PMA在副溶血性弧菌檢測(cè)中的應(yīng)用

陳光哲　曾德新　周昊　謝青軒　沈嘉敏

摘要：在我國(guó)，副溶血性弧菌被認(rèn)為是海產(chǎn)品衍生疾病的主要因素，因此急需一種能快速、靈敏、特異、準(zhǔn)確地檢測(cè)食品中副溶血性弧菌的方法。傳統(tǒng)培養(yǎng)法一直是檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，但是其檢測(cè)周期較長(zhǎng);分子生物學(xué)方法如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）已被廣泛用于食品中副溶血性弧菌的檢測(cè)，但是這些方法不能區(qū)分死菌和活菌的DNA，容易造成假陽性。而疊氮溴化丙錠（propidium monoazide，簡(jiǎn)稱PMA）等核酸染料的使用可以有效地消除這一弊端。研究者們將PMA處理與PCR（qPCR）結(jié)合，應(yīng)用于食品中多種食源性致病菌活菌的檢測(cè)，但是關(guān)于PMA在副溶血性弧菌檢測(cè)中應(yīng)用的報(bào)道并不多見。因此，擬對(duì)PMA應(yīng)用于食品中副溶血性弧菌檢測(cè)的可行性進(jìn)行分析，以便為進(jìn)一步開展相關(guān)研究提供參考。

關(guān)鍵詞：副溶血性弧菌;活菌檢測(cè);食源性病原菌;疊氮溴化丙錠（PMA）

中圖分類號(hào)： TS207.4? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號(hào)：1002-1302（2019）04-0162-06

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus，簡(jiǎn)稱VP）是導(dǎo)致胃腸道感染的主要致病菌，廣泛存在于海水、沉積物和各類海鮮（包括牡蠣、蛤蜊、扇貝、章魚、蝦、蟹、龍蝦、克氏原螯蝦和眾多魚類）中[1]。VP感染可引起腹瀉、嘔吐、腹部痙攣，在少數(shù)情況下可引起發(fā)燒[2]，但并不是所有的副溶血性弧菌都具有致病性。該菌的致病性與耐熱直接溶血素（TDH）和耐熱相關(guān)溶血素（TRH）相關(guān)，分別由tdh、trh基因編碼[3-5]。此外，VP的主要毒力因子還有不耐熱溶血毒素（TLH）。研究表明，TLH是一種非典型的磷脂酶，能溶解人和馬的紅細(xì)胞，具有副溶血性弧菌種屬的特異性。TDH能在我妻氏血平板上引起β-溶血（神奈川現(xiàn)象），具有致死毒性、心臟毒性、細(xì)胞毒性和腸毒素作用;TRH雖然不能引起神奈川現(xiàn)象，但其與TDH有相似的免疫原性和67%的相同氨基酸序列，并同樣具有致死作用和細(xì)胞毒性。我國(guó)食源性疾病監(jiān)測(cè)網(wǎng)站相關(guān)工作人員調(diào)查了其監(jiān)測(cè)地區(qū)（16個(gè)?。?4年間的8 000多起食物中毒案例，發(fā)現(xiàn)微生物性病原仍然是我國(guó)食源性疾病的主要病因（占30%～40%）。近10年來，由交叉污染導(dǎo)致肉類食品或水產(chǎn)品（包括淡水魚污染）而引起的副溶血性弧菌食物中毒已取代沙門氏菌，躍居第1位[6]。因此，迫切需求一種快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、實(shí)用的檢測(cè)方法對(duì)副溶血性弧菌進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控。

用傳統(tǒng)培養(yǎng)法檢測(cè)食品中的副溶血性弧菌一般需要經(jīng)歷增菌、選擇性平板培養(yǎng)、生化鑒定等過程，檢測(cè)周期長(zhǎng)達(dá)5～7 d。而對(duì)副溶血性弧菌的定量檢測(cè)，在對(duì)樣品中的病原菌做定量分析后還需要對(duì)可疑菌落做定性驗(yàn)證，使得檢測(cè)周期更長(zhǎng)[7-10]。分子生物學(xué)方法，如實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）具有快速、檢測(cè)靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，但是這類檢測(cè)技術(shù)無法區(qū)分死菌和活菌，因?yàn)榧?xì)菌DNA在菌體死亡后還能留存幾天到幾周。因此，使用該檢測(cè)技術(shù)用于副溶血性弧菌的定性檢測(cè)可能導(dǎo)致假陽性，若用于定量檢測(cè)則無法得到準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)[11-12]。? 疊氮溴化丙錠（PMA）是一種核酸染料，可用于PCR（qPCR），有效排除死菌DNA的干擾，達(dá)到特異性檢測(cè)活菌的效果[12]。目前，眾多學(xué)者已將PMA處理同qPCR結(jié)合應(yīng)用于各種活菌檢測(cè)，包括單增李斯特桿菌[13]、大腸桿菌 O157 ∶ H7[14]、彎曲菌[15]、金黃色葡萄球菌[16]、沙門氏菌[17]等。然而，將上述方法用于副溶血性弧菌檢測(cè)的研究尚不多見。因此，本研究?jī)H探討PMA在副溶血性弧菌檢測(cè)中應(yīng)用的必要性和可行性，以期為副溶血性弧菌快速檢測(cè)技術(shù)的研究提供新的思路。

