魚(yú)腥草揮發(fā)油聚合物膠束的制備

張壯麗, 王紀(jì)芬, 汪婉瑩, 趙志鴻, 王桂芳, 鄒 敏

［1.河南省(鄭州大學(xué)) 醫(yī)藥科學(xué)研究院,河南 鄭州450052；2.鄭州大學(xué)藥物研究院,河南 鄭州450001］

魚(yú)腥草含有多種活性成分,以揮發(fā)油、黃酮為主［1-6］,具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗腫瘤、抗過(guò)敏、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、平喘等功效［7］,其揮發(fā)油為淡黃色透明液體,難溶于水,易溶于有機(jī)溶劑(如乙醇、氯仿等)。雖然關(guān)于該成分的研究報(bào)道很多,但仍很有必要研發(fā)相關(guān)制劑以增加其溶解度,掩蓋不良味道［8］。

泊洛沙姆407 由聚氧乙烯 (PEO) 單元(70%) 和聚氧-丙烯(PPO) 嵌段(30%) 組成,具有多功能三嵌段組合物PEO100-PPO65-PEO100,由于其安全性、較長(zhǎng)的循環(huán)周期、生物兼容性而廣泛用于制備納米粒［8］,更重要的是它具有較小的CMC［9］,膠束可利用疏水性的內(nèi)殼包裹魚(yú)腥草揮發(fā)油,而且具有1～100 nm 粒徑,可避免網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬,被動(dòng)靶向到達(dá)腫瘤部位,從而較好地發(fā)揮藥效,同時(shí)聚合物膠束還可緩慢釋放藥物［10］。因此,本實(shí)驗(yàn)制備魚(yú)腥草揮發(fā)油聚合物膠束,以期為相關(guān)制劑開(kāi)發(fā)提供參考。

1 材料

魚(yú)腥草揮發(fā)油(自制)。7890A 氣相色譜儀(美國(guó)安捷倫公司)；AR1530 分析天平［梅特勒-托利多儀器(上海) 有限公司］；超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；RE-52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)；WD-2A 藥物穩(wěn)定檢查儀(北京同德創(chuàng)業(yè)科技有限公司)；ZS90 納米粒度電位分析儀(英國(guó)馬爾文儀器有限公司)；JEM 2100 高分辨透射電子顯微鏡(日本電子株式會(huì)社)。甲基正壬酮(中國(guó)食品藥品檢定研究院)；泊洛沙姆407(德國(guó)巴斯夫公司)；正己烷(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 揮發(fā)油提?。?1］將干燥的藥材全草粉碎成粗粉,然后與蒸餾水以1 ∶10 的比例浸泡10 h,回流10 h,即得。

2.2 GC 條件 HP-5MS 石英毛細(xì)管色譜柱；載氣氦氣,尾吹氣氮?dú)?；進(jìn)樣口溫度280 ℃,氫火焰離子化檢測(cè)器溫度 280 ℃； 空氣體積流量450 mL/min,H2體積流量40 mL/min,柱體積流量1 mL/min；進(jìn)樣量1 μL；分流比20 ∶1；程序升溫：70 ℃保持5 min,5 ℃/min 升至100 ℃,2 ℃/min升至123 ℃并保持3 min,30 ℃/min 升至280 ℃并保持10 min。

2.3 含有量測(cè)定 由于魚(yú)腥草揮發(fā)油中甲基正壬酮含有量較高,性質(zhì)較穩(wěn)定,故本實(shí)驗(yàn)以其為含有量測(cè)定指標(biāo)［12］。

2.3.1 溶液制備

2.3.1.1 對(duì)照品溶液 精密稱(chēng)取甲基正壬酮對(duì)照品適量,置于25 mL 棕色量瓶中,正己烷溶解并定容至刻度,混勻,封口膜封口,即得,4 ℃下密封保存,臨用前稀釋成所需濃度。

2.3.1.2 供試品溶液 量取揮發(fā)油膠束溶液適量,置于錐形瓶中,加5 mL 正己烷超聲提取2 次,第1 次15 min, 第2 次20 min, 轉(zhuǎn)移到量瓶中,0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾,即得。

