添加抗寒劑對(duì)包衣棉花種子萌芽及其耐冷性的影響

韓松　吉慶勛　楊曼利　黨永富　喬傳令

摘要：為探討低溫條件下包衣時(shí)添加抗寒劑對(duì)棉花種子萌發(fā)及幼苗的影響，采用不同抗寒劑和種衣劑混合后對(duì)銀山6號(hào)棉花種子包衣，分別設(shè)置5 ℃低溫脅迫2 d和25 ℃培養(yǎng)2 d再5 ℃低溫脅迫2 d，共同轉(zhuǎn)入25 ℃恢復(fù)培養(yǎng)。運(yùn)用多指標(biāo)數(shù)據(jù)綜合統(tǒng)計(jì)分析方法研究了棉花種子用衛(wèi)福200FF包衣，以及不同的抗寒劑和衛(wèi)福200FF種衣劑混合后包衣，對(duì)于低溫脅迫下棉花種子萌芽耐冷性的影響。結(jié)果表明，與萌發(fā)前相比，棉花在正常萌芽時(shí)實(shí)施低溫脅迫使種子發(fā)芽活力下降更明顯，萌發(fā)的種子更容易遭受損傷;抗寒劑與衛(wèi)福200FF種衣劑混合包衣可明顯促進(jìn)低溫脅迫下棉花種子萌發(fā)，提高其耐冷性;3種抗寒劑處理的棉花幼芽耐冷性不同，γ-聚谷氨酸與外源調(diào)節(jié)物質(zhì)復(fù)配處理效果最佳。

關(guān)鍵詞：抗寒劑;包衣;棉花;萌芽;耐冷性;主成分分析;隸屬函數(shù)分析;綜合評(píng)價(jià)

中圖分類(lèi)號(hào)： S562.01? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號(hào)：1002-1302（2019）04-0078-04

眾所周知，非生物脅迫都會(huì)對(duì)作物造成一定程度的傷害[1]，其中低溫是影響棉花生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)量品質(zhì)形成的重要逆境因子之一，若在棉花苗期遇持續(xù)低溫天氣，常造成大面積死苗，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及農(nóng)戶(hù)帶來(lái)較大損失[2]。研究發(fā)現(xiàn)，抗低溫種衣劑處理后棉花的保苗效果和產(chǎn)量明顯高于普通種衣劑，且對(duì)低溫造成的爛種、爛芽具有明顯的防治效果[3-4]，但是Baxter等指出，種衣劑衣膜影響種子的吸水透氣過(guò)程，進(jìn)而影響種子的發(fā)芽[5]。因此，研究一種抗寒劑，既能提高作物的耐冷性，同時(shí)也不影響種子發(fā)芽尤為重要。γ-聚谷氨酸是由微生物發(fā)酵產(chǎn)生的一種γ-谷氨酸鏈狀高聚物，它富含側(cè)鏈羧基，具有無(wú)毒、無(wú)害、無(wú)殘留等特性，還具有高吸水保水性，螯合多種無(wú)機(jī)離子等功能[6]?；讦?聚谷氨酸這種自身獨(dú)特的物理化學(xué)性質(zhì)，在農(nóng)業(yè)上常用作保水劑、肥料促進(jìn)劑和種子包衣劑等[7-8]。喬長(zhǎng)晟等應(yīng)用γ-聚谷氨酸對(duì)種子進(jìn)行包衣，結(jié)果表明能促進(jìn)種子萌發(fā)和幼苗的生長(zhǎng)[9]。王建平等研究發(fā)現(xiàn)，γ-聚谷氨酸處理可有效提高種子活力和發(fā)芽率，縮短出苗時(shí)間，提高種子萌發(fā)時(shí)淀粉酶和過(guò)氧化物酶的活性，并且使幼芽在低溫脅迫后也能保持較高的根系活力，增強(qiáng)耐冷性[10-12]。低溫影響種子萌發(fā)的研究已有較多報(bào)道，但通過(guò)抗寒劑處理來(lái)提高棉花種子耐冷性的研究報(bào)道較少。鑒于以上2點(diǎn)，本研究從棉花種子處理入手，研究不同時(shí)期低溫脅迫下含γ-聚谷氨酸的不同抗寒劑處理對(duì)棉花種子萌發(fā)的影響，并在研究中采用了多指標(biāo)綜合評(píng)定的方法來(lái)判斷不同處理耐冷性差異，如因子分析、主成分分析法和隸屬函數(shù)等，避免了因使用單一指標(biāo)判斷植物的耐冷性極易受到外界環(huán)境影響而導(dǎo)致結(jié)果不可靠的問(wèn)題，并探討了外源物質(zhì)對(duì)種子萌發(fā)耐冷性的影響，為進(jìn)一步提高棉花產(chǎn)量提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試品種為銀山6號(hào)，由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所選育，抗寒劑A、B、C由河南奈安生物科技股份有限公司/農(nóng)藥副作用及藥害防控技術(shù)河南省工程實(shí)驗(yàn)室自主研發(fā)，其主要有效成分如下：抗寒劑A：γ-聚谷氨酸、水溶性腐植酸和無(wú)機(jī)鹽;抗寒劑B：γ-聚谷氨酸、赤霉素和蕓薹素內(nèi)酯;抗寒劑C：γ-聚谷氨酸和生化黃腐酸。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 種子包衣處理 每10 kg種子用衛(wèi)福200FF（萎銹靈200 g/L，福美雙200 g/L）40 mL包衣時(shí)分別添加10 mL抗寒劑A、B、C，分別記作處理A、B、C，以包衣時(shí)添加10 mL蒸餾水的種子作為對(duì)照CK。

