去氫駱駝蓬堿聚乳酸納米粒的制備及其藥動(dòng)學(xué)行為

尚慧杰, 阮曉東, 陳曉峰

(1.鄭州澍青醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校, 河南 鄭州450064； 2.上海雷允上藥業(yè)有限公司技術(shù)中心,上海201401)

駱駝蓬Peganum harmala L.為蒺藜科駱駝蓬屬多年生草本植物,去氫駱駝蓬堿是其主要活性成分之一,具有提高免疫、輻射防護(hù)、抗菌、抗腫瘤、中樞興奮等藥理作用［1-2］,但該成分水溶性很差,生物利用度低下［3］。因此,有必要采用制劑新技術(shù)來(lái)解決這一問(wèn)題,推進(jìn)它在臨床上的應(yīng)用。

聚乳酸是一種可生物降解的聚合物,體內(nèi)最終代謝成二氧化碳和水,被美國(guó)、德國(guó)等國(guó)家批準(zhǔn)用于藥用和醫(yī)用材料。納米給藥系統(tǒng)是指采用高分子材料作為載體制備的膠體微粒,粒徑＜1 000 nm,可增加難溶性藥物溶解度,降低毒副作用,促進(jìn)藥物吸收,實(shí)現(xiàn)被動(dòng)靶向［4-7］。本實(shí)驗(yàn)制備去氫駱駝蓬堿聚乳酸納米粒,對(duì)其體外基本性質(zhì)進(jìn)行初步研究,并考察其藥動(dòng)學(xué)行為,為該成分開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料

Agilent 1260 型高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司)；AR2140 型電子天平［梅特勒-托利多儀器(上海) 有限公司］； VORTEX-5 型渦旋混合器(海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司)；JY92-II 型超聲儀(寧波新知科儀器研究所)；YC-1200 型臺(tái)式冷凍干燥機(jī) (北京亞星儀科科技發(fā)展有限公司)；Master-sizer 型粒度分析儀(英國(guó)馬爾文儀器有限公司)；MD200-2 型氮?dú)獯祾邇x(杭州奧威儀器有限公司)；。

去氫駱駝蓬堿對(duì)照品(批號(hào)20170115,南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司,含有量＞98%)。聚乳酸(分子量15 000,批號(hào)2016081715,山東岱罡科技有限公司)；Poloxamer 188(德國(guó)巴斯夫公司,含有量＞98%)。 甲醇為色譜純； 其他試劑均為分析純。

SD 大鼠,雌雄兼具,體質(zhì)量 (300±20) g,購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,許可證號(hào)SCXK(滬)2012-0002。

2 方法與結(jié)果

2.1 去氫駱駝蓬堿含有量測(cè)定

2.1.1 色譜條件 Waters C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流動(dòng)相甲醇-0.2%甲酸(55 ∶45)；檢測(cè)波長(zhǎng)248 nm；體積流量1.0 mL/min；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量20 μL。

2.1.2 線性關(guān)系考察 精密稱(chēng)取去氫駱駝蓬堿對(duì)照品10.0 mg,置于10 mL 量瓶中,加入適量甲醇超聲溶解,室溫下放置40 min 后甲醇定容,精密量取適量, 甲醇稀釋成20.0、10.0、5.0、0.5、0.05 μg/mL,在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以峰面積(Y) 對(duì)溶液質(zhì)量濃度(X) 進(jìn)行回歸,得方程為Y＝1.212 4X+0.009 3(r＝0.999 9),在0.05～20.0 μg/mL 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.1.3 方法學(xué)考察 取0.05、5.0、20.0 μg/mL對(duì)照品溶液,在“2.1.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定5 次,測(cè)得3 種質(zhì)量濃度下日內(nèi)精密度RSD 分別為0.43%、0.19%、0.17%,日間精密度(連續(xù)測(cè)定5 d, 每天1 次) RSD 分別為0.82%、 0.37%、0.15%。取空白納米?；鞈乙夯?.0%十二烷基硫酸鈉水溶液1 mL,加入0.5、5.0、20.0 μg/mL 對(duì)照品溶液各1 mL,測(cè)得去氫駱駝蓬堿平均加樣回收率為99.71%,RSD 小于1.76%。

