稻蝦共作對(duì)稻田土壤反硝化細(xì)菌nosZ基因數(shù)量、多樣性及群落結(jié)構(gòu)的影響

王蓉　龔世飛　金濤　劉章勇

摘要：對(duì)稻蝦共作模式下水稻土壤反硝化細(xì)菌群落進(jìn)行研究，以期揭示稻蝦復(fù)合種養(yǎng)模式下土壤反硝化細(xì)菌豐度、群落多樣性及組成，為科學(xué)研究稻蝦共作模式的土壤微生物多樣性，維持土壤地力提供理論依據(jù)。依托長(zhǎng)江大學(xué)農(nóng)學(xué)院基地設(shè)置常規(guī)中稻種植模式（MR）、稻蝦共作模式（CR）等2種模式，利用熒光定量PCR和高通量測(cè)序平臺(tái)比較2種模式下水稻土壤反硝化細(xì)菌nosZ基因的數(shù)量、群落多樣性及群落組成。結(jié)果表明，稻蝦共作顯著提高水稻土壤硝態(tài)氮、全碳、全氮含量，對(duì)堿解氮含量、pH值、碳氮比及銨態(tài)氮含量無(wú)顯著影響。nosZ基因在MR、CR處理中的基因豐度分別為1 g干土1.51×106、2.23×106拷貝數(shù)，CR處理中nosZ基因豐度是MR的1.48倍。CR處理顯著提高了土壤nosZ基因的豐度。通過(guò)對(duì)α群落多樣性指數(shù)進(jìn)行方差分析可知，CR處理與MR處理間微生物群落多樣性差異不顯著。經(jīng)韋恩（Venn）分析，在目和科水平上，MR處理與CR處理的微生物群落組成顯示出較高的相似度，在屬與種水平上，2個(gè)處理下的土壤微生物群落結(jié)構(gòu)存在差異性，CR處理下的土壤缺失沼澤紅假單胞菌。經(jīng)冗余分析，土壤總碳（TC）含量對(duì)nosZ基因群落結(jié)構(gòu)的影響最為顯著，其次是pH值、堿解氮含量、硝態(tài)氮含量與銨態(tài)氮含量。綜合分析，稻蝦共作可顯著提高水稻土壤nosZ基因豐度，稻蝦輪作對(duì)群落多樣性的影響較小，其在種水平上缺失了沼澤紅假單胞菌。常規(guī)中稻種植模式與稻蝦共作模式下的土壤微生物群落結(jié)構(gòu)雖保有一定的相似度，但仍存在差異，土壤總碳含量是影響群落結(jié)構(gòu)差異的主要原因。

關(guān)鍵詞：稻蝦共作;反硝化作用;熒光定量;高通量測(cè)序技術(shù);α群落多樣性;nosZ基因

中圖分類號(hào)： S154.3? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號(hào)：1002-1302（2019）04-0246-06