1.2.2 低溫脅迫處理 挑選飽滿(mǎn)、未破損的包衣種子置于墊有2層濾紙的培養(yǎng)皿中（濾紙及培養(yǎng)皿采取高溫蒸汽滅菌法滅菌處理），轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)箱中恒濕狀態(tài)下模擬早春低溫天氣分批進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)芽試驗(yàn)于2016年9月中旬在農(nóng)藥副作用及藥害防控技術(shù)河南省工程實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，具體設(shè)計(jì)如下：第1批為萌發(fā)前低溫脅迫：培養(yǎng)箱中5 ℃低溫處理2 d轉(zhuǎn)入25 ℃恢復(fù)培養(yǎng)，每個(gè)處理3個(gè)培養(yǎng)皿，每皿100粒種子;第2批為萌發(fā)中低溫脅迫：培養(yǎng)箱中25 ℃培養(yǎng)2 d再5 ℃低溫處理 2 d 轉(zhuǎn)入25 ℃恢復(fù)培養(yǎng)，每個(gè)處理3個(gè)培養(yǎng)皿，每皿100粒種子;第3批為常溫培養(yǎng)：培養(yǎng)箱中恒溫25 ℃培養(yǎng)，只設(shè)對(duì)照CK，每皿100粒種子。

1.2.3 測(cè)定指標(biāo)及方法 各處理種子25 ℃恢復(fù)培養(yǎng)，種子發(fā)芽2 d后取樣手工去皮后測(cè)定幼芽胚根的超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量、可溶性糖含量和質(zhì)膜透性。SOD活性的測(cè)定采用氮藍(lán)四唑光化還原抑制法[13-14];MDA含量的測(cè)定采用硫代巴比妥酸比色法[14-15];可溶性糖含量的測(cè)定采用蒽酮比色法[10];質(zhì)膜透性采用電導(dǎo)率儀法，其中相對(duì)電導(dǎo)率=浸泡液中電導(dǎo)率/煮沸后電導(dǎo)率×100%。

以胚芽鞘長(zhǎng)度大于等于0.5 cm為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)[16]，每天同一時(shí)間檢查種子發(fā)芽數(shù)，恢復(fù)培養(yǎng)后第7日統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率、幼芽鮮質(zhì)量和幼芽活力。發(fā)芽率采用計(jì)數(shù)法，幼芽鮮質(zhì)量采用稱(chēng)量法，發(fā)芽活力=發(fā)芽率×幼芽鮮質(zhì)量[17]。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)整理與分析采用Microsoft Excel 2007軟件，作圖采用Sigmaplot 12.0軟件。參照周廣生等的方法[18-19]將各指標(biāo)的原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為相對(duì)值，運(yùn)用SPSS 18.0軟件對(duì)各指標(biāo)的相對(duì)值進(jìn)行主成分分析，并利用隸屬函數(shù)值對(duì)幾個(gè)抗寒劑處理的棉花種子萌芽期的耐冷性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。主要公式如下：