2.2 聚乳酸納米粒制備 精密稱(chēng)取去氫駱駝蓬堿20 mg、聚乳酸160 mg,溶于25 mL 丙酮-乙醇等比例混合溶液中,注射器緩慢加到50 mL 含0.25%Poloxamer 188 的水相中,超聲10 min,減壓旋蒸除去有機(jī)溶劑,濃縮,離心60 min(25 000 r/min),沉淀物用蒸餾水洗滌后定容至10 mL,以5%甘露醇為凍干保護(hù)劑,-70 ℃下預(yù)凍48 h,掛入冷凍干燥機(jī)中制備,即得,以去氫駱駝蓬堿計(jì),含有量為2.88%。同法制備空白聚乳酸納米粒。

2.3 粒徑、PDI、Zeta 電位測(cè)定 取聚乳酸納米粒凍干前混懸液,蒸餾水適當(dāng)稀釋后放入比色池中,測(cè)定粒徑、PDI、Zeta 電位,結(jié)果見(jiàn)圖1 ～2。聚乳酸納米粒粒徑分布在100 ～450 nm 之間,平均粒徑為 (195.38±2.02) nm, PDI 為 (0.131±0.034),Zeta 電位為(-19.48±0.36) mV。

圖1 聚乳酸納米粒粒徑分布Fig.1 Particle size distribution of polylactic acid nanoparticles

圖2 聚乳酸納米粒Zeta 電位Fig.2 Zeta potential of polylactic acid nanoparticles

2.4 包封率、載藥量測(cè)定 取“2.2” 項(xiàng)下聚乳酸納米粒凍干前混懸液1.0 mL,25 000 r/min 離心60 min,取上清液,按“2.1” 項(xiàng)下方法測(cè)定去氫駱駝蓬堿含有量(W1)；另取聚乳酸納米?；鞈乙?.0 mL,加入約7 mL 甲醇超聲后定容至10 mL,0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾,測(cè)定去氫駱駝蓬堿總含有量(W0),計(jì)算包封率、載藥量,公式分別為包封率＝ ［(W0-W1) /W0］ ×100%、載藥量＝ ［(W0-W1) /Wt］ ×100% (Wt為聚乳酸納米?？傎|(zhì)量),測(cè)得兩者分別為 (76.37±1.08)%、 (8.81±0.25)%。

2.5 體外釋藥行為研究 1.0%十二烷基硫酸鈉溶液制備去氫駱駝蓬堿、聚乳酸納米粒凍干粉混懸液(以去氫駱駝蓬堿計(jì),含有量為2 mg)、含2 mg 去氫駱駝蓬堿混懸液各2 mL,置于透析袋中,兩端扎緊,以1.0%十二烷基硫酸鈉水溶液為溶出介質(zhì),體積100 mL, 轉(zhuǎn)速100 r/min, 溫度 (37±1)℃,于0、0.25、0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、6、8、12、24 h 各取樣1.0 mL,同時(shí)補(bǔ)加1.0 mL空白釋放介質(zhì),按“2.1” 項(xiàng)下方法測(cè)定藥物含有量,計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)累積釋放度,繪制釋藥曲線,結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖可知,去氫駱駝蓬堿在2.5 h 內(nèi)即基本釋放完畢；其聚乳酸納米粒體外釋藥分為2 個(gè)階段,在前8 h 內(nèi)為快速釋藥期,8 h 后則為緩慢釋藥期,24 h 內(nèi)累積釋放度為82.17%。然后,通過(guò)一級(jí)模型、Higuchi 模型、Weibull 模型等對(duì)釋藥行為進(jìn)行擬合,發(fā)現(xiàn)釋藥過(guò)程更符合Weibull 模型(r＝0.985 7)。

