山東地區(qū)雞源致病性大腸桿菌的相關(guān)基因檢測(cè)及藥敏試驗(yàn)

張子越 趙魯 趙巧雅 王雷 齊霖 彭燕 商敏 許薔 路曉 吳靜

摘? 要：為了解近年山東省禽源大腸桿菌的毒力因子及耐藥情況，分析潛在的公共安全問題，特將本實(shí)驗(yàn)室保存的大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株與送檢的發(fā)病（死）雞中分離的菌株同時(shí)進(jìn)行毒力基因的PCR檢測(cè)及藥敏試驗(yàn)。結(jié)果顯示：16種常見抗生素中，青霉素G和萬古霉素對(duì)20株大腸桿菌均無抑制作用，而抑菌效果較好的抗生素主要有阿米卡星、慶大霉素等;其中兩株大腸桿菌分離株對(duì)上述16種抗生素均不敏感，17株大腸桿菌對(duì)超過5種以上抗生素耐藥;13株含有5種以上毒力因子基因，占比65%;4株同時(shí)含有7種毒力因子基因，占比20%;僅1株不含被檢毒力基因。上述結(jié)果表明，大腸桿菌耐藥形勢(shì)異常嚴(yán)峻，并且部分菌株具有較強(qiáng)的致病力。本次試驗(yàn)結(jié)果同樣對(duì)保障公共健康、防止耐藥菌株通過食物鏈進(jìn)入人體造成危害具有借鑒意義。

關(guān)鍵詞：雞源大腸桿菌;毒力因子;耐藥性;藥敏試驗(yàn)

中圖分類號(hào)：S858.314.4+3? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B? ? ?文章編號(hào)：1673-1085（2019）06-0012-05

雞大腸桿菌病是由致病性大腸埃希氏菌 （Escherichia coli）引起的一種以肝周炎、腹膜炎、心包（肌）炎、敗血癥為主要特征的傳染病。各品種、日齡雞均易感發(fā)病， 但肉仔雞發(fā)病率最高[1]。20世紀(jì)40年代，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)某些特殊血清型大腸桿菌對(duì)人和動(dòng)物均有致病性[2]。雞大腸桿菌血清型眾多、分型過程復(fù)雜，并且具有時(shí)間和地域性差異[3]。據(jù)報(bào)道，大腸桿菌的毒力因子在其致病過程中發(fā)揮重要作用[4，5]。大腸桿菌的毒力因子主要包括溫度敏感血凝素、鐵離子攝取系統(tǒng)、黏附素、耶爾森強(qiáng)毒力島、侵襲因子、血清抗性蛋白、毒素等[6-9]。各種因素作用下，大腸桿菌易產(chǎn)生耐藥性，這也是防治大腸桿菌病的主要難點(diǎn)[1，3]。本研究對(duì)近年山東省各地養(yǎng)殖場(chǎng)送檢的發(fā)病（死）雞體內(nèi)分離到的大腸桿菌和本實(shí)驗(yàn)室保存的標(biāo)準(zhǔn)株同時(shí)進(jìn)行相關(guān)基因的PCR檢測(cè)及藥敏試驗(yàn)，以了解大腸桿菌毒力基因的攜帶情況與耐藥性的關(guān)系，為防止人獸共患病原菌間耐藥性的傳遞及臨床用藥提供理論依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 試驗(yàn)材料

1.1.1? 菌株? 大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株（CAU0751）購(gòu)自中國(guó)獸藥監(jiān)察所;19株大腸桿菌分離自近年山東省內(nèi)各養(yǎng)殖場(chǎng)送檢的發(fā)?。ㄋ溃╇u，分離時(shí)臨床癥狀明顯。以上菌株由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所山東省禽病診斷與免疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存活化。

1.1.2? 藥敏片及規(guī)格? 16種藥敏片（英國(guó)Oxoid公司生產(chǎn)）均購(gòu)自北京蘭伯瑞生物技術(shù)有限公司。相關(guān)藥敏片信息見表1。

1.1.3? 主要試劑、儀器? LB固體培養(yǎng)基（含5%血清），麥康凱培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯和大腸桿菌顯色培養(yǎng)基均購(gòu)自海博生物技術(shù)有限公司;2×One Step PCR Mix試劑盒、2×Taq PCR Star Mix、核酸染料、DL-2000Marker購(gòu)自北京康潤(rùn)誠(chéng)業(yè)生物科技有限公司;瓊脂糖購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司;PCR儀、電泳儀購(gòu)自杭州博日科技有限公司;紫外凝膠成像儀（Alpha Imager HP）購(gòu)自美國(guó)Protein Simple公司;自動(dòng)核酸提取儀購(gòu)自西安天隆科技有限公司;數(shù)顯游標(biāo)卡尺。

1.1.4? 引物設(shè)計(jì)? 此次共設(shè)計(jì)了10對(duì)用于檢測(cè)大腸桿菌相關(guān)基因的引物，包括：毒素基因（Ast A、Vat）;血清抗性蛋白基因（Cvi/Cva）;黏附素基因（Pap C）;溶血素基因（Hly F）;溫度敏感血凝素基因（Tsh）;鐵離子攝取系統(tǒng)基因（Iss、Iro N、Iuc D）;耶爾森強(qiáng)毒力島基因（Irp-2）。

1.2? 試驗(yàn)方法

1.2.1? 大腸桿菌的分離純化、鑒別? 大腸桿菌的分離純化試驗(yàn)流程參照任麗、張俊豐、張青嫻等人發(fā)表的文獻(xiàn)[1，2，10]。采用麥康凱和大腸桿菌顯色培養(yǎng)基對(duì)分離的菌株進(jìn)行鑒別，革蘭氏染色后鏡檢。將判定為大腸桿菌的菌株標(biāo)記相關(guