亞臨界流體萃取沉香揮發(fā)油工藝的優(yōu)化及精制精油測定

沈汝青, 朱 力, 馮志豪, 朱寶璋, 譚 亮, 丁 愷, 陸 麒, 丁志剛,丁 俊

(1.海南香島休閑農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司,海南 海口570208；2.廣州市浩立生物科技有限公司,廣東廣州510220；3.中國科學(xué)院西北高原生物研究所,青海省青藏高原特色生物資源研究重點實驗室,青海 西寧810001；4.青海省草原總站草原保護(hù)科,青海 西寧810000)

沉香為瑞香科植物沉香Aquilaria agallocha(Lour.)Roxb.含有樹脂的木材,全年均可采收［1］,通常在健康狀態(tài)下并無分泌物產(chǎn)生,只有在受到自然或人工傷害后才會分泌多種次級代謝產(chǎn)物,經(jīng)過復(fù)雜的結(jié)香過程后與木質(zhì)部組織共同組成沉香［2］,主產(chǎn)于我國廣東、廣西、海南、云南、臺灣等地,具有行氣止痛、溫中止嘔、納氣平喘的功效,臨床上主要用于治療胸腹脹悶疼痛、胃寒嘔吐呃逆、腎虛氣逆喘急［3］。沉香中揮發(fā)油含有量較高,具有濃郁的香氣,是其主要藥效成分［4］,臨床應(yīng)用廣泛,可保護(hù)消化系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)等［5］。

沉香是珍貴藥材,隨著中醫(yī)藥發(fā)展對其需求量也日益增加,其提取工藝必然成為研究重點。目前,相關(guān)研究大多為沉香葉和種子中化學(xué)成分［6-8］、沉香揮發(fā)性成分藥理活性［9］、沉香化學(xué)成分［10-13］；對于沉香精油的提取方法,已有水蒸氣蒸餾、果膠酶預(yù)處理輔助提取、纖維素酶輔助提取、動態(tài)-微波輔助、溶劑回流提取、超臨界CO2萃取法［14-19］,也有亞臨界流體萃?。?0］,但尚無應(yīng)用1,1,1,2-四氟乙烷(R134a) 萃取沉香揮發(fā)油的報道。

本研究在單因素試驗基礎(chǔ)上,通過正交試驗優(yōu)化亞臨界流體(R134a) 萃取沉香揮發(fā)油工藝,然后利用分子分離技術(shù)對其作進(jìn)一步精制,得到揮發(fā)性、液體精制精油,并以GC-MS 法測定其含有量,為該藥材質(zhì)量控制及相關(guān)資源開發(fā)利用提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 試藥 沉香收集于海南定安縣下坡村,共3批,經(jīng)中國科學(xué)院西北高原生物研究所高慶波副研究員鑒定為瑞香科植物沉香Aquilaria agallocha(Lour.)Roxb.含有樹脂的木材。R134a(含有量99%) 購自西寧城西老史制冷配件批發(fā)部。無水乙醇為分析純(天津市百世化工有限公司)；水為超純水。

1.2 儀器 中試亞臨界流體萃取裝置(型號3×10 L+1 L,廣州市浩立生物科技有限公司、華南理工大學(xué)聯(lián)合研制)；一級沉香純油專用分子分離設(shè)備(型號MDS-80a-I,廣州市浩立生物科技有限公司)；數(shù)顯恒溫(玻璃) 水浴電動攪拌機(jī)(型號76-SH,上海達(dá)平儀器有限公司)；電子天平(型號ME403)、精密電子天平(型號AG135) (瑞士Mettler-Toledo 公司)；電熱鼓風(fēng)干燥箱(型號101-1,北京科偉永興儀器有限公司)；超純水機(jī)(型號UPE-Ⅱ-40 L,上海優(yōu)普實業(yè)有限公司)。

2 方法

2.1 提取工藝優(yōu)化 沉香含樹脂部分陰干、粉碎后過40 目篩,置于50 ℃恒溫干燥箱內(nèi)干燥過夜,取出,裝入密封袋中密封,置于干燥器中保存。取300 g,80%乙醇浸潤后裝入布袋中封口,置于亞臨界流體萃取裝置的萃取罐中,蓋好壓環(huán)及上堵頭進(jìn)行提取。在單因素試驗基礎(chǔ)上,以料液比(A)、提取壓力(B)、提取溫度(C)、提取時間(D)、夾帶劑(乙醇) 體積分?jǐn)?shù)(E) 為影響因素,沉香揮發(fā)油提取率為評價指標(biāo),正交試驗優(yōu)化提取工藝,平行3 次。

2.2 醇化和精油精制 將沉香揮發(fā)油置于醇化罐中進(jìn)行升溫醇化處理,至45 ℃時保持溫度不變,繼續(xù)攪拌醇化1 d,置于一級沉香純油專用分子分離設(shè)備中進(jìn)行不同階段分子蒸餾。隨著蒸餾溫度逐漸增加,蒸餾壓力逐漸減小,并在一定條件下接出餾分,以沉香投入量為對照計算各餾分含有量。

3 結(jié)果

3.1 單因素試驗

3.1.1 料液比 稱取沉香粉300 g,固定提取壓力1.55 MPa,提取溫度60 ℃,提取時間6 h,夾帶劑80%乙醇(物料∶夾帶劑＝2 ∶3),考察料液比1 ∶5、1 ∶10、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50 對沉香揮發(fā)油提取率的影響,結(jié)果見圖1,可知提取率先提高后趨于平穩(wěn),但略有下降,在1 ∶30 時最高。溶劑量過少時,提取液達(dá)到飽和,導(dǎo)致提取不完全；溶劑量過多時,提取液提取需更長的時間,故選擇1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40 進(jìn)行考察。

圖1 料液比對提取率的影響Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate

3.1.2 提取壓力 稱取沉香粉300 g,固定料液比1 ∶30,提取溫度60 ℃,提取時間6 h,夾帶劑80%乙醇(物料∶夾帶劑＝2 ∶3),考察提取壓力0.80、 1.00、 1.20、 1.45、 1.50、 1.55、 1.60、1.65、1.80 MPa 對沉香揮發(fā)油提取率的影響,結(jié)果見圖2,可知提取率先提高后略有降低,在1.55 MPa 時最高。隨著提取壓力升高,R134a 密度、溶解能力增加,從而使得提取率上升；但繼續(xù)升高時,R134a 黏度變大,限制了沉香揮發(fā)油擴(kuò)散速率,導(dǎo)致其提取率反而下降,故選擇1.50、1.55、1.60 MPa 進(jìn)行考察。

3.1.3 提取溫度 稱取沉香粉300 g,固定料液比1 ∶30,提取壓力1.55 MPa,提取時間6 h,夾帶劑80%乙醇(物料∶夾帶劑＝2 ∶3),考察提取溫度40、45、50、55、60、65、70、75 ℃對沉香揮發(fā)油提取率的影響,結(jié)果見圖3,可知提取率先提高后降低,在60 ℃時最高。隨著提取溫度升高,溶質(zhì)蒸氣壓增加,有利于提高其揮發(fā)性、傳質(zhì)速率、溶解度,從而使得提取率上升；但繼續(xù)升高時,R134a 密度、溶解能力降低,導(dǎo)致提取能力反而下降,故選擇55、60、65 ℃進(jìn)行考察。

圖2 提取壓力對提取率的影響Fig.2 Effect of extraction pressure on extraction rate

圖3 提取溫度對提取率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on extraction rate

3.1.4 提取時間 稱取沉香粉300 g,固定料液比1 ∶30,提取壓力1.55 MPa,提取溫度60 ℃,夾帶劑80%乙醇(物料∶夾帶劑＝2 ∶3),考察了提取時間1、1.5、2、3、4、6、8、10、12 h 對沉香揮發(fā)油提取率的影響,結(jié)果見圖4,可知提取率逐漸增加,在6 h 時最高。隨著提取時間延長,沉香揮發(fā)油逐漸減少,傳質(zhì)阻力逐漸下降,提取率增長程度不明顯,故選擇3、4、6 h 進(jìn)行考察。

圖4 提取時間對提取率的影響Fig.4 Effect of extraction time on extraction rate

3.1.5 夾帶劑 夾帶劑可增加壓力和溫度對溶質(zhì)在亞臨界流體中溶解度變化的靈敏度,以達(dá)到更精密的分離要求,同時可降低亞臨界流體操作壓力或減少其用量。圖5 顯示,不同夾帶劑下沉香揮發(fā)油提取率依次為甲醇＞乙醚＞乙醇＞乙酸乙酯＞丙酮,但加入甲醇后提取率仍低于80%乙醇,故選擇75%、80%、85%乙醇進(jìn)行考察。

圖5 夾帶劑種類對提取率的影響Fig.5 Effect of entrainer kind on extraction rate

稱取沉香粉300 g,固定料液比1 ∶30,提取壓力1.55 MPa,提取溫度60 ℃,提取時間6 h,考察50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%乙醇(物料∶夾帶劑＝2 ∶3) 對沉香揮發(fā)油提取率的影響,結(jié)果見圖6,可知提取率逐漸增加,在80%時最高；但乙醇體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)升高時提取率恒定,甚至略有降低。

圖6 乙醇體積分?jǐn)?shù)對提取率的影響Fig.6 Effect of ethanol concentration on extraction rate

3.2 正交試驗 表1 顯示,各因素影響程度依次為A ＞B ＞E ＞D ＞C, 從k 值分析, 最優(yōu)工藝為A2B2C2D3E2,而正交試驗中為A2B2C3D3E1,通過SPSS 19.0 軟件分析可知因素C 對試驗結(jié)果影響最小,故以其為誤差,方差分析見表2。由表可知,因素A、B、D 對沉香揮發(fā)油提取率有顯著影響(P＜0.05),而因素E 無顯著影響(P＞0.05)。

表1 試驗設(shè)計及結(jié)果Tab.1 Design and results of tests

表2 方差分析Tab.2 Analysis of variance

3.3 驗證試驗 對工藝A2B2C2D3E2進(jìn)行驗證試驗,稱取沉香粉300 g,平行3 批,得到深黃色、略帶橙紅色的油狀液體,流動性差,帶有醇厚的香氣,并夾雜一絲腥味,置于2 ～8 ℃冰箱中冷藏時轉(zhuǎn)變?yōu)橄灎罟腆w, 提取率為3.77%, 優(yōu)于工藝A2B2C3D3E1下測得的3.52%。由此確定,最優(yōu)工藝為A2B2C2D3E2,即料液比1 ∶30,提取時間6 h,提取壓力1.55 MPa,提取溫度60 ℃,乙醇體積分?jǐn)?shù)80%。

3.4 精制精油含有量測定 將“3.3” 項下優(yōu)化工藝提取的沉香揮發(fā)油置于玻璃恒溫水浴電動攪拌機(jī)醇化罐中,60 r/min 下攪拌,逐漸升溫至45 ℃時保持溫度不變,繼續(xù)攪拌醇化1 d,再置于一級沉香純油專用分子分離設(shè)備中,進(jìn)行3 個階段的分子蒸餾：在蒸餾溫度50 ℃、蒸餾壓力200 Pa 條件下,得到水分；在蒸餾溫度70 ℃、蒸餾壓力10 Pa條件下,得到揮發(fā)性精油,其顏色呈明黃色,又略帶有紅色,流動性較差,具有沉香特有的濃郁醇厚香氣,并兼具凉意,氣味豐富飽滿,層次分明,其組成和含有量見表3；在蒸餾溫度80 ℃、蒸餾壓力1 Pa 條件下,得到液體精油,其顏色呈黃色,又略帶有紅褐色,流動性差,帶有沉香特有的香氣,但氣味比揮發(fā)性精油淡,其組成和含有量見表4。由此可知,揮發(fā)性、液體精油含有量分別為1.45%、0.867%,說明沉香精油中主要以揮發(fā)性成分為主。

表3 揮發(fā)性精油組成和含有量（n=3）Tab.3 Compositions and contents of volatile essential oils（n=3）