反硝化作用作為土壤氮循環(huán)的組成部分，在土壤氮素轉(zhuǎn)化中占據(jù)重要地位[1-2]。反硝化過(guò)程在厭氧的條件下由微生物驅(qū)動(dòng)，可產(chǎn)生氧化亞氮（N2O），被認(rèn)為是土壤釋放N2O的主要過(guò)程[3-7]，主要指硝化作用產(chǎn)生的硝酸根（NO3-）最終被還原成氮?dú)猓∟2）的過(guò)程，中間過(guò)程會(huì)產(chǎn)生一氧化碳（NO）和N2O等氣體，造成氮素?fù)p失，并引起一系列環(huán)境問(wèn)題[8-10]。反硝化過(guò)程分為4個(gè)部分[11]：第1步在由nar或narp基因編碼的硝酸鹽還原酶的催化作用下，將硝酸鹽（NO3-）還原成亞硝酸鹽（NO2-）;第2步反應(yīng)是在由nirK基因或nirS基因編碼的亞硝酸鹽還原酶的催化作用下，將亞硝酸鹽還原成NO;第3步反應(yīng)在由norB基因編碼的一氧化氮還原酶的催化作用下，將NO還原為N2O，此步可將氮素以氣態(tài)的形式排放;第4步是在由nosZ基因編碼的氧化亞氮還原酶的催化作用下，將N2O還原為N2。由于氧化亞氮還原酶是控制N2O排放的主要調(diào)節(jié)因子，是完全脫氮途徑最后一步的重要催化劑，因此nosZ基因通常被用作研究反硝化群落的遺傳標(biāo)記。稻田是重要的農(nóng)業(yè)用地，其中約70%位于亞熱帶和熱帶地區(qū)，同時(shí)也是N2O的主要來(lái)源[12]。與旱地土壤不同，常年淹水的稻田土壤提供的厭氧條件有利于反硝化作用的發(fā)生[13]。稻蝦種養(yǎng)是將水稻種植與克氏螯蝦養(yǎng)殖相結(jié)合組成的互利共生復(fù)合生態(tài)農(nóng)業(yè)系統(tǒng)，是稻田綜合種養(yǎng)模式之一。該模式實(shí)現(xiàn)了一水兩用、一田雙收，在節(jié)約稻田水土資源的同時(shí)帶來(lái)可觀的經(jīng)濟(jì)效益[14]。當(dāng)前，我國(guó)農(nóng)業(yè)正面臨著資源與環(huán)境約束加劇和農(nóng)民增收難度加大的難題，稻蝦生態(tài)種養(yǎng)高效模式的興起，被農(nóng)業(yè)部譽(yù)為“現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的一次革命”，很快在長(zhǎng)江中下游地區(qū)獲得大面積的推廣種植。截至2016年，稻蝦種養(yǎng)模式在江漢平原推廣面積已經(jīng)達(dá)到20萬(wàn)hm2以上[15]。統(tǒng)計(jì)顯示，全國(guó)適合稻蝦種養(yǎng)模式的稻田面積高達(dá)450萬(wàn)hm2[16]。稻蝦種養(yǎng)模式面積逐年擴(kuò)大，但國(guó)內(nèi)外關(guān)于稻蝦種養(yǎng)模式下參與稻田土壤反硝化反應(yīng)微生物的研究較少。通過(guò)研究微生物種群數(shù)量和群落結(jié)構(gòu)，可以明確稻蝦土壤反硝化過(guò)程的作用機(jī)制及影響因素。本試驗(yàn)以江漢平原典型稻蝦種養(yǎng)區(qū)湖北省荊州市為研究對(duì)象，研究該模式下土壤反硝化微生物的變化特征，以期揭示稻蝦種養(yǎng)模式土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性的變化規(guī)律，豐富稻蝦種養(yǎng)模式反硝化微生物理論，同時(shí)為該地區(qū)土地利用改良、農(nóng)業(yè)結(jié)構(gòu)戰(zhàn)略性調(diào)整以及發(fā)展稻蝦種養(yǎng)高產(chǎn)高效生態(tài)友好型農(nóng)業(yè)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)地位于湖北省荊州市長(zhǎng)江大學(xué)農(nóng)學(xué)院基地（地理位置30°6′ N，111°54′ E）。該地區(qū)處于江漢平原地帶，具有四季分明、雨熱同季、年降水量充沛等特點(diǎn)，冬季受極地大陸氣團(tuán)影響，氣溫偏低，降水量少;夏季受熱帶海洋氣團(tuán)影響，高溫多雨，水分季節(jié)分配不均，屬于亞熱帶季風(fēng)氣候區(qū)，年均降水量在1 100 mm左右，無(wú)霜期200 d。土壤類型為潮土，土壤母質(zhì)為河流沖積物。供試土壤全氮、全磷、速效鉀含量分別為0.75 g/kg、0.54 g/kg、17.09 mg/kg，有機(jī)質(zhì)含量為38.8 g/kg，pH值為7.5。