1 副溶血性弧菌檢測(cè)技術(shù)概述

1.1 傳統(tǒng)培養(yǎng)法

GB 4789.7—2013《食品衛(wèi)生學(xué)檢驗(yàn) 副溶血性弧菌檢驗(yàn)》中闡述了對(duì)副溶血性弧菌檢測(cè)的傳統(tǒng)培養(yǎng)方法。該方法包括增菌培養(yǎng)、選擇性平板培養(yǎng)、生化鑒定、血清學(xué)反應(yīng)等過程，整個(gè)過程耗時(shí)5～7 d。傳統(tǒng)培養(yǎng)法可以得到活的病原菌，為檢測(cè)結(jié)果的判定提供了切實(shí)有力的證據(jù)，一直是食品檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)。但是其耗時(shí)長(zhǎng)，操作繁瑣，給實(shí)際檢測(cè)工作造成了諸多不便;在市場(chǎng)經(jīng)濟(jì)高速發(fā)展的今天，超長(zhǎng)的檢測(cè)周期也影響了食品貿(mào)易的發(fā)展;而傳統(tǒng)培養(yǎng)法對(duì)檢測(cè)人員的要求也相對(duì)較高，可疑菌落的挑選決定了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度，在實(shí)際檢測(cè)中容易出現(xiàn)人為因素而導(dǎo)致的假陽性或假陰性。

1.2 分子生物學(xué)檢測(cè)法

應(yīng)用于副溶血性弧菌檢測(cè)的分子生物學(xué)檢測(cè)方法主要包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）、變性高效液相色譜檢測(cè)技術(shù)（DHPLC）、基因芯片技術(shù)等。PCR技術(shù)有操作簡(jiǎn)單、成本低、用時(shí)短等特點(diǎn)，已被廣泛用于副溶血性弧菌的檢測(cè)[6]，但在靈敏度和多基因檢測(cè)方面有一定的局限性。除普通PCR外，多重PCR（MPCR）和巢式PCR也被廣泛應(yīng)用于副溶血性弧菌的檢測(cè)中，它們?cè)谝欢ǔ潭壬蟽?yōu)化了普通PCR，在縮短檢測(cè)時(shí)間的同時(shí)可增強(qiáng)PCR的靈敏度和特異性。qPCR是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，通過檢測(cè)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中產(chǎn)生的熒光信號(hào)來實(shí)現(xiàn)對(duì)VP的定性或定量檢測(cè)。與PCR相比，qPCR不需要電泳確認(rèn)，大大提高了檢測(cè)效率，同時(shí)該方法在靈敏度、特異性、重復(fù)性等方面也更具有優(yōu)勢(shì)。qPCR可分為染料法和探針法，其中探針法通過探針可以增強(qiáng)反應(yīng)收集信號(hào)的特異性，只有探針結(jié)合的片段上發(fā)生擴(kuò)增才能收集到信號(hào)，能夠用多重體系反應(yīng)的方法，能夠預(yù)測(cè)和提前進(jìn)行反應(yīng)條件的優(yōu)化，缺點(diǎn)是要合成探針，成本高;染料法經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，可以作溶解曲線，分析全部PCR產(chǎn)物的Tm值，缺點(diǎn)就是特異性相對(duì)于探針法較差。LAMP是在PCR的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，相比于PCR方法，其操作流程更為簡(jiǎn)單，靈敏度更高，整個(gè)檢測(cè)過程僅需15～30 min，且結(jié)果也不需要電泳等途徑判定，憑肉眼觀察顏色即可[18]。但是其顏色也經(jīng)常介于陽性和陰性之間，會(huì)導(dǎo)致假陽性、假陰性或無法判斷[19]。DHPLC常用于分子分型和流行病學(xué)研究，但也可用于致病菌的檢測(cè)。Zhan等利用PCR-DHPLC技術(shù)建立副溶血性弧菌特異基因檢測(cè)平臺(tái)，可以通過洗脫峰快速判斷結(jié)果[20]。該方法能有效避免PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)的后污染，也使檢測(cè)成本明顯降低，具有簡(jiǎn)便快捷、高通量和自動(dòng)化的特點(diǎn)，且其準(zhǔn)確性和靈敏度高，重復(fù)性好，特別適用于大樣本量的快速檢測(cè)。除了上述檢測(cè)手段外，基因芯片技術(shù)也被應(yīng)用于副溶血性弧菌的檢測(cè)中?；蛐酒梢酝瑫r(shí)高通量檢測(cè)多株副溶血性弧菌的多個(gè)基因及基因表達(dá)、SNP突變和缺失，具有很好的特異性和檢測(cè)靈敏度，適用于副溶血性弧菌的系統(tǒng)化研究。目前，已有商品化的副溶血性弧菌基因芯片出售。但是基因芯片成本過高，需要特殊的設(shè)備，且檢測(cè)流程復(fù)雜，并未得到廣泛使用。

1.3 免疫學(xué)檢測(cè)