表4 液體精油組成和含有量（n=3）Tab.4 Compositions and contents of liquid essential oils（n=3）

4 討論和結(jié)論

目前,沉香精油的提取方法有水蒸氣蒸餾、果膠酶預(yù)處理輔助提取、纖維素酶輔助提取、動態(tài)-微波輔助、溶劑回流提取、超臨界CO2萃取等,其中水蒸氣蒸餾提取率低,萃取揮發(fā)油僅為沸點較低的小分子；酶輔助提取對溫度、能耐受pH 值、酶本身活力要求比較高；微波萃取時揮發(fā)性成分隨著萃取時間的延長而逐步散失；溶劑回流提取后有溶劑殘留,并且回收繁瑣費時；超臨界CO2提取工藝簡單,但萃取裝置屬于高壓設(shè)備,投資費用昂貴；亞臨界流體萃取溶劑殘留少,不會對物料中的熱敏性成分造成損害,克服了傳統(tǒng)工藝不足,在保留超臨界流體萃取優(yōu)點的同時溶劑選擇面大、物料廣泛,無污染,提取效率高,運行成本低,條件溫和,易與產(chǎn)物分離,并且不需要高壓設(shè)備,提取量大,在液態(tài)和臨界點附近具有良好的溶劑性能,尤其適合天然原料萃取,在醫(yī)藥、保健品領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景［21-22］。本實驗采用亞臨界流體［1,1,1,2-四氟乙烷(R134a) ］ 萃取沉香揮發(fā)油,發(fā)現(xiàn)該方法對揮發(fā)油這類極性較小的成分具有良好的選擇性和較高的萃取率。

雖然經(jīng)本實驗優(yōu)化工藝所得沉香提取物的氣味立體逼真,但仍然存在酸味、雜氣過重等問題,需進(jìn)一步除酸,并將提取過程中引入的溶劑蒸出來,即進(jìn)行醇化處理。其中,醇化溫度是沉香醇化過程中最好的催化劑,本實驗發(fā)現(xiàn)當(dāng)溫度升高至45 ℃以上時低分子揮發(fā)油被逐漸蒸出,對香料氣味至關(guān)重要,并且溫度過高會改變沉香氣味,導(dǎo)致其難聞,直接影響藥材品質(zhì)。時間是影響沉香醇化的另一個重要因素,醇化時間越長,藥材味道、品相越理想,但醇化超過24 h 后提取物顏色明顯變深,由原來黃色、略帶橙紅色變?yōu)榧t褐色,品相變差,故最終確定在45 ℃下持續(xù)攪拌1 d 進(jìn)行醇化。

然后,對揮發(fā)性、液體沉香精油進(jìn)行GC-MS分析。表3 顯示,前者中6,7-二甲基-2-苯乙基色酮為色酮類成分,4-苯基-2-丁酮(芐基丙酮)、4,6-二-(1.1-二甲基乙基) -2-甲基-苯酚、1,5-二苯基-1-戊烯-3-酮為芳香族類成分,斯巴醇(桉油烯醇)、白檀油烯醇、異香橙烯環(huán)氧化物、表-γ-桉葉油醇、沉香螺萜醇、馬兜鈴烯、愈創(chuàng)醇、α-桉葉油醇、α-白檀油醇、異白木香醇等為倍半萜類成分,棕櫚酸甲酯、亞油酸乙酯等為脂肪酸酯類成分,上述成分占總量的49.41%,其中愈創(chuàng)木醇、沉香螺萜醇、芐基丙酮等為沉香特征制香成分,占總量的14.65%；表4 顯示,后者中6,7-二甲基-2-苯乙基色酮為色酮類成分,4-苯基-2-丁酮(芐基丙酮)、4,6-二-(1.1-二甲基乙基) -2-甲基-苯酚為芳香族類成分,斯巴醇(桉油烯醇)、異香橙烯環(huán)氧化物、表-γ-桉葉油醇、沉香螺萜醇、β-桉葉醇、異白木香醇等為倍半萜類成分,棕櫚酸甲酯、亞油酸乙酯等為脂肪酸酯類成分,上述成分占總量的36.69%,其中愈創(chuàng)木烯、沉香螺萜醇、芐基丙酮等為沉香特征制香成分,占總量的6.51%。