試驗(yàn)設(shè)置常規(guī)中稻種植模式（MR）與稻蝦共作模式（CR），本研究自2015年開始，連續(xù)開展2年，于中稻抽穗期采集土壤樣品作為研究對(duì)象。試驗(yàn)小區(qū)由長(zhǎng)12 m、寬5 m的田埂圍成，每個(gè)處理3次重復(fù)，為防止小龍蝦逃出，田埂加高加固并在田埂周圍鋪設(shè)塑料膜。水稻品種為隆兩優(yōu)華占，小龍蝦品種為克氏原鰲蝦，施肥量采用當(dāng)?shù)亓?xí)慣用量，年均施肥量為氮肥180 kg/hm2、磷肥75 kg/hm2、鉀肥105 kg/hm2，以尿素（含N 46%）、過(guò)磷酸鈣（含P2O5 12%）、氯化鉀（含K2O 60%）的形式施用。氮肥按基肥：蘗肥：穗肥=5 ∶ 2 ∶ 3施用，磷肥用作底肥1次基施，鉀肥按照50%基肥、50%追肥的方式施肥。2種模式水稻期間田間水分管理為前期灌水、中期曬田、后期干濕交替的模式。蝦田于每年水稻收獲后覆水泡田，隨即投放蝦苗，投放密度約為20萬(wàn)只/hm2，來(lái)年4月至6月上旬捕撈成蝦，捕撈完成后開始整體準(zhǔn)備中稻的移栽，等待水稻收獲后進(jìn)行下一輪的小龍蝦養(yǎng)殖。

1.2 土壤樣品采集

土壤樣品在水稻抽穗期采集，用于基本理化性質(zhì)分析與土壤微生物測(cè)定。采用不銹鋼土鉆按照5點(diǎn)采樣法采集用于測(cè)定土壤基本理化性質(zhì)的土樣，重復(fù)3次，將土樣帶回實(shí)驗(yàn)室剔除石子、根系等雜物，存放在陰涼處混勻風(fēng)干，待土樣風(fēng)干磨碎后分別過(guò)20目與100目篩用于室內(nèi)分析。用谷物采樣器采集用于測(cè)定水稻土壤微生物的樣品，每個(gè)處理重復(fù)3次，樣品采集后剔除石子與根系，然后立即放入錫箔紙中包裹，存放在液氮罐中，并帶回實(shí)驗(yàn)室存放于-80 ℃冰箱備用。

1.3 土壤基本理化性質(zhì)測(cè)定

土壤基本理化性質(zhì)分析參考鮑士旦的方法[17]。土壤全氮、全碳含量采用ECS4024元素分析儀（意大利Costech公司）測(cè)定;土壤堿解氮含量測(cè)定采用堿解擴(kuò)散法;土壤硝態(tài)氮含量采用 2 mol/L KCl溶液浸提并在203、270 nm下測(cè)定;銨態(tài)氮含量測(cè)定采用靛酚藍(lán)比色法;pH值測(cè)定采用電位法（水與土質(zhì)量比為2.5 ∶ 1）。

1.4 土壤總DNA提取

取0.25 g低溫保存的土壤樣品，用PowerSoil DNA Isolation Kit（美國(guó)Mobio公司） DNA試劑盒提取土壤總DNA。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總DNA，并用NanoDrop ND-1000UVevis分光光度計(jì)（美國(guó)賽默飛世爾科技公司）檢測(cè)提取的DNA濃度與純度。

1.5 反硝化微生物nosZ基因擴(kuò)增與熒光定量PCR分析

用引物對(duì)[18]nosZF（CGYTGTTCMTCGACAGCCAG）和nosZ-1622R（CGSACCTTSTTGCCSTYGCG）擴(kuò)增nosZ基因。PCR反應(yīng)體系總體積為20 μL，包括：10 μL 2×syberMIX，0.2 μL 的2種上、下游引物（10 μmol/L），1 μL稀釋8倍后的樣品，最后用無(wú)RNA酶的ddH2O補(bǔ)足至20 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃ 預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s，57 ℃退火45 s，72 ℃ 延伸55 s，32個(gè)循環(huán);72 ℃終延伸10 min，通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：將PCR產(chǎn)物純化回收后，選取熒光假單胞菌的nosZ基因陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)接過(guò)夜培養(yǎng)，質(zhì)粒濃度經(jīng)分光光度計(jì)測(cè)定后，按照10倍梯度逐漸將質(zhì)粒稀釋至103～108拷貝數(shù)，-80 ℃低溫保存。