目前，免疫學(xué)檢測(cè)手段也被廣泛應(yīng)用于副溶血性弧菌的檢測(cè)，免疫學(xué)檢測(cè)主要是利用抗原-抗體特異性結(jié)合的方法鑒別病原菌，具有特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)短等優(yōu)點(diǎn)。目前常見的用于副溶血性弧菌檢測(cè)的免疫學(xué)手段有酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)（ELISA）、免疫膠體金技術(shù)和生物傳感器技術(shù)。Zhong等基于IgY建立了用于VP檢測(cè)的夾心ELISA法，該方法的檢測(cè)靈敏度達(dá)到2.5萬CFU/mL，耗時(shí)僅4 h[21];王報(bào)貴等研制了用于VP檢測(cè)的膠體金試紙條，其檢測(cè)靈敏度為 106 CFU/mL[22];孔繁德等研發(fā)的VP膠體金試紙條的檢測(cè)靈敏度可以達(dá)到3.592萬CFU/mL[23]。目前，用于VP檢測(cè)的商品化ELISA試劑盒及膠體金試紙條已被廣泛用于檢測(cè)機(jī)構(gòu)中，與分子生物學(xué)方法相比，它們耗時(shí)更短，操作更加簡(jiǎn)單方便，但是其檢測(cè)靈敏度卻相對(duì)偏低。

除了上述常用的方法外，生物傳感器技術(shù)[24]、上轉(zhuǎn)換發(fā)光免疫層析技術(shù)也可用于副溶血性弧菌的檢測(cè)[25]，通過與分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)或免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)結(jié)合，可進(jìn)一步優(yōu)化副溶血性弧菌的檢測(cè)方法，可以在提高檢測(cè)靈敏度、增強(qiáng)穩(wěn)定性等方面發(fā)揮積極作用。

然而，值得注意的是，除了傳統(tǒng)培養(yǎng)法外，上述檢測(cè)方法均不能鑒別活菌和死菌。受死菌的干擾，分子生物學(xué)檢測(cè)法和免疫學(xué)檢測(cè)法容易產(chǎn)生假陽性而導(dǎo)致誤判，特別是在定量檢測(cè)中更無法提供真實(shí)的檢測(cè)數(shù)據(jù)。

2 活菌檢測(cè)技術(shù)

有效檢測(cè)食品中的VP活菌是評(píng)估食品潛在危害并及時(shí)做好防控措施的關(guān)鍵和必要條件。除了傳統(tǒng)培養(yǎng)法，有2種方法可以快速檢測(cè)食品中的活菌。第1種是通過反轉(zhuǎn)錄（q）PCR檢測(cè)mRNA的方法[26-27]。有研究表明，由于細(xì)菌的轉(zhuǎn)錄過程對(duì)細(xì)胞內(nèi)外的RNA酶特別敏感，細(xì)菌的mRNA含量會(huì)在細(xì)菌死亡后急劇下降，因此mRNA的檢測(cè)不同于基于DNA的檢測(cè)，mRNA僅可在活的且有活力的細(xì)胞中被檢測(cè)到?；谶@一理論，反轉(zhuǎn)錄定量PCR（RT-PCR）已被應(yīng)用于多種食源性致病菌的檢測(cè)，包括腸出血性大腸桿菌、單增李斯特桿菌、沙門氏菌、弧菌屬及彎曲菌屬等[28-36]。然而，這種檢測(cè)方法需要表達(dá)目的基因，而基因的表達(dá)在外界影響下易發(fā)生改變。此外，RNA在復(fù)雜的食品基質(zhì)中容易降解?？偟膩碚f，使用反轉(zhuǎn)錄PCR（qPCR）技術(shù)更適合基因表達(dá)研究，而不適合用于食源性病原菌檢測(cè)系統(tǒng)[37]。還有些研究指出，mRNA會(huì)在細(xì)胞死亡后快速消失[26]，而其他研究者則表示，轉(zhuǎn)錄過程在細(xì)胞死亡后還會(huì)持續(xù)較長(zhǎng)一段時(shí)間[38-39]。第2種檢測(cè)技術(shù)可稱為活性PCR（V-PCR）或活性qPCR（V-qPCR），這種方法依賴于對(duì)完整細(xì)胞膜內(nèi)DNA的檢測(cè)。V-（q）PCR技術(shù)，分為活性鑒別和（q）PCR擴(kuò)增2個(gè)步驟。目前有2種物質(zhì)常被用于活性鑒別階段，即疊氮溴化乙錠（edthidium monoazide，簡(jiǎn)稱EMA）和疊氮溴化丙錠（propidium monoazide，簡(jiǎn)稱PMA），它們是2種對(duì)DNA具有高度親和力的光敏DNA染料，會(huì)被完整的細(xì)菌細(xì)胞壁排斥，但是能進(jìn)入受損的細(xì)胞壁或細(xì)胞膜[40]。進(jìn)入細(xì)胞后，當(dāng)暴露在強(qiáng)光下時(shí)，由于有疊氮基團(tuán)的存在，上述2種分子染料能與DNA偶聯(lián)。強(qiáng)光的作用會(huì)形成高活性氮自由基，該自由基團(tuán)能與其附近包括DNA在內(nèi)的任何有機(jī)分子結(jié)合生成穩(wěn)定的共價(jià)氮碳鍵，經(jīng)過上述核酸染料修飾的DNA將無法進(jìn)行后續(xù)PCR擴(kuò)增。當(dāng)EMA/PMA等核酸染料在強(qiáng)光作用下與DNA偶聯(lián)結(jié)合的同時(shí)，強(qiáng)光也會(huì)促使多余的核酸染料與水分子結(jié)合而生成不具有活性的羥胺（hydroxylamine），因此，完整細(xì)胞內(nèi)的DNA在此過程中不會(huì)受到核酸染料的影響[41]。經(jīng)過核酸染料處理后，后續(xù)的PCR（qPCR）能特異地?cái)U(kuò)增細(xì)胞膜完整的即活菌內(nèi)的DNA，實(shí)現(xiàn)有效鑒別活菌的目的（圖1）。與mRNA檢測(cè)相比，V-（q）PCR更穩(wěn)定，可操作性更強(qiáng)，受到眾多學(xué)者的認(rèn)可[42-46]。