式中：Xj表示第j個(gè)綜合指標(biāo);Xmin表示第j個(gè)綜合指標(biāo)的最小值;Xmax表示第j個(gè)綜合指標(biāo)的最大值。wj表示第j個(gè)綜合指標(biāo)在所有綜合指標(biāo)中的重要程度即權(quán)重;pj為各處理第j個(gè)綜合指標(biāo)的貢獻(xiàn)率;D值為各處理在低溫脅迫條件下由綜合指標(biāo)評(píng)價(jià)所得的耐寒性度量值。

2 結(jié)果與分析

2.1 指標(biāo)的相對(duì)值分析

由表1、表2可知，無(wú)論是萌芽前還是萌芽中，低溫脅迫之后，各處理棉花幼芽與常溫對(duì)照相比均受到了不同程度的低溫影響，不同處理棉花經(jīng)低溫脅迫后的發(fā)芽率和幼芽鮮質(zhì)量與常溫（25 ℃）對(duì)照相比均有所下降（相對(duì)值<1），而且溫度越低下降越明顯;而SOD活性、MDA含量、可溶性糖含量和質(zhì)膜透性與常溫（25 ℃）對(duì)照相比均有所上升（相對(duì)值>1），但不同處理各單項(xiàng)指標(biāo)的變化幅度不盡相同，各有差異。各指標(biāo)的相對(duì)值在一些文獻(xiàn)中又叫做抗寒系數(shù)或耐冷系數(shù)[2，20]，只指示該指標(biāo)下的耐冷性強(qiáng)弱。因此，用任何單一指標(biāo)的相對(duì)值來(lái)評(píng)價(jià)棉花耐寒性存在片面性和不穩(wěn)定性，也表明棉花耐寒性是一個(gè)復(fù)雜的綜合性狀，必須用多個(gè)指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)才較為可靠。為彌補(bǔ)單項(xiàng)指標(biāo)耐寒性評(píng)價(jià)的不足，需在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步利用其他多元統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行分析。

2.2 主成分分析

主成分分析就是在盡可能不損失信息或少損失信息的情況下，將多個(gè)變量減少為少數(shù)幾個(gè)潛在因子，這幾個(gè)因子可以高度概括大量數(shù)據(jù)中的信息，這樣既減少了變量的個(gè)數(shù)，又能再現(xiàn)變量間的內(nèi)在聯(lián)系[21]。主成分的特征值以及貢獻(xiàn)率是選擇主成分的重要依據(jù)[22]。通過(guò)對(duì)6個(gè)單項(xiàng)指標(biāo)相對(duì)值進(jìn)行主成分分析，提取綜合成2個(gè)主成分指標(biāo)CI-1和CI-2（表3、表4），其在2批低溫脅迫處理中衡量耐冷性的貢獻(xiàn)率分別為78.713%、18.702%和76.167%、18.378%，其累計(jì)貢獻(xiàn)率分別達(dá)到97.415%和94.545%，其余貢獻(xiàn)率較小，可以忽略不計(jì)。這樣可將原來(lái)6個(gè)單項(xiàng)指標(biāo)轉(zhuǎn)換為2個(gè)新的相互獨(dú)立的主成分指標(biāo)，并代表了原始指標(biāo)攜帶的絕大部分信息。

在第1批低溫脅迫處理中，第1主成分（CI-1）中的發(fā)芽率、鮮質(zhì)量和MDA含量等指標(biāo)的系數(shù)值較大，說(shuō)明這些指標(biāo)可以較好地反映該批低溫脅迫下棉種的耐冷性;第2主成分（CI-2）中的SOD活性、可溶性糖含量和質(zhì)膜透性等指標(biāo)的系數(shù)值較大，說(shuō)明這些指標(biāo)與棉種的耐冷性也存在一定關(guān)系;在第2批低溫脅迫處理中， 第1主成分（CI-1）中的SOD活性、MDA含量和發(fā)芽率等指標(biāo)的系數(shù)值較大，說(shuō)明這些指標(biāo)可以較好地反映棉種萌芽期的耐冷性;第2主成分（CI-2）中的鮮質(zhì)量、質(zhì)膜透性和SOD活性等指標(biāo)的系數(shù)值較大，說(shuō)明這些指標(biāo)與棉種萌芽時(shí)的耐冷性也存在一定關(guān)系。