熒光定量PCR反應(yīng)在ABI7500熒光定量PCR儀（美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）上進(jìn)行，引物序列前文已標(biāo)出，反應(yīng)體系總體積為25 μL，包括2×SYBER Green 12.5 μL，上下游引物各 0.8 μL，ROX 0.4 μL，DNA模板2.0 μL，用ddH2O補(bǔ)至 25 μL，試驗(yàn)試劑購(gòu)寶生物工程（大連）有限公司。

1.6 高通量測(cè)序

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)切膠純化后連接至pUC-T載體上，轉(zhuǎn)至大腸桿菌DH5α中進(jìn)行培養(yǎng)，選用陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，序列提交至NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，并將同源性大于等于97%的序列進(jìn)行可操作分類單元（operational taxonomic units，簡(jiǎn)稱OTU）聚類。

1.7 數(shù)據(jù)處理與作圖

利用SPSS 22.0對(duì)土壤基本理化性質(zhì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析;采用CANOCO 5.0軟件對(duì)土壤基本理化性質(zhì)與反硝化微生物nosZ基因群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行冗余分析（redundancy analysis，簡(jiǎn)稱RDA），使用Mothur1.30.1在同源性達(dá)97%上進(jìn)行群落多樣性指數(shù)分析，nosZ基因數(shù)量采用Excel軟件作圖，R語(yǔ)言繪制曲線與相關(guān)熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理下土壤基本理化性質(zhì)

稻蝦共作處理顯著影響了部分土壤基本理化性質(zhì)（表1）。方差分析結(jié)果表明，除土壤堿解氮含量、pH值、銨態(tài)氮含量及碳氮比（C/N）無(wú)顯著變化外，稻蝦共作顯著增加了土壤硝態(tài)氮、全碳、全氮的含量。相比常規(guī)中稻種植模式，硝態(tài)氮含量提升了29.03%，全碳含量增加了2.37%，全氮含量提升了4.30%，對(duì)土壤pH值、堿解氮含量、銨態(tài)氮含量及C/N無(wú)顯著影響。

2.2 測(cè)序結(jié)果及多樣性指數(shù)

采用Miseq技術(shù)對(duì)微生物nosZ基因進(jìn)行測(cè)序分析，數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)優(yōu)化篩選后，6個(gè)樣品共測(cè)得原始序列218 108條，序列平均長(zhǎng)度為407.74 bp，共測(cè)得堿基88 937 543個(gè)， 所有樣品的序列長(zhǎng)度在218～552 bp之間（表2）。按97%的相似度對(duì)非重復(fù)序列進(jìn)行OTU分析，共得到344個(gè)OTUs。對(duì)各樣本序列采用隨機(jī)抽樣方法進(jìn)行抽樣，以抽到的序列數(shù)與它們對(duì)應(yīng)的物種多樣性指數(shù)，構(gòu)建稀釋曲線。由圖1可知，樣本覆蓋度（coverage）指數(shù)為0.998 2～0.999 2，稀釋性曲線均趨于平坦飽和，表明此測(cè)序深度獲得的序列數(shù)據(jù)量可以反映土壤樣品nosZ基因微生物信息。

對(duì)α多樣性指數(shù)進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果（表3）顯示，2個(gè)處理間多樣性指數(shù)差異不顯著（P<0.05）。MR處理的Ace指數(shù)、Chao指數(shù)、香濃（Shannon）指數(shù)、Sobs指數(shù)均高于CR處理，差異不顯著;MR處理的辛普森（Simpson）指數(shù)低于CR處理，差異不顯著。多樣性分析結(jié)果表明，稻蝦種養(yǎng)模式（CR）沒(méi)有顯著改變nosZ基因微生物群落豐富度及群落多樣性。

