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    1株拮抗鏈格孢的芽孢桿菌的篩選鑒定和抑菌效果

    2019-08-10 03:46:59劉偉王多文何彩李強(qiáng)史星雲(yún)劉鵬
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2019年4期
    關(guān)鍵詞:鏈格孢子芽孢

    劉偉 王多文 何彩 李強(qiáng) 史星雲(yún) 劉鵬

    摘要:以鏈格孢(Alternaria spp.)為靶標(biāo)菌從農(nóng)田土壤中分離到1株芽孢桿菌。通過形態(tài)學(xué)特征、生理生化分析及16S rDNA序列分析等對(duì)菌株進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明,菌株LKYLW-1為萎縮芽孢桿菌(Bacillus atrophaeus,GenBank登錄號(hào)為MF375905);對(duì)鏈格孢的抑菌帶寬為15.8 mm;采用菌絲生長抑制法、孢子萌發(fā)法測(cè)定LKYLW-1的抑菌作用,發(fā)現(xiàn)菌株LKYLW-1代謝產(chǎn)物對(duì)鏈格孢絲有致畸作用;菌株LKYLW-1發(fā)酵液對(duì)孢子萌發(fā)抑制率為96.60%;EC50為6.93 mL/L;飽和度為25%;硫酸銨獲得的抑菌物質(zhì)對(duì)鏈格孢的抑菌活性較高,抑菌圈直徑達(dá)42.01 mm。

    關(guān)鍵詞:芽孢桿菌;抑菌活性;拮抗;鏈格孢屬靶標(biāo)真菌;形態(tài)學(xué)特征;生理生化分析;16S rDNA序列分析

    中圖分類號(hào): S476;S182? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A? 文章編號(hào):1002-1302(2019)04-0091-03

    多種作物的黑斑病是由鏈格孢屬真菌(Alternaria spp.)引起的[1],鏈格孢屬真菌會(huì)導(dǎo)致作物產(chǎn)量和品質(zhì)受到嚴(yán)重影響,鏈格孢屬真菌同時(shí)也是蔬菜貯藏過程中的主要病害菌,能引起多種瓜果、蔬菜的腐敗,造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。使用農(nóng)藥能暫時(shí)控制黑斑病的大面積傳播,然而其副作用也引起了人們的重視。

    生物防治因其對(duì)人畜安全、環(huán)境兼容性好、而且不易產(chǎn)生抗藥性而倍受關(guān)注。王繼華等從冷凍菌種甘油中分離到1株芽孢桿菌,能產(chǎn)生抑制鏈格孢真菌的物質(zhì)[3];趙陽國等從土壤中分離出1株枯草芽孢桿菌,該菌對(duì)農(nóng)林業(yè)危害真菌鏈格孢菌具有強(qiáng)烈的抑制作用[4]。芽孢桿菌防治植物病害的作用機(jī)制主要有與病原菌競(jìng)爭(zhēng)營養(yǎng)和生態(tài)位點(diǎn)、分泌抗菌物質(zhì)抑制病原菌的生長以及激發(fā)植物系統(tǒng)抗病性[5]。本研究通過形態(tài)學(xué)特征、生理生化分析及16S rDNA序列分析等方法,鑒定出1株從農(nóng)田土壤中分離到的芽孢桿菌,能夠強(qiáng)烈抑制鏈格孢屬真菌的生長。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    供試鏈格孢:本研究用菌由甘肅省釀酒葡萄苗木快繁工程技術(shù)研究中心葡萄病理實(shí)驗(yàn)室保存、提供。

    土壤樣品:從甘肅省武威市林業(yè)科學(xué)研究院采集農(nóng)田土壤30份。

    培養(yǎng)基:溶菌肉湯(LB)固體培養(yǎng)基用于分離和保存分離的芽孢桿菌;LB液體培養(yǎng)基用于發(fā)酵分離芽孢桿菌;馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基用于對(duì)峙培養(yǎng)。

    試驗(yàn)時(shí)間:2016年8月。

    1.2 方法

    1.2.1 土壤拮抗芽孢桿菌的分離和篩選 芽孢桿菌的分離采用稀釋涂布法[6]。將采集的土樣稱取10 g,加入裝有 90 mL 無菌水并放有玻璃珠的250 mL錐形瓶中,80 ℃水浴30 min,再充分振蕩30 min,10倍倍比稀釋,涂布分離。純化的細(xì)菌經(jīng)革蘭氏染色和芽孢染色,顯示菌體呈桿狀、產(chǎn)芽孢、G+的分離物為芽孢桿菌。將分離得到的芽孢桿菌進(jìn)行編號(hào),觀察菌落形態(tài)。