3 PMA與EMA的比較

PMA、EMA具有幾乎相同的排除死菌DNA干擾的功能，但是它們?cè)诖┩讣?xì)胞膜方面有差異。有研究指出，由于化學(xué)成分的差異，EMA在信號(hào)抑制方面的作用優(yōu)于PMA，而PMA在鑒別死菌-活菌方面的能力要強(qiáng)于EMA[46]。Nocker等指出，PMA的膜穿透力比EMA差，可能與它們攜帶的電荷數(shù)量有關(guān)，他們用4種革蘭氏陽性菌和4種革蘭氏陰性菌比較EMA和PMA的穿透能力，結(jié)果表明，EMA對(duì)細(xì)胞膜的穿透能力比PMA強(qiáng)，但EMA對(duì)活菌DNA具有一定的破壞性[40]。Cawthorn等也指出，EMA對(duì)活菌DNA有損害，他們采用與嬰幼兒配方奶粉相關(guān)的阪崎腸桿菌作為研究對(duì)象，結(jié)果顯示，當(dāng)用100、50、10 μg/mL PMA處理阪崎桿菌活菌時(shí)，總DNA的回收率分別為95%、96%、97%，而用相同濃度的EMA處理時(shí)，總DNA的回收率則分別降低為74%、82%、92%，當(dāng)分別使用上述3種濃度的PMA或EMA作用于死菌（熱滅活）時(shí)，總DNA的回收率均為0%，從而充分證明了這2種核酸染料在排除死菌干擾方面的能力以及EMA的破壞力[47]。此外，有研究者指出，EMA在選擇性擴(kuò)增活菌DNA方面的能力不如PMA，作為繼EMA之后用于活菌檢測(cè)研究的核酸染料，PMA是一種有效的替代品，更受研究者青睞[48]。

4 PMA在副溶血性弧菌檢測(cè)中的應(yīng)用

將PMA處理同（q）PCR結(jié)合用于活菌檢測(cè)的技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于各種食源性致病菌，包括大腸桿菌O157 ∶ H7[49-51]、沙門氏菌[52-53]、金黃色葡萄球菌[11，45]、單增李斯特桿菌[11，54]、彎曲菌[15，55]等的檢測(cè)。然而，PMA在副溶血性弧菌活菌檢測(cè)中的應(yīng)用并不多見，僅有少數(shù)研究者作了相關(guān)報(bào)道。Zhu等將PMA與qPCR結(jié)合，用于檢測(cè)海鮮食品中副溶血性弧菌活菌，通過與傳統(tǒng)培養(yǎng)法和qRCR法比較，表明PMA-qPCR在副溶血性弧菌活菌檢測(cè)中更具有優(yōu)勢(shì)[42]。在該試驗(yàn)設(shè)計(jì)中，研究者使用了70株不同來源的副溶血性弧菌和120份樣品，充分證實(shí)了該方法的準(zhǔn)確性和可行性;同時(shí)研究者也指出，他們構(gòu)建的檢測(cè)體系也存在一定的缺陷，對(duì)于活菌的有效檢出，受到了菌液濃度的約束。

筆者所在實(shí)驗(yàn)室也對(duì)PMA在副溶血性弧菌活菌檢測(cè)中的應(yīng)用作了探索性研究，選擇tdh（GenBank登錄號(hào)：AY249144.1）作為目的基因，設(shè)計(jì)引物及探針如下：TDH-F：5′-TTGAGCTTCCATCTGTCCCTTTTCCTG-3′;TDH-R：5′-TGACCGGAGCTTGGGTATTA-3′;TDH-P：5′-FAM-TTGGCTGCATTCAAAACATC-TAMRA-3′。將60×106 CFU/mL菌液經(jīng)10倍梯度稀釋至6.0×100 CFU/mL，經(jīng)Real-Time PCR后，用CT值與菌液濃度構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，可獲得其檢測(cè)靈敏度達(dá)6 CFU/mL（圖2）。為了驗(yàn)證PMA的功效，設(shè)計(jì)4個(gè)試驗(yàn)組，分別為活菌（PMA處理）、死菌（PMA處理）、活菌（未用PMA處理）、死菌（未用PMA處理），其菌液濃度均為6.0×106 CFU/mL，其中死菌經(jīng)煮沸滅活得到。對(duì)于未用PMA處理組，將其菌液提取DNA（TIANGEN，TIANamp Bacteria DNA Kit，DP302）后用于Real-Time PCR擴(kuò)增[TaKaRa，Premix Ex Taq（probe qPCR），RR390A]，具體步驟嚴(yán)格按操作說明書執(zhí)行。對(duì)于PMA處理組，菌液先經(jīng)PMA處理，流程如下：在 1 mL 菌液中加入PMA，使其終濃度為50 μmol/L，充分振蕩混勻，于暗處?kù)o置5 min，將菌液置于距650 W鹵素?zé)?0 cm處，強(qiáng)光照射2 min，促使PMA與DNA交聯(lián)[49]。此后菌液同未處理組一樣，經(jīng)DNA提取純化后用Real-Time PCR擴(kuò)增，結(jié)果見圖3?？梢钥闯?，PMA處理能有效鑒別副溶血性弧菌死菌和活菌，當(dāng)菌液濃度高達(dá)6.0×106 CFU/mL 時(shí)能充分抑制死菌DNA的PCR擴(kuò)增，而對(duì)活菌無影響。