2.3 稻蝦種養(yǎng)對(duì)土壤nosZ基因豐度的影響

利用熒光定量技術(shù)對(duì)氧化亞氮還原酶nosZ基因進(jìn)行定量分析，結(jié)果（圖2）表明，CR處理nosZ基因豐度顯著高于MR處理。其中CR處理中nosZ基因豐度為1 g干土2.23×106拷貝數(shù)，MR處理中nosZ基因豐度為1 g干土1.51×106拷貝數(shù)，CR處理nosZ基因豐度是MR處理基因豐度的1.48倍。與常規(guī)中稻種植模式相比，稻蝦種養(yǎng)模式可以顯著提升稻田土壤nosZ基因豐度。

2.4 稻蝦種養(yǎng)對(duì)土壤中nosZ基因物種組成的影響

在水稻抽穗期，對(duì)CR處理和MR處理nosZ基因微生物進(jìn)行目、科、屬、種的物種分類學(xué)水平韋恩（Vern）分析，結(jié)果見圖3。在目和科水平上，CR處理和MR處理具有相同的10個(gè)目（圖3-a）和12個(gè)科（圖3-b），在目和科水平的群落組成上表現(xiàn)出極大的相似性;在屬水平上，CR處理和MR處理有17個(gè)相同的屬，MR處理獨(dú)有紅假單胞菌屬（圖3-c）;在種水平上，CR處理和MR處理有19個(gè)相同的種，MR處理獨(dú)有沼澤紅假單胞菌（圖3-d）。分析表明，在科水平以上，稻蝦種養(yǎng)模式（CR）nosZ基因微生物群落組成與常規(guī)稻田表現(xiàn)出極大的相似性，在屬和種水平上，2個(gè)處理之間的微生物群落組成存在差異，稻蝦種養(yǎng)模式（CR）缺失紅假單胞菌屬下的沼澤紅假單胞菌。

2.5 稻蝦種養(yǎng)模式對(duì)nosZ基因物種目水平相對(duì)豐度的影響

樣品獲得的nosZ基因微生物物種分類在2個(gè)域、2個(gè)界、4個(gè)門、6個(gè)綱、10個(gè)目、12個(gè)科、18個(gè)屬和20個(gè)種。將無(wú)法分類的序列定義為無(wú)法歸類，樣品獲得的nosZ基因OTUs在分類學(xué)界、門、綱、目、科、屬、種水平上可歸類比例為 95.0%、95.0%、90.0%、85.0%、75.0%、50.0%、35.0%。

在目水平上，未分類c_β-變形菌目、未分類_p_變形菌目、嗜氫菌目、紅環(huán)菌目、未分類_k_norank d_細(xì)菌目、根瘤菌目是2個(gè)處理平均相對(duì)豐度同時(shí)大于1%的6個(gè)優(yōu)勢(shì)菌目（圖4），CR處理3次重復(fù)平均相對(duì)豐度分別為52.45%、29.49%、6.72%、5.57%、2.91%、1.82%;MR處理3次重復(fù)平均相對(duì)豐度分別為58.43%、15.57%、8.85%、9.77%、2.98%、2.40%。對(duì)nosZ目水平上相對(duì)豐度大于>0.1%的群落物種進(jìn)行顯著性分析，結(jié)果（表4）顯示，紅環(huán)菌目在CR處理中的相對(duì)豐度顯著低于MR處理（P<0.05），norank_p_environmental_samples在CR處理中的相對(duì)豐度顯著高于MR處理（P<0.05）。稻蝦種養(yǎng)模式顯著降低了紅環(huán)菌目的相對(duì)豐度，增加了norank_p_environmental_samples的相對(duì)豐度，改變了nosZ基因微生物目水平相對(duì)豐度的組成。

2.6 nosZ型反硝化細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與土壤理化性質(zhì)的相關(guān)性

對(duì)97%相似水平上的OTU代表序列進(jìn)行決策曲線分析法（decision curve analysis，簡(jiǎn)稱DCA）進(jìn)行分析，看分析結(jié)果中l(wèi)engths of gradient 的第一軸的大小，如果大于4.0，就應(yīng)該選典型關(guān)聯(lián)分析（canonical correlation analysis，簡(jiǎn)稱CCA），如果介于3.0～4.0之間，選RDA和CCA分析均可，如果小于3.0，RDA分析優(yōu)于CCA分析。分析結(jié)果中l(wèi)engths of gradient第一軸的大小為0.553，因此選用RDA分析環(huán)境因子、樣本、菌群三者間的關(guān)系。