在2批低溫脅迫處理中，發(fā)芽率、鮮質(zhì)量和SOD活性都會(huì)作為主成分的指標(biāo)出現(xiàn)，說(shuō)明低溫冷害對(duì)植物體最直接的傷害表現(xiàn)就是阻礙生長(zhǎng)、不易發(fā)芽，在低溫脅迫下植物體內(nèi)積極響應(yīng)的生理變化就是SOD活性升高;在任何一批低溫脅迫中，質(zhì)膜透性和MDA含量都會(huì)作為構(gòu)成主成分的主要指標(biāo)存在，說(shuō)明低溫脅迫時(shí)首先遭到破壞的是膜質(zhì)結(jié)構(gòu)。

2.3 隸屬函數(shù)分析和綜合評(píng)價(jià)

2.3.1 隸屬函數(shù)分析和權(quán)重的確定 根據(jù)各指標(biāo)的系數(shù)及各單項(xiàng)指標(biāo)的相對(duì)值，求出不同處理的2個(gè)主成分綜合指標(biāo)值C（CI-1）和C（CI-2）（表5、表6）。在同一批低溫脅迫下，哪個(gè)處理的綜合指標(biāo)數(shù)值越大，說(shuō)明該處理在這一綜合指標(biāo)上的耐冷性越強(qiáng)，反之越差。但各處理的耐冷性由2個(gè)綜合指標(biāo)值所共同決定，單獨(dú)用任何一個(gè)綜合指標(biāo)都無(wú)法準(zhǔn)確評(píng)價(jià)出耐冷性。

根據(jù)公式（1）和公式（2）分別計(jì)算每個(gè)處理各綜合指標(biāo)的隸屬函數(shù)值u（X）及其對(duì)應(yīng)的權(quán)重wj（表5和表6），據(jù)公式（3）計(jì)算各處理的耐冷性量度值D，該值是隸屬函數(shù)值與其對(duì)應(yīng)的權(quán)重乘積的求和，同時(shí)涵蓋了2個(gè)主成分綜合指標(biāo)，反映了不同處理的綜合耐冷性。

2.3.2 綜合評(píng)價(jià)值的確定 耐冷性綜合評(píng)價(jià)值反映了各處理綜合耐冷性的強(qiáng)弱，并可根據(jù)D值的大?。ū?和表6）對(duì)耐冷性強(qiáng)弱進(jìn)行排序，數(shù)值越大越耐冷。研究表明，在第1批低溫脅迫下CK、處理A、處理B、處理C的D值分別為0.113、0.637、1.000、0.705，可以判定處理B耐冷性最強(qiáng)，而CK耐冷性最弱，處理A和處理C耐冷性居中;在第2批低溫脅迫下CK、處理A、處理B、處理C的D值分別為0.123、0.882、1.000、0.721，可以判定處理B耐冷性最強(qiáng)，而CK耐冷性最弱，處理A和處理C耐冷性居中。在2批低溫脅迫下，CK耐冷性都表現(xiàn)為最弱，說(shuō)明包衣時(shí)添加抗寒劑有助于提高種子的耐冷抗寒能力;處理B均表現(xiàn)為耐冷性最強(qiáng)，說(shuō)明抗寒劑B能有效提升棉花種子萌芽前和萌芽時(shí)的耐冷性，效果最佳。

2.4 不同批次低溫脅迫對(duì)不同處理發(fā)芽指標(biāo)的影響

低溫脅迫直接影響種子的發(fā)芽率和鮮質(zhì)量，而發(fā)芽活力則是發(fā)芽率和鮮質(zhì)量的綜合指標(biāo)，既反映了發(fā)芽總數(shù)又反映了幼芽的生長(zhǎng)勢(shì)，能比較全面地反映種子活力[4]。在第2批低溫脅迫下的各處理幼芽活力相對(duì)值明顯低于第1批低溫脅迫的各處理（圖1），差異達(dá)到極顯著水平，這說(shuō)明種子在萌發(fā)期對(duì)低溫脅迫更加敏感，萌發(fā)期的低溫脅迫使種子發(fā)芽活力下降，更容易遭受低溫冷害損傷。通過(guò)對(duì)2批低溫脅迫數(shù)據(jù)對(duì)比，從不同處理的發(fā)芽活力中發(fā)現(xiàn)，對(duì)照CK在萌芽期種子發(fā)芽活力下降幅度超過(guò)其他處理，而在不同批次低溫脅迫下其他處理的種子發(fā)芽活力均高于對(duì)照，說(shuō)明抗寒劑處理可以有效減輕低溫脅迫下種子發(fā)芽活力下降的情況，對(duì)種子有一定的保護(hù)作用。