2.3.2 專(zhuān)屬性考察 制備空白膠束、揮發(fā)油膠束溶液,將兩者和對(duì)照品溶液 (甲基正壬酮) 在“2.2” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定,結(jié)果見(jiàn)圖1,可知該方法專(zhuān)屬性良好。

2.3.3 精密度試驗(yàn) 制備350、150、10 μg/mL 對(duì)照品溶液,在“2.2” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定,1 d內(nèi)間隔相同時(shí)間進(jìn)樣5 次,測(cè)定日內(nèi)精密度；5 d內(nèi)每天在相同時(shí)間進(jìn)樣1 次,測(cè)定日間精密度。結(jié)果,3 種質(zhì)量濃度下前者RSD 分別為1.13%、0.84%、2.15%,后者RSD 分別為0.75%、1.30%、1.27%,表明該方法精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 穩(wěn)定性試驗(yàn) 量取“2.3.1”項(xiàng)下供試品溶液,2 d 內(nèi)每個(gè)時(shí)間段分別間隔0、3.5、4、4、12 h 在“2.2” 項(xiàng)GC 條件下進(jìn)樣測(cè)定,測(cè)得RSD 為2.46%,表明溶液在23.5 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5 線性關(guān)系考察 分別精密移取對(duì)照品溶液1 415、1 101、786、235、157、78、31、15 μL 于10 mL 量瓶中,正己烷定容至刻度,稀釋成450、350、 250、 150、 50、 25、 10、 5 μg/mL, 在“2.2” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X),峰面積為縱坐標(biāo)(Y) 進(jìn)行回歸,得方程為Y＝73 176X-101 784(R2＝0.999 9),在4.767 0～449.687 0 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.6 檢測(cè)限、定量限測(cè)定 配制1、3、5、7、9 μg/mL 對(duì)照品溶液, 以S/N ＝10 為定量限,S/N＝3 為檢測(cè)限, 測(cè)得兩者分別為6.689 8、2.867 0 μg/mL。

圖1 甲基正壬酮GC 色譜圖Fig.1 GC chromatograms of 2-undecanone

2.3.7 加樣回收率試驗(yàn) 供試品溶液中加入相當(dāng)于揮發(fā)油含有量80%、100%、120%的對(duì)照品溶液,平行3 份,在“2.2” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定,計(jì)算回收率。結(jié)果,3 種質(zhì)量濃度下平均加樣回收率分別為98.60%、101.21%、101.92%,RSD分別為1.76%、2.98%、1.75%。

2.4 聚合物膠束制備 稱(chēng)取適量泊洛沙姆407 于圓底燒瓶中, 加入10 μL 揮發(fā)油, 氯仿溶解,35 ℃下旋蒸除去有機(jī)溶劑,一定體積蒸餾水水化,0.45 μm 濾膜過(guò)濾除去未被包裹的揮發(fā)油,得到有乳光透明的膠束溶液。精密量取適量于小錐形瓶中,加5 mL 正己烷超聲破乳15 min,分液漏斗內(nèi)靜置分層, 取上層于10 mL 量瓶中, 下層再加5 mL正己烷超聲破乳20 min,取上層于同一量瓶中,搖勻,0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾,取濾液,在“2.2” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定,按“2.3.5” 項(xiàng)下回歸方程計(jì)算含有量,并測(cè)定包封率和載藥量,公式如下。

2.5 Box-Behnken 響應(yīng)面法

2.5.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,以揮發(fā)油與泊洛沙姆407 比例 (A)、 有機(jī)溶劑用量(B)、水化體積(C) 為影響因素,包封率(Y)為評(píng)價(jià)指標(biāo),進(jìn)行3 因素3 水平設(shè)計(jì)。因素水平見(jiàn)表1,結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 因素水平Tab.1 Factors and levels