對(duì)nosZ群落結(jié)構(gòu)與土壤理化性質(zhì)進(jìn)行冗余分析，結(jié)果（圖5）表明，2個(gè)排序軸共解釋了98.35%的變化，第一排序軸（RDA1）解釋了95.56%的群落變化，第二排序軸（RDA2）解釋了2.79%的變化。第一排序軸與土壤全碳（TC）含量、pH值、硝態(tài)氮（NO3--N）含量的關(guān)系最為密切，第二排序軸與土壤堿解氮（AN）含量的關(guān)系最為密切?？傮w而言，土壤全碳（TC）含量對(duì)群落結(jié)構(gòu)的影響最為顯著（R2=0.482 8），影響順序依次是土壤總碳含量>pH值>堿解氮含量>硝態(tài)氮含量>銨態(tài)氮含量。沿第一排序軸看，稻蝦種養(yǎng)的3個(gè)樣本全部分布在常規(guī)中稻處理左側(cè)，其中CR2、CR3分別與常規(guī)中稻的MR1、MR2、MR3樣本距離較近，而CR1處理與其他樣本距離較遠(yuǎn)。表明2個(gè)處理群落結(jié)構(gòu)存在差異，但稻蝦種養(yǎng)模式與常規(guī)稻田模式在群落結(jié)構(gòu)上仍保留著一定的相似性，土壤總碳含量是影響2種模式群落結(jié)構(gòu)的主效因子。

3 討論與結(jié)論

佀國(guó)涵等研究表明，長(zhǎng)期稻蝦輪作顯著提高水稻土0～40 cm 耕層有機(jī)碳、全鉀、堿解氮含量，0～30 cm耕層的土壤全氮含量及0～10 cm土壤速效鉀、全磷含量在稻蝦輪作下也顯著提高，該模式可改善土壤結(jié)構(gòu)增加土壤養(yǎng)分[19]。金乃康研究結(jié)果顯示，稻蝦種養(yǎng)模式下蝦子的糞便可增強(qiáng)土壤肥力，減少化肥使用量，在降低生產(chǎn)投入的情況下又可提高農(nóng)田利用效率與經(jīng)濟(jì)效益[20]。本研究的結(jié)果與前人研究基本一致，與常規(guī)中稻種植模式相比，稻蝦輪作模式顯著提高了土壤全氮、全碳、硝態(tài)氮含量。目前，稻蝦稻田種養(yǎng)復(fù)合模式的研究多數(shù)集中在土壤物理化學(xué)性質(zhì)、稻蝦田溫室氣體以及稻蝦種養(yǎng)技術(shù)等方面，對(duì)于稻蝦土壤反硝化微生物方面的研究較少。研究結(jié)果表明，稻田養(yǎng)蝦對(duì)nosZ基因微生物群落豐富度及群落多樣性的影響均不顯著。稻蝦種養(yǎng)模式與常規(guī)中稻種植模式nosZ基因微生物群落結(jié)構(gòu)存在差異，但二者在群落結(jié)構(gòu)上仍保留著一定的相似性。該結(jié)果與之前的研究發(fā)現(xiàn)一致，在不同的土地利用方式、不同環(huán)境條件下，nosZ基因的微生物群落組成變化不大，nosZ基因微生物群落在土壤中相對(duì)比較穩(wěn)定，受到環(huán)境條件影響的變化不大[21-22]。在中稻抽穗期，稻蝦種養(yǎng)模式nosZ基因豐度是常規(guī)中稻種植模式的1.48倍，顯著提升了稻田土壤中nosZ基因的豐度。稻蝦種養(yǎng)模式顯著提升了土壤中硝態(tài)氮含量，而NO3--N是反硝化反應(yīng)第1步硝酸還原反應(yīng)的底物，反應(yīng)生成的N2O是nosZ基因編碼的N2O還原酶的原料，能夠促進(jìn)nosZ的增長(zhǎng)。所以，硝態(tài)氮間接地為nosZ基因微生物提供了原料，促進(jìn)了nosZ基因豐度的增加[9]。沼澤紅假單胞菌是一種菌體富含蛋白質(zhì)、維生素、類胡蘿卜素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，被廣泛應(yīng)用于漁業(yè)的光合細(xì)菌，作為飼料添加劑可以有效地提高飼料效率，促進(jìn)魚蝦生長(zhǎng)[23]。沼澤紅假單胞菌和紅螺菌同屬紅螺菌科，二者生存條件相似，均是在光照和厭氧條件下適宜生長(zhǎng)[24]。稻蝦種養(yǎng)模式缺失沼澤紅假單胞菌可能與缺失紅螺菌的原因相似，一方面是抽穗期株高較高，遮光效應(yīng)不利于沼澤紅假單胞菌的生長(zhǎng);另一方面可能在淺水狀態(tài)下，克氏螯蝦的擾動(dòng)帶入了水體氧氣，打破了厭氧環(huán)境，不利于沼澤紅假單胞菌的生長(zhǎng)[25]。Miller等在研究短期內(nèi)（72 h）碳源對(duì)小麥反硝化基因豐度的影響發(fā)現(xiàn)，碳含量較高是氮施入可以提高反硝化微生物豐度的前提[26]。自然界中多種環(huán)境因素，如土壤pH值[27]、土壤含氧量[28-29]、土壤溫度[30]、土壤含水量[31]、土壤中的養(yǎng)分供應(yīng)狀況[32]以及植物種類[33-34]等均能夠影響反硝化細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)。續(xù)勇波等認(rèn)為，凡是能促進(jìn)土壤碳、氮積累和厭氧微生物活性的土地利用方式和耕作管理措施均會(huì)促進(jìn)反硝化作用進(jìn)行，可見碳、氮是影響反硝化活性的主要因子[35]。本研究結(jié)果顯示，土壤總碳是影響2種模式nosZ基因微生物群落結(jié)構(gòu)的主效因子，與前人的研究結(jié)果基本一致。此外，由于稻蝦田土壤的環(huán)境較為復(fù)雜，須經(jīng)歷干濕交替階段，且受水稻植株根系分泌物的影響，因此對(duì)于稻蝦土壤反硝化細(xì)菌群落的研究也就更為復(fù)雜，須要更加深入系統(tǒng)的研究。