顯然，將PMA與（q）PCR結(jié)合，對(duì)于實(shí)現(xiàn)副溶血性弧菌活菌的快速檢測(cè)是切實(shí)可行的。鑒于食品中有害副溶血性弧菌檢測(cè)及副溶血性弧菌定量檢測(cè)的要求，將PMA應(yīng)用于副溶血性弧菌的快速檢測(cè)具有很好的應(yīng)用前景，針對(duì)不同食品基質(zhì)中副溶血性弧菌的檢測(cè)也有待于學(xué)者們的進(jìn)一步研究。

5 結(jié)論

副溶血性弧菌常見于水產(chǎn)品中[56-57]，用傳統(tǒng)的培養(yǎng)法對(duì)食品中的副溶血性弧菌進(jìn)行檢測(cè)一般需要4～5 d，涉及到定量檢測(cè)則需要7 d，其檢測(cè)流程復(fù)雜，對(duì)檢測(cè)人員要求較高，在可疑菌落挑選方面容易造成人為因素的假陽性或假陰性，此外，5～7 d 的檢測(cè)周期，會(huì)極大影響水產(chǎn)品的品質(zhì)，增加水產(chǎn)品的貿(mào)易成本，造成經(jīng)濟(jì)損失。鑒于傳統(tǒng)培養(yǎng)法的弊端，迫切需要一種快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)的食品中副溶血性弧菌的檢測(cè)方法。分子生物學(xué)方法如PCR、qPCR及LAMP具有檢測(cè)靈敏度高、特異性強(qiáng)和耗時(shí)短等優(yōu)點(diǎn)，但是上述方法均不能區(qū)分活菌和死菌，用于食品中副溶血性弧菌的檢測(cè)容易導(dǎo)致假陽性的結(jié)果。為了解決特異性檢測(cè)活菌的難題，有研究者使用了反轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)mRNA的方法，然而由于mRNA提取難度大且易降解，該方法并未廣泛使用。此外也有學(xué)者研究表明，mRNA并不能代表活細(xì)胞，他們指出，RNA的轉(zhuǎn)錄在細(xì)胞死亡后的一段時(shí)間仍會(huì)進(jìn)行。EMA/PMA等核酸染料也被應(yīng)用到食品中活菌的檢測(cè)，并得到了眾多學(xué)者的認(rèn)可。近期，研究者們對(duì)將EMA/PMA與PCR、qPCR或LAMP等技術(shù)結(jié)合用于食品中活菌的檢測(cè)做了廣泛研究，該方法不僅被應(yīng)用于活菌的定性檢測(cè)，也被應(yīng)用于活菌的定量檢測(cè)，不僅適用于單一菌種的檢測(cè)，也適用于多種致病菌的混合檢測(cè)，不僅被應(yīng)用于純培養(yǎng)物的檢測(cè)，也被應(yīng)用到各種食品基質(zhì)的檢測(cè)。總的來說，這是一種檢測(cè)食品中活菌切實(shí)有效的手段。值得注意的是，眾多學(xué)者對(duì)EMA/PMA在E.coli O157 ∶ H7、沙門氏菌（Salmonella）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）等食源性致病菌活菌檢測(cè)中的應(yīng)用做了研究和報(bào)道，而對(duì)于副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）僅有少數(shù)報(bào)道，急需廣大學(xué)者進(jìn)一步探索。

PMA-qPCR是目前使用較多的一種方法，具有快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高和定量檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn);PCR同生物染料結(jié)合也有較高的檢測(cè)靈敏度，雖然不及qPCR，但是該方法可以設(shè)計(jì)大片段的目的條帶，可以避免紫外線（UV）滅活或其他原因造成的假陽性或假陰性結(jié)果;EMA/PMA-LAMP法檢測(cè)靈敏度不及qPCR，但是其操作簡(jiǎn)單，適用于大量樣本的處理。