圖3 樣品體外釋放曲線Fig.3 In vitro release curves for samples

2.6 藥動(dòng)學(xué)行為研究

2.6.1 對(duì)照品、內(nèi)標(biāo)溶液制備 取“2.1” 項(xiàng)下0.5 μg/mL 對(duì) 照 品 溶 液, 稀 釋 成20.0、 50.0、100.0、250.0、500.0 ng/mL,即得。精密稱(chēng)取替硝唑10.40 mg,置于10 mL 量瓶中,8 mL 甲醇超聲溶解,冷卻至室溫后甲醇定容至刻度并逐步稀釋,即得(520 ng/mL)。

2.6.2 血漿樣品處理［3,8］精密量取血漿樣品200 μL于離心管中,同時(shí)加入20 μL 內(nèi)標(biāo)溶液,飽和NaCO3堿化,加入4.0 mL 乙酸乙酯振蕩混勻3 min,10 000 r/min 離心6 min,轉(zhuǎn)移上清液至另一離心管中,40 ℃氮?dú)饩徛等ビ袡C(jī)溶劑,殘?jiān)尤?00 μL 甲醇溶解,10 000 r/min 離心6 min,在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。

2.6.3 專(zhuān)屬性考察 取空白血漿、血漿對(duì)照品溶液(20.0 ng/mL)、給藥12 h 后血漿樣品適量,按“2.6.2” 項(xiàng)下方法處理,在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定,結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖可知,空白血漿內(nèi)源性物質(zhì)不干擾測(cè)定,去氫駱駝蓬堿和內(nèi)標(biāo)分離度良好。

圖4 去氫駱駝蓬堿HPLC 色譜圖Fig.4 HPLC chromatograms of harmine

2.6.4 方法學(xué)考察 取“2.6.1” 項(xiàng)下去氫駱駝蓬堿血漿樣品,按“2.6.2” 項(xiàng)下方法處理,在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定,以去氫駱駝蓬堿與替硝唑峰面積比值(Y) 對(duì)去氫駱駝蓬堿質(zhì)量濃度(X) 進(jìn)行回歸,得方程為Y ＝0.038 1X+0.010 9(r ＝0.999 0),在20.0 ～500.0 ng/mL 范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。20.0、250.0、500.0 ng/mL 對(duì)照品溶液日內(nèi)精密度RSD 分別為5.09%、3.37%、3.97%,日間精密度(連續(xù)測(cè)定5 d,每天1 次)RSD 分別為8.82%、 5.17%、 6.44%。 取20.0、250.0、500.0 ng/mL 對(duì)照品溶液各200 μL,氮?dú)獯党袡C(jī)溶劑后,加入200 μL 空白大鼠血漿,按“2.6.2”項(xiàng)下方法處理,測(cè)得3 種質(zhì)量濃度下平均加樣回收率分別為90.68%、96.06%、102.18%,RSD＜8.52%。于0、1、2、3、4 d 測(cè)定去氫駱駝蓬堿血漿樣品,發(fā)現(xiàn)在冷凍保存條件下,去氫駱駝蓬堿與內(nèi)標(biāo)峰面積比值無(wú)顯著變化(P＞0.05)。

2.6.5 給藥方案及樣品采集 取去氫駱駝蓬堿適量,0.5%CMC-Na 溶液配制成20 mg/mL 混懸液；另取聚乳酸納米粒凍干粉適量,蒸餾水配制成同等濃度混懸液,作為灌胃液,備用。取大鼠12 只,實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中適應(yīng)1 d,其間禁食不禁水,然后隨機(jī)分為2 組,按40 mg/kg 劑量分別灌胃給予去氫駱駝蓬堿、 聚乳酸納米?；鞈乙? 于0.083、0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、10、12 h 眼眶采血各約0.3 mL, 置于肝素化離心管中,4 000 r/min下離心3 min,小心分取上層血漿,置于另一空白離心管中,-20 ℃冰箱中保存待測(cè)。