本研究結(jié)論如下：（1）相比常規(guī)中稻種植模式，稻蝦共作顯著增加了水稻土壤硝態(tài)氮、全碳、全氮含量，對(duì)土壤pH值、堿解氮含量及土壤碳氮比無(wú)顯著影響。（2）本研究借助熒光定量PCR對(duì)常規(guī)中稻種植模式與稻蝦共作模式下的土壤反硝化細(xì)菌nosZ基因數(shù)量進(jìn)行研究，結(jié)果表明，稻蝦共作模式中nosZ基因豐度顯著高于常規(guī)中稻種植模式。（3）與常規(guī)中稻種植模式相比，稻蝦種養(yǎng)模式?jīng)]有顯著改變nosZ基因微生物群落豐富度及群落多樣性。在目和科水平以上，稻蝦種養(yǎng)模式nosZ基因微生物群落組成與常規(guī)稻田表現(xiàn)出極大的相似性;在屬和種水平，2個(gè)處理微生物群落組成存在差異，稻蝦種養(yǎng)模式缺失紅假單胞菌屬下的沼澤紅假單胞菌。2種種植模式群落結(jié)構(gòu)存在差異，但稻蝦種養(yǎng)模式與常規(guī)稻田種植模式在群落結(jié)構(gòu)上仍保留著一定的相似性。與常規(guī)中稻種植模式相比，稻蝦種養(yǎng)模式顯著降低了紅環(huán)菌目的相對(duì)豐度，改變了nosZ基因微生物目水平相對(duì)豐度的組成。此外，土壤pH值、堿解氮含量、硝態(tài)氮含量、銨態(tài)氮含量與群落結(jié)構(gòu)存在顯著相關(guān)關(guān)系，而土壤總碳含量是影響2種模式nosZ基因微生物群落結(jié)構(gòu)的主效因子。

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