    采用平板對(duì)峙法進(jìn)行拮抗芽孢桿菌的篩選,將已培養(yǎng)3 d的鏈格孢用5 mm打孔器打孔,將菌餅移到PDA培養(yǎng)基中央,28 ℃培養(yǎng)24 h后,在離真菌等距離的四周接上待測(cè)芽孢桿菌,28 ℃培養(yǎng)4 d后,測(cè)量抑菌帶的寬度,篩選效果最好的1株芽孢桿菌進(jìn)行研究[7-8]。

    1.2.2 拮抗芽孢桿菌的抑菌活性測(cè)定 對(duì)鏈格孢菌絲影響的研究采用平板對(duì)峙法[9],在PDA平板中央接鏈格孢菌餅,在距離中心3 cm的兩側(cè)接種培養(yǎng)48 h且生長良好的拮抗芽孢桿菌,28 ℃倒置培養(yǎng)4 d。觀察靠近芽孢桿菌抑菌圈邊緣菌絲的生長情況,以遠(yuǎn)離拮抗芽孢桿菌的邊緣菌絲為對(duì)照,顯微觀察菌絲的生長情況。

    拮抗芽孢桿菌無菌發(fā)酵濾液的制備:將發(fā)酵液經(jīng) 10 000 r/min 離心過濾,0.22 μm濾膜過濾除菌得到無菌發(fā)酵液。將鏈格孢孢子制備成孢子懸浮液(400倍顯微鏡下,每個(gè)視野中可看到20個(gè)孢子),將制備好的拮抗芽孢桿菌無菌發(fā)酵液與病原菌孢子配制成0、50、100、200、500 mL/L系列濃度的孢子懸浮液,以清水為對(duì)照,每個(gè)處理3次重復(fù)。28 ℃恒溫培養(yǎng)8~10 h,檢查對(duì)照處理的孢子萌發(fā)情況(以孢子芽管長度大于孢子短半徑時(shí)判為萌發(fā)),孢子萌發(fā)抑制率=(對(duì)照孢子萌發(fā)率-處理孢子萌發(fā)率)/對(duì)照孢子萌發(fā) 率×100%[10-11]。

    1.2.3 拮抗芽孢桿菌的鑒定

    1.2.3.1 菌體形態(tài)、培養(yǎng)特征觀察及生理生化指標(biāo)測(cè)定參照柳鳳等的方法[12]。

    1.2.3.2 16S rDNA基因序列測(cè)定及其系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建參照Todorov等的方法[13] 提取細(xì)菌基因組DNA為模板,以7f(5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′)和1 540r(5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′)[生工生物工程(上海)股份有限公司合成]為上、下游引物,擴(kuò)增菌株的16S rDNA。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送往該公司進(jìn)行序列測(cè)定,測(cè)序結(jié)果用Blast軟件在GenBank中進(jìn)行同源性比較,并提交注冊(cè)登錄號(hào),進(jìn)行序列分析。

    1.2.4 拮抗芽孢桿菌抑菌物質(zhì)的提取 將拮抗芽孢桿菌LKYLW-1接種到LB液體培養(yǎng)基中,對(duì)照為LB液體培養(yǎng)基,28 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)24 h,10 000 r/min離心 20 min,去菌體,加入不同質(zhì)量濃度的硫酸銨,使硫酸銨飽和度分別為10%、20%、25%、30%、35%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%,4 ℃下靜置沉淀24 h,棄上清,沉淀用25 mmol/L磷酸緩沖液溶解,透析脫鹽后與鏈格孢對(duì)峙培養(yǎng),5 d后用濾紙片法[14]測(cè)定抑菌圈大小。

    1.2.5 數(shù)據(jù)分析 采用SPSS 16.0軟件、Duncans方法對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 拮抗芽孢桿菌的篩選結(jié)果

    2.1.1 拮抗芽孢桿菌的篩選 從甘肅省武威市林業(yè)科學(xué)研究院農(nóng)田30份土壤中,分離得到151株芽孢桿菌。經(jīng)鏈格孢篩選后,得到抗鏈格孢活性較強(qiáng)的芽孢桿菌3株,其中LKYLW-1菌株對(duì)鏈格孢的拮抗活性較好,抑菌帶寬為 15.8 mm,如圖1所示。故后續(xù)試驗(yàn)均以LKYLW-1菌株為拮抗菌。

    2.2 LKYLW-1的抑菌活性

    2.2.1 對(duì)鏈格孢菌絲生長的影響 圖2結(jié)果顯示,對(duì)照菌絲生長細(xì)長而均勻,細(xì)胞結(jié)構(gòu)較為清晰,并無膨大畸形現(xiàn)象(圖2-a)。LKYLW-1菌株主要使菌絲體膨大變粗,生長畸形,菌絲頂端和分枝處較為膨大;菌絲分枝增多,粗而短;菌絲體內(nèi)部細(xì)胞原生質(zhì)體分布不均勻,濃縮成不規(guī)則體,部分菌絲內(nèi)有原生質(zhì)流出形成空殼的現(xiàn)象(圖2-b)。