EMA和PMA同作為具有鑒別功能的核酸染料，對(duì)其優(yōu)越性的比較也受到了廣大學(xué)者的探討。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，EMA在抑制死菌DNA參與PCR擴(kuò)增的同時(shí)，也能穿透部分活菌的細(xì)胞膜并抑制其DNA擴(kuò)增，從而對(duì)實(shí)際檢測(cè)結(jié)果造成偏差。PMA比EMA更適合食品基質(zhì)中活菌的快速檢測(cè)。隨著核酸染料在活菌檢測(cè)技術(shù)中的成熟發(fā)展，EMA也逐步被PMA替代。食品中副溶血性弧菌活菌快速檢測(cè)技術(shù)的研究對(duì)PMA的選擇也無可置疑。當(dāng)然，也有學(xué)者指出，PMA存在缺陷：PMA處理時(shí)的強(qiáng)光照射會(huì)對(duì)菌體造成殺傷;當(dāng)PCR或qPCR的目的片段過短時(shí)，易造成PMA與目的片段結(jié)合疏漏，從而導(dǎo)致PMA對(duì)死菌DNA的抑制不完全;菌液濃度過高或特殊的成團(tuán)菌體形態(tài)會(huì)影響PMA的穿透力，從而影響PMA的處理效果[16，40，42，52，54，58-61]。但是這些缺點(diǎn)并非不能解決，對(duì)于強(qiáng)光引起的高溫殺傷，可以在PMA處理時(shí)用冰浴對(duì)菌液降溫;對(duì)于小目的片段的影響，可以設(shè)計(jì)特異性強(qiáng)的引物或設(shè)計(jì)巢式PCR;對(duì)于菌液濃度及特殊菌體形態(tài)的影響，可以通過稀釋及濾膜過濾分解成團(tuán)菌體。另外，對(duì)于濃度過低或復(fù)雜基質(zhì)的情況，可以通過磁珠富集優(yōu)化。此外，對(duì)于部分革蘭氏陽性菌細(xì)胞膜成分復(fù)雜的情況，可以用sodium lauroyl sarcosinate（月桂基巰基乙酸）來增強(qiáng)PMA對(duì)死菌細(xì)胞膜的通透性。也有學(xué)者針對(duì)PMA處理工藝進(jìn)行研究，他們研發(fā)的微流體裝置能簡(jiǎn)單、快速地完成PMA標(biāo)記[62]，為PMA用于食品病原性活菌的快速檢測(cè)提供了新的動(dòng)力。總之，PMA在食品中副溶血性弧菌快速檢測(cè)中的應(yīng)用是切實(shí)可行的，也應(yīng)受到廣泛關(guān)注，豐富的水產(chǎn)品種類、不同的水質(zhì)環(huán)境、定性或定量的不同要求以及上述PMA存在的弊端，都有待于廣大學(xué)者的進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]Shen X S，Cai Y Q，Liu C C，et al. Effect of temperature on uptake and survival of Vibrio parahaemolyticus in oysters （Crassostrea plicatula）[J]. International Journal of Food Microbiology，2009，136（1）：129-132.

[2]Lin Y T，Labbe R G，Shetty K. Inhibition of Vibrio parahaemolyticus in seafood systems using oregano and cranberry phytochemical synergies and lactic acid[J]. Food Sci Emerg，2005，6（4）：453-458.

[3]Honda T，Iida T. The pathogenicity of Vibrio parahaemolyticus and the role of thermostable direct haemolysin and related haemolysins[J]. Rev Med Microbiol，1993，4（2）：106-113.

[4]Honda S，Goto I，Minematsu I，et al. Vibrio parahaemolyticus infectious disease caused by Kanagawa phenomenon-negative O3 ∶ K6 originated from Maldives[J]. Kansenshoqaku Zasshi，1987，61（9）：1070-1078.

[5]Honda S，Goto I，Minematsu I，et al. Gastroenteritis due to Kanagawa negative Vibrio parahaemolyticus[J]. The Lancet，1987，29（37）：331-332.

[6]郭 欽，陳 會(huì)，徐海堂，等. 副溶血弧菌快速檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 食品工業(yè)科技，2016，37（24）：395-400.

[7]Kim H J，Lee H J，Lee K H，et al. Simultaneous detection of pathogenic Vibrio species using multiplex real-time PCR[J]. Food Control，2012，23（2）：491-498.

[8]Garrido A，Chapela M J，Román B，et al. A new multiplex real-time PCR developed method for Salmonella spp. and Listeria monocytogenes detection in food and environmental samples[J]. Food Control，2013，30（1）：76-85.

[9]Ma K，Deng Y，Bai Y，et al. Rapid and simultaneous detection of Salmonella，Shigella，and Staphylococcus aureus in fresh pork using a multiplex real-time PCR assay based on immunomagnetic separation[J]. Food Control，2014，42：87-93.

[10]Zhang Z H，Xiao L L，Lou Y，et al. Development of a multiplex real-time PCR method for simultaneous detection of Vibrio parahaemolyticus，Listeria monocytogenes and Salmonella spp. in raw shrimp[J]. Food Control，2015，51：31-36.

[11]Martinon A，Cronin U P，Quealy J，et al. Swab sample preparation and viable real-time PCR methodologies for the recovery of Escherichia coli，Staphylococcus aureus or Listeria monocytogenes from artificially contaminated food processing surfaces[J]. Food Control，2012，24（1/2）：86-94.

[12]Nocker A，Sossa K E，Camper A K. Molecular monitoring of disinfection efficacy using propidium monoazide in combination with quantitative PCR[J]. Journal of Microbiological Methods，2007，70（2）：252-260.

[13]Pan Y，Breidt J . Enumeration of viable Listeria monocytogenes cells by real-time PCR with propidium monoazide and ethidium monoazide in the presence of dead cells[J]. Applied and Environmental Microbiology，2007，73（24）：8028-8031.

[14]Elizaquível P，Sánchez G，Selma M V，et al. Application of propidium monoazide-qPCR to evaluate the ultrasonic inactivation of Escherichia coli O157 ∶ H7 in fresh-cut vegetable wash water[J]. Food Microbiol，2012，30（1）：316-320.

[15]Josefsen M H，Lfstrm C，Hansen T B，et al. Rapid quantification of viable Campylobacter bacteria on chicken carcasses，using real-time PCR and propidium monoazide treatment，as a tool for quantitative risk assessment[J]. Applied and Environmental Microbiology，2010，76（15）：5097-5104.

[16]Martinon A，Cronin U P，Wilkinson M G. Development of defined microbial population standards using fluorescence activated cell sorting for the absolute quantification of S.aureus using real-time PCR[J]. Mol Biotechnol，2012，50（1）：62-71.

[17]Singh G，Vajpayee P，Bhatti S，et al. Determination of viable Salmonellae from potable and source water through PMA assisted qPCR[J]. Ecotoxicology and Environmental Safety，2013，93（1）：121-127.