3 討論與結(jié)論

由于主成分分析利用降維的思想，在損失較少信息的前提下，可以把多個(gè)關(guān)系錯(cuò)綜復(fù)雜的指標(biāo)轉(zhuǎn)換成新的個(gè)數(shù)較少的且彼此獨(dú)立或不相關(guān)的綜合指標(biāo)，比較準(zhǔn)確地了解各性狀的綜合表現(xiàn)，同時(shí)根據(jù)各自貢獻(xiàn)率大小可以確定其相對(duì)重要性[23]。以此為基礎(chǔ)，再采用隸屬函數(shù)法對(duì)各處理的耐冷性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，不僅可以避免單一指標(biāo)的片面性和穩(wěn)定性，而且可以較好地揭示各指標(biāo)與耐冷性的關(guān)系[24-25]。本研究利用主成分分析法將低溫脅迫下棉花幼芽的6個(gè)單項(xiàng)指標(biāo)轉(zhuǎn)換成2個(gè)彼此獨(dú)立的綜合指標(biāo)，進(jìn)一步得到不同處理幼芽的隸屬度值（D值），并據(jù)此判定不同抗寒劑劑對(duì)提高棉花幼芽耐冷性的試驗(yàn)效果，更加科學(xué)合理[26]。但因該方法中綜合指標(biāo)值C（X）轉(zhuǎn)化為隸屬函數(shù)值u（X）時(shí)只限定在同一批低溫脅迫范圍內(nèi)，因此無(wú)法比較2個(gè)不同低溫脅迫批次之間的耐冷性差異，該問(wèn)題的解決有待進(jìn)一步研究。

利用外源物質(zhì)來(lái)誘導(dǎo)提高棉花抗寒性的研究比較普遍，目前已報(bào)道的主要有水楊酸、茉莉酸甲酯、蕓薹素、亞精胺等激素及類(lèi)似物以及一氧化氮、硝酸鈣、氯化鈣等其他調(diào)節(jié)物質(zhì)[27-32]。蕓薹素內(nèi)酯參與植物體內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，可能是通過(guò)阻止植物幼苗產(chǎn)生過(guò)多的自由基或誘導(dǎo)形成較多的自由基清除劑緩解膜脂過(guò)氧化過(guò)程，并激活不飽和脂肪酸的合成途徑，增加膜質(zhì)不飽和脂肪酸含量從而穩(wěn)定膜的結(jié)構(gòu)與功能，增強(qiáng)膜的防衛(wèi)能力，提高植物對(duì)低溫、高溫和鹽堿環(huán)境的耐性[33-34];而γ-聚谷氨酸的緩釋能力有助于調(diào)節(jié)物質(zhì)持久長(zhǎng)效，因此二者復(fù)配（抗寒劑B）處理種子能夠明顯提高種子萌芽時(shí)的耐冷性。張彥芳等研究發(fā)現(xiàn)，用無(wú)機(jī)鹽混合試劑與 γ-聚谷氨酸復(fù)合處理水稻種子，能夠增強(qiáng)水稻低溫信號(hào)傳導(dǎo)轉(zhuǎn)錄途徑的表達(dá)而增強(qiáng)了水稻的耐冷性[35]。本研究發(fā)現(xiàn)類(lèi)似組合（抗寒劑A）處理同樣能夠增強(qiáng)棉花種子萌芽期的耐冷性。

綜上所述，種子分別在萌芽前和萌芽期進(jìn)行低溫脅迫后的耐冷性存在差異，而且添加抗寒劑的拌種處理耐冷性明顯強(qiáng)于對(duì)照，這表明在種衣劑中添加γ-聚谷氨酸、蕓薹素內(nèi)酯等附加成分能夠提高包衣種子在萌芽期的耐冷性，這可能與種衣劑和抗寒劑之間的互作有關(guān)，而耐冷性差異與包衣時(shí)添加成分的不同有關(guān)。

通過(guò)研究添加不同的抗寒劑可有效改善棉花種子萌芽期耐冷性，提高其抗低溫的能力，但抗寒劑提高棉花種子萌發(fā)耐冷性的作用機(jī)制及其在大田中效果如何尚待進(jìn)一步研究。

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