2.5.2 方差分析 線性分析,Y＝0.740 5+0.007 1A-0.005 1B+0.082 8,R2＝0.303；線性+雙因子交互作用分析, Y ＝0.740 5+0.007 1A-0.005 1B+0.082 8C-0.062 2AB+0.029 7AC+0.032 7BC,R2＝0.430 6；線性+平方分析,Y ＝0.897 7+0.007 1A-0.005 1B+0.082 8C-0.129 7A2-0.060 2B2-0.104 7C2, R2＝0.864 2； 二 項(xiàng) 式 擬 合, Y ＝0.897 7+0.007 12A-0.005 14B+0.082 76C-0.129 72A2-0.060 20B2-0.104 75C2-0.062 20AB+0.029 70AC+0.032 72BC,R2＝0.991 7。

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Tab.2 Design and results of tests

由此可知,二項(xiàng)式擬合模型相關(guān)系數(shù)最大,故選擇其進(jìn)行后續(xù)研究(α ＝0.05),方差分析見(jiàn)表3。由表可知,R2＝99.17%,調(diào)整R2＝97.67%,表明該模型可解釋97.67%包封率的變化；除因素A、B 外對(duì)包封率均有顯著影響(P＜0.05)；失擬項(xiàng)P ＝0.406＞0.05,表明其他未知因素對(duì)實(shí)驗(yàn)干擾小,能較好地模擬實(shí)際情況。

表3 方差分析Tab.3 Analysis of variance

2.5.3 響應(yīng)面分析 見(jiàn)圖2。

圖2 各因素響應(yīng)面圖Fig.2 Response surface plots for various factors

2.5.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 由圖2 可知,最優(yōu)工藝為揮發(fā)油與泊洛沙姆407 比例1 ∶3,有機(jī)溶劑用量5 mL,水化體積5.4 mL,包封率91.48%。再平行制備3批聚合物膠束, 測(cè)得其包封率分別為87.5%、88.7%、85.6%, 平均87.26% (RSD ＝1.79%),載藥量為3.68%,與預(yù)測(cè)值相當(dāng)。

2.6 表征

2.6.1 形態(tài) 將聚合物膠束溶液滴到銅網(wǎng)上,

2.0 %磷鎢酸染色,自然晾干后透射電鏡(TEM)觀察,結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖可知,聚合物膠束無(wú)粘連,粒徑與馬爾文粒徑儀測(cè)定的一致。

2.6.2 粒徑、PDI、Zeta 電位 圖4 顯示,聚合物膠束平均粒徑為35.20 nm,PDI 為0.158,而且分布均勻,有明顯的乳光現(xiàn)象。另外,其Zeta 電位在-7.51 mV 左右,峰寬度為6.88,體系較穩(wěn)定。

圖3 樣品TEM 圖Fig.3 TEM image for samples

圖4 樣品粒徑圖Fig.4 Particle size diagram for samples

2.6.3 外貌 泊洛沙姆407 直接溶于蒸餾水中,標(biāo)記為1 號(hào)；直接溶解法、薄膜分散法制備聚合物膠束,分別標(biāo)記為2、3 號(hào)。肉眼觀察發(fā)現(xiàn),1 號(hào)不存在乳光澄清透明現(xiàn)象,3 號(hào)存在明顯乳光現(xiàn)象,并且比2 號(hào)更明顯。

2.6.4 體外釋放行為 吸取薄膜分散法、直接溶解法制備的聚合物膠束溶液各5 mL,分別裝入不同的1 000 Da 透析袋內(nèi),釋放介質(zhì)均為含10%無(wú)水乙醇的磷酸鹽緩沖液 (總體積30 mL)［13］,37 ℃下120 r/min 搖床振蕩,于0.5、1、2、4、6、8、12、24、36、48、72 h 各吸取3 mL,并加入新鮮的3 mL 釋放介質(zhì),按“2.4” 項(xiàng)下方法測(cè)定含有量,計(jì)算累積釋放度,結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖可知,薄膜分散法制備的聚合物膠束更具有緩釋作用,可能是它被包裹在膠束內(nèi)殼中,而直接溶解法制備的附在載體表面。

2.7 穩(wěn)定性評(píng)價(jià)