[18]Letchumanan V，Chan K G，Lee L H. Vibrio parahaemolyticus：a review on the pathogenesis，prevalence，and advance molecular identification techniques[J]. Frontiers in Microbiology，2014，5（705）：1-13.

[19]Malcolm T T H，Cheah Y K，Radzi C W J W M，et al. Detection and quantification of pathogenic Vibrio parahaemolyticus in shellfish by using multiplex PCR and loop-mediated isothermal amplification assay[J]. Food Control，2015，47：664-671.

[20]Zhan X W，Zheng Q Y，F(xiàn)u J F，et al. A rapid multiplex PCR-DHPLC method of detection and identification of pathogenic bacteria in aquatic products[J]. Journal of Food Safety，2015，35（1）：50-58.

[21]Zhong Q P，Dong Y Q，Wang L，et al. Development of IgY-based sandwich enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of Vibrio parahaemolyticus[J]. Information Tech and Agricultural Eng，2012，134：517-524.

[22]王報(bào)貴，王廣峰，武曉麗，等. 副溶血弧菌膠體金檢測(cè)試紙條的改進(jìn)[J]. 食品工業(yè)科技，2014，34（10）：57-61，65.

[23]孔繁德，劉 陽，徐淑菲，等. 免疫金層析技術(shù)快速檢測(cè)副溶血弧菌方法的初步研究[J]. 中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)，2012，41（8）：819-824.

[24]Teng J，Ye Y W，Yao L，et al. Rolling circle amplification based amperometric aptamer/immuno hybrid biosensor for ultrasensitive detection of Vibrio parahaemolyticus[J]. Microchimica Acta，2017，184（9）：3477-3485.

[25]李春鳳，趙 勇，王曉英，等. 基于上轉(zhuǎn)發(fā)光免疫層析技術(shù)的常見食源性致病菌快速檢測(cè)方法研究與評(píng)價(jià)[J]. 軍事醫(yī)學(xué)，2015（2）：128-132.

[26]McIngvale S C，Elhanafi D，Drake M A. Optimization of reverse transcriptase PCR to detect viable Shiga-toxin-producing Escherichia coli[J]. Appl Environ Microbiol，2002，68（2）：799-806.

[27]Yaron S，Matthews K R. A reverse transcriptase-polymerase chain reaction assay for detection of viable Escherichia coli O157 ∶ H7：investigation of specific target genes[J]. Journal of Applied Microbiology，2002，92（4）：633-640.

[28]Klein P G，Juneja V K. Sensitive detection of viable Listeria monocytogenes by reverse transcription-PCR[J]. Appl Environ Microbiol，1997，63（11）：4441-4448.

[29]Sheridan G E，Masters C I，Shallcross J A，et al. Detection of mRNA by reverse transcription PCR as an indicator of viability in Escherichia coli cells[J]. Applied and Environmental Microbiology，1998，64（4）：1313-1318.

[30]Szabo E A，Mackey B M. Detection of salmonella enteritidis by reverse transcription-polymerase chain reaction （PCR）[J]. International Journal of Food Microbiology，1999，51（2/3）：113-122.

[31]de Wet S C，Denman S E，Sly L，et al. An improved method for RNA extraction from carcass samples for detection of viable Escherichia coli O157 ∶ H7 by reverse-transcriptase polymerase chain reaction[J]. Letters in Applied Microbiology，2008，47（5）：399-404.

[32]DSouza D H，Critzer F J，Golden D A. Real-timereverse-transcriptase polymerase chain reaction for the rapid detection of Salmonella using inv A primers[J]. Foodborne Pathog Dis，2009，6：1097-1106.

[33]Miller N D，Draughon F A，DSouza D H. Real-time reverse-transcriptase-polymerase chain reaction for Salmonella enterica detection from jalapeno and serrano peppers[J]. Foodborne Pathogens and Disease，2010，7（4）：367-373.

[34]Techathuvanan C，Draughon F A，D Souza D H. Real-time reverse transcriptase PCR for the rapid and sensitive detection of Salmonella typhimurium from pork[J]. Food Prot，2010，73（3）：507-514.

[35]Kurakawa T，Kubota H，Tsuji H，et al. Development of a sensitiver RNA-targeted reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction for detection of Vibrio cholerae/mimicus，V. parahaemolyticus/alginolyticus and Campylobacter jejuni/coli[J]. Microbiol Immunol，2012，56（1）：10-20.

[36]Zhou M，Yang J，Zhou X，et al. Development of a sigDE-based real-time reverse-transcriptase PCR for the detection of viable Salmonellae nterica[J]. Foodborne Pathog Dis，2014，11（7）：537-544.

[37]Postollec F，F(xiàn)alentin H，Pavan S A，et al. Recent advances in quantitative PCR （qPCR） applications in food microbiology[J]. Food Microbiology，2011，28（5）：848-861.

[38]Sung K，Hiett K L，Stern N J. Heat-treated Campylobacter and mRNA stability as determined by reverse transcriptase-polymerase chain reaction[J]. Foodborne Pathogens and Disease，2005，2（2）：130-137.

[39]Xiao L L，Zhang L，Wang H H. Critical issues in detecting viable Listeria monocytogenes cells by real-time reverse transcriptase PCR[J]. Journal of Food Protection，2012，75（3）：512-517.

