜峰定位 考察“2.5” 項(xiàng)下儀器和色譜柱對(duì)相對(duì)保留時(shí)間的影響,結(jié)果見表4,可知均無明顯影響。

表3 不同儀器、色譜柱對(duì)相對(duì)校正因子的影響Tab.3 Effects of different instruments and columns on relative correction factors

表4 各成分相對(duì)保留值Tab.4 Relative retention values of various constituents

2.7 樣品含有量測定 取3 批膠囊,按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定,分別采用外標(biāo)法和一測多評(píng)法計(jì)算含有量,結(jié)果見表5,可知2 種方法所得結(jié)果為明顯差異。

表5 各成分含有量測定結(jié)果（mg/g）Tab.5 Results of content determination of various constituents（mg/g）

3 討論與結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)在探索蘇黃止咳膠囊供試品溶液制備方法 時(shí), 分 別 對(duì) 提 取 溶 劑 (甲 醇［6-8,13］、 50%甲醇［14］、75%乙醇)、 提取方式 (超聲提?。?-11,13］、回流提取［6］)、提取時(shí)間(20、30、40 min) 進(jìn)行考察,以各成分提取率為指標(biāo)。最終確定,供試品溶液制備方法為甲醇超聲提取30 min。

本實(shí)驗(yàn)建立一測多評(píng)法同時(shí)測定蘇黃止咳膠囊中迷迭香酸、五味子醇甲、牛蒡子苷、牛蒡子苷元、白花前胡甲素、白花前胡乙素、白花前胡E素的含有量,該方法簡便準(zhǔn)確,重復(fù)性好,可有效降低檢驗(yàn)成本,為該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立和控制提供有力的數(shù)據(jù)支持。