圖5 樣品體外釋放曲線Fig.5 In vitro release curves for samples

2.7.1 強(qiáng)光照與高溫 按“2.5.4” 項(xiàng)下優(yōu)化工藝制備1 份聚合物膠束,平均分成3 份,密封于透明西林瓶中,設(shè)置光照強(qiáng)度為3 000 lx,藥物穩(wěn)定性檢查儀排氣扇打開(kāi),分別在第0、5、10 天測(cè)得包封率為88.6%、63.7%、30.4%。光照實(shí)驗(yàn)結(jié)束后再制備1 批,平均分成3 份,密封于透明西林瓶中,放到已調(diào)好的藥物穩(wěn)定性檢查儀中,安裝保溫?fù)醢?溫度設(shè)定為60 ℃),分別在第0、5、10 天測(cè)得包封率為87.37%、71.82%、60.58%。由此可知,強(qiáng)光照下粒徑、Zeta 電位變化不明顯,但包封率明顯下降,可能與揮發(fā)油中甲基正壬酮在該條件下不穩(wěn)定有關(guān)；高溫下聚合物膠束發(fā)生粘連,粒徑變大,PDI 先降低后增大,外觀澄清透明,乳光逐漸消失,推測(cè)其可能已被破壞。

2.7.2 4 ℃與室溫 制備1 份聚合物膠束,平均分成6 份,室溫下放置；再取6 份,4 ℃下放置,于第0、5、10、30、60、90 天測(cè)定包封率、粒徑、PDI。結(jié)果, 室溫下包封率分別為 90.34%、89.21%、 85.78%、 78.64%、 75.31%、 61.62%,狀態(tài)無(wú)明顯變化,粒徑、PDI 也變化不大；4 ℃下在第60 天出現(xiàn)絮狀物,將其超聲溶解后繼續(xù)測(cè)定,分 別 為 88.91%、 84.74%、 83.28%、 76.65%、72.84%、73.11%,表明2 種條件下包封率降低程度相當(dāng),可能與密封性有關(guān)。由于4 ℃下聚合物膠束出現(xiàn)不穩(wěn)定狀態(tài),故它適合在室溫下貯存。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)以甲基正壬酮為魚(yú)腥草揮發(fā)油含有量測(cè)定指標(biāo),并通過(guò)方法學(xué)考察發(fā)現(xiàn)其精密度、穩(wěn)定性、加樣回收率均較理想。同時(shí),首次通過(guò)Box-Behnken 響應(yīng)面法優(yōu)化魚(yú)腥草揮發(fā)油聚合物膠束制備工藝,驗(yàn)證試驗(yàn)中所測(cè)包封率與預(yù)測(cè)值相當(dāng)。另外,該制劑粒徑均勻,在35 nm 左右,而且分布無(wú)粘連。

測(cè)定累積釋放度時(shí)發(fā)現(xiàn),薄膜分散法制備的魚(yú)腥草揮發(fā)油聚合物膠束釋放速度較直接溶解法制備的緩慢,72 h 時(shí)仍有釋放,表明此時(shí)揮發(fā)油均勻分布在膠束的疏水性?xún)?nèi)殼中,從而達(dá)到緩釋作用?？疾旆€(wěn)定性時(shí)發(fā)現(xiàn),聚合物膠束包封率在室溫、4 ℃下均有所減少,可能是其密封性不理想所致,但在4 ℃下第60 天出現(xiàn)的絮狀物在室溫下未出現(xiàn),可能是該條件下不穩(wěn)定,或與泊洛沙姆407 性質(zhì)有關(guān)。高溫下?lián)]發(fā)油揮發(fā)性增強(qiáng),而且泊洛沙姆407易發(fā)生粘連；強(qiáng)光照下包封率顯著降低,這是由于甲基正壬酮在該條件下不穩(wěn)定。

綜上所述,本實(shí)驗(yàn)制備了魚(yú)腥草揮發(fā)油聚合物膠束,其粒徑小,包封率高,可將揮發(fā)油被動(dòng)靶向到治療部位,而且能明顯增加其溶解度,掩蓋其不良?xì)馕?。采用Box-Behnken 響應(yīng)面法優(yōu)化制備工藝,可減少實(shí)驗(yàn)時(shí)間,降低資源浪費(fèi)［14］,為后續(xù)研究魚(yú)腥草揮發(fā)油及相關(guān)制劑提供依據(jù)。