    2.2.2 對(duì)鏈格孢孢子萌發(fā)的抑制作用 由圖3可知,無菌發(fā)酵液對(duì)孢子萌發(fā)有明顯的抑制作用,孢子萌發(fā)抑制率為 96.60%,EC50為6.93 mL/L。

    2.2.4 LKYLW-1菌株的鑒定

    2.2.4.1 菌株LKYLW-1培養(yǎng)性狀、形態(tài)學(xué)特征及生理生化特征 在LB固體培養(yǎng)基上,LKYLW-1菌落呈乳白色、不透明、菌落光滑、中間凹陷、邊緣隆起。透過電鏡顯示 LKYLW-1 呈桿狀,長約2 μm,革蘭氏陽性,周生鞭毛,芽孢呈橢圓形(圖4)。將菌株LKYLW-1的形態(tài)特征和生理生化特性(表1)與《常用細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》中有關(guān)細(xì)菌的描述進(jìn)行比較,確定此菌株為芽孢桿菌屬,菌株基本可以確定為萎縮芽孢桿菌(Bacillus atrophaeus)。

    2.2.4.2 16S rDNA序列分析 以LKYLW-1基因組DNA為模板,用引物7f和1 540r進(jìn)行PCR擴(kuò)增,測(cè)得該菌株的16S rDNA核苷酸序列長度為1 492 bp,GenBank登錄號(hào)為MF375905。將該序列與GenBank中的相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行相似性分析,結(jié)果表明,與親緣關(guān)系相近的前100個(gè)序列全為芽孢桿菌屬;前20個(gè)序列中, 有13株為萎縮芽孢桿菌菌株;且菌株LKYLW-1與它們都具有99%以上的同源,其中與萎縮芽孢桿菌(登錄號(hào):CP022653.1、CP021500.1、KR085882.1、CP011802.1、CP010778.1、CP007640.1、KF751643.1、CP002207.1)的同源性最高,達(dá)到了100%。綜合生理生化特征將其鑒定為萎縮芽孢桿菌(Bacillus atrophaeus)LKYLW-1。

    2.2.5 LKYLW-1菌株的抑菌物質(zhì)對(duì)鏈格孢的抑菌活性 由表2可知,菌株LKYLW-1能夠分泌胞外抑菌物質(zhì),在硫酸銨飽和度≥35%時(shí)無沉淀析出,即對(duì)鏈格孢無抑菌活性,而硫酸銨飽和度為10%~30%時(shí),獲得的抑菌物質(zhì)對(duì)鏈格孢均具有抑菌活性,但抑菌活性不同。其中,硫酸銨飽和度為25%時(shí)獲得的抑菌物質(zhì)抑菌圈直徑最大,即抑菌活性最高,抑菌圈直徑達(dá)42.01 mm(圖5)。

    3 結(jié)論與討論

    本研究從農(nóng)田土壤中分離篩選出拮抗芽孢桿菌,一方面增大了成功篩選出拮抗菌的可能性,另一方面將其施用于作物時(shí)無毒無害。芽孢桿菌是自然界中廣泛存在的一種非致病性細(xì)菌,能產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì),其中大部分是多肽,主要抑制革蘭氏陽性菌,有些還能抑制霉菌、革蘭氏陰性菌和酵母[15]。本研究中LKYLW-1菌株在距離鏈格孢中心3 cm的2側(cè)接種培養(yǎng)48 h后,可使菌絲體膨大變粗,生長畸形;菌絲體內(nèi)部細(xì)胞原生質(zhì)體分布不均勻,濃縮成不規(guī)則體,部分菌絲內(nèi)有原生質(zhì)流出形成空殼的現(xiàn)象,最終可能會(huì)導(dǎo)致菌絲不能正常分化產(chǎn)生孢子,影響其繁殖,不過抑菌機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

    本研究的目的是通過篩選找到對(duì)鏈格孢有明顯拮抗作用的菌株,并對(duì)其進(jìn)行初步研究,拓寬了鏈格孢拮抗菌的篩選范圍,為今后鏈格孢引起的病害生物防治奠定了基礎(chǔ)。今后將對(duì)菌株LKYLW-1進(jìn)行深入研究,包括發(fā)酵條件優(yōu)化,拮抗蛋白的分離、提取,以及拮抗蛋白的純化測(cè)序等,使其商品化生產(chǎn)。

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