2.6.6 藥動(dòng)學(xué)行為研究 大鼠灌胃給予去氫駱駝蓬堿及其聚乳酸納米粒混懸液后,測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)血漿中去氫駱駝蓬堿血藥濃度,繪制血藥濃度-時(shí)間曲線,結(jié)果見(jiàn)圖5、表1。由此可知,聚乳酸納米粒Tmax、Cmax、AUC0～t、AUC0～∞顯著高于去氫駱駝蓬堿(P＜0.05,P＜0.01)。

圖5 樣品血藥濃度-時(shí)間曲線Fig.5 Plasma concentration-time curves for samples

表1 樣品主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)n=6）Tab.1 Main pharmacokinetic parameters for sampless，n=6）

表1 樣品主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)n=6）Tab.1 Main pharmacokinetic parameters for sampless，n=6）

注：與去氫駱駝蓬堿比較,*P＜0.05,**P＜0.01

參數(shù) 單位 去氫駱駝蓬堿 聚乳酸納米粒TC mmaaxx ng·m h L-1 22 13..41 38± ±03.0 2.87 4 50 28..03 83± ±09.1 4.0 67***AUC0～t ng·mL-1·h 1 413.78±211.93 3 256.41±379.05**AUC0～∞ ng·mL-1·h 1 504.48±240.86 3 393.65±423.72**

3 討論

本實(shí)驗(yàn)制備的去氫駱駝蓬堿聚乳酸納米粒粒徑較小,分布均勻,可能是由于溶解藥物、載體的丙酮和乙醇可在水相中迅速擴(kuò)散,易得到較小的粒徑［9-10］；水相中表面活性劑對(duì)納米粒具有穩(wěn)定作用,不易發(fā)生粘連,平均粒徑為(195.38±2.02)nm,而凍干后雖增加至(203.28±3.94) nm,但粒徑變化無(wú)顯著差異(P＞0.05)。另外,混合溶劑乙醇與丙酮的比例不可過(guò)高,以防聚乳酸析出；水相中表面活性劑濃度也不宜太高,防止增溶作用使去氫駱駝蓬堿溶于水相,從而降低包封率、載藥量,經(jīng)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)考察,最終選擇0.25%。

處理去氫駱駝蓬堿血漿樣品時(shí),先加入堿性物質(zhì)NaCO3使待測(cè)組分游離出來(lái),再用有機(jī)溶劑乙酸乙酯進(jìn)行萃取,該方法精密度、回收率等均符合2015 年版《中國(guó)藥典》 四部9012 項(xiàng)下生物樣品定量分析方法學(xué)驗(yàn)證指導(dǎo)原則的規(guī)定。藥動(dòng)學(xué)行為研究結(jié)果顯示,聚乳酸納米?？娠@著提高去氫駱駝蓬堿Cmax和AUC0～t,其原因可能是聚乳酸納米技術(shù)可明顯增加藥物分散性和比表面積,從而提高與胃腸道黏膜的接觸面積；納米粒易吸附在胃腸道黏膜,有助于藥物充分吸收,同時(shí)可在胃腸道具有淋巴結(jié)構(gòu)的派伊爾淋巴集結(jié)中聚集,通過(guò)M 細(xì)胞進(jìn)入體循環(huán)而促進(jìn)藥物吸收。測(cè)定體外釋放度時(shí)發(fā)現(xiàn),聚乳酸納米粒釋放速度明顯慢于去氫駱駝蓬堿,但兩者Tmax相差不大,這可能是由于納米?？稍谳^短時(shí)間內(nèi)經(jīng)消化道直接吸收進(jìn)入體循環(huán)［11］,主要途徑為消化道上皮細(xì)胞直接吸收,或通過(guò)派伊爾淋巴集結(jié)和上皮細(xì)胞吸收,其相對(duì)生物利用度是后者的2.30 倍,有助于充分發(fā)揮藥理作用［9,12-13］。今后,將進(jìn)行去氫駱駝蓬堿聚乳酸納米粒的藥效學(xué)研究, 以期為進(jìn)一步研發(fā)提供更完整的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)［14］。