[40]Nocker A，Cheung C Y，Camper A K. Comparison of propidium monoazide with ethidium monoazide for differentiation of live vs. dead bacteria by selective removal of DNA from dead cells[J]. Journal of Microbiological Methods，2006，67（2）：310-320.

[41]Zi C，Zeng D X，Ling N，et al. An improved assay for rapid detection of viable Staphylococcus aureus cells by incorporating surfactant and PMA treatments in qPCR[J]. BMC Microbiology，2018，18：132.

[42]Zhu R G，Li T P，Jia Y F，et al. Quantitative study of viable Vibrio parahaemolyticus cells in raw seafood using propidium monoazide in combination with quantitative PCR[J]. Journal of Microbiological Methods，2012，90（3）：262-266.

[43]Li H，Xin H，Li S F. Multiplex PMA-qPCR assay with internal amplification control for simultaneous detection of viable Legionella pneumophila，Salmonella typhimurium，and Staphylococcus aureus in environmental waters[J]. Environ Sci Technol，2015，49（24）：14249-14256.

[44]Wu G P，Chen S H，Levin R E. Application of ethidium bromide monoazide for quantification of viable and dead cells of Salmonella enterica by real-time loop-mediated isothermal amplification[J]. Journal of Microbiological Methods，2015，117：41-48.

[45]Zhang Z，Liu W，Xu H，et al. Propidium monoazide combined with real-time PCR for selective detection of viable Staphylococcus aureus in milk powder and meat products[J]. Journal of Dairy Science，2015，98（3）：1625-1633.

[46]Soejima T，Minami J I，Xiao J Z，et al. Innovative use of platinum compounds to selectively detect live microorganisms by polymerase chain reaction[J]. Biotechnology and Bioengineering，2016，113（2）：301-310.

[47]Cawthorn D M，Witthuhn R C. Selective PCR detection of viable Enterobacter sakazakii cells utilizing propidium monoazide or ethidium bromide monoazide[J]. Journal of Applied Microbiology，2008，105（4）：1178-1185.

[48]van Frankenhuyzen J K，Trevors J T，Lee H A，et al. Molecular pathogen detection in biosolids with a focus on quantitative PCR using propidium monoazide for viable cell enumeration[J]. Journal of Microbiological Methods，2011，87（3）：263-272.

[49]Li B，Chen J Q. Real-time PCR methodology for selective detection of viable Escherichia coli O157 ∶ H7 cells by targeting Z3276 as a genetic marker[J]. Appl Environ Microbiol，2012，78（15）：5297-5304.

[50]Liu Y R，Mustapha A. Detection of viable Escherichia coli O157 ∶ H7 in ground beef by propidium monoazide real-time PCR[J]. International Journal of Food Microbiology，2014，170：48-54.

[51]Dinu L D，Bach S. Detection of viable but non-culturable Escherichia coli O157 ∶ H7 from vegetable samples using quantitative PCR with propidium monoazide and immunological assays[J]. Food Control，2013，31（2）：268-273.

[52]Li B，Chen J Q. Development of a sensitive and specific qPCR assay in conjunction with propidium monoazide for enhanced detection of live Salmonella spp. in food[J]. BMC Microbiology，2013，13：273.

[53]Barbau-Piednoir E，Mahillon J，Pillyser J，et al. Evaluation of viability-qPCR detection system on viable and dead Salmonella serovar Enteritidis[J]. Microbiol Methods，2014，103：131-137.

[54]Elizaquível P，Sánchez G，Aznar R. Application of propidium monoazide quantitative PCR for selective detection of live Escherichia coli O157 ∶ H7 in vegetables after inactivation by essential oils[J]. International Journal of Food Microbiology，2012，159（2）：115-121.

[55]Banihashemi A，Van Dyke M I，Huck P M. Long-amplicon propidium monoazide-PCR enumeration assay to detect viable Campylobacter and Salmonella[J]. Appl Microbiol，2012，113（4）：863-873.

[56]康昌源，王慶奎，王靜波，等. 肉桂醛脂質(zhì)體對(duì)3種水產(chǎn)動(dòng)物致病菌抑菌效果比較[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2018，46（18）：176-178.

[57]呂孫建，劉 莉，曹 錚，等. 一株中華鱉氣單胞菌噬菌體的分離及功能鑒定[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2018，46（2）：108-111.

[58]Zhang Z H，Liu H Q，Lou Y，et al. Quantifying viable Vibrio parahaemolyticus and Listeria monocytogenes simultaneously in raw shrimp[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2015，99（15）：6451-6462.

[59]Luo J F，Lin W T，Guo Y. Method to detect only viable cells in microbial ecology[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2010，86（1）：377-384.

[60]Schnetzinger F，Pan Y，Nocker A. Use of propidium monoazide and increased amplicon length reduce false-positive signals in quantitative PCR for bioburden analysis[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2013，97（5）：2153-2162.

[61]Pacholewicz E，Swart A，Lipman L J，et al. Propidium monoazide does not fully inhibit the detection of dead Campylobacter on broiler chicken carcasses by qPCR[J]. Microbiol Methods，2013，95（1）：32-38.

[62]Duarte-Guevara P，Duarte-Guevara C，Ornob A A. On-chip PMA labeling of foodborne pathogenic bacteria for viable qPCR and qLAMP detection[J]. Microfluidics and Nanofluidics，2016，20（8）：114.劉冠卉，丁 娟，王 玉，等. 萎凋工藝對(duì)桑葉紅茶γ-氨基丁酸含量與感官品質(zhì)的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2019，47（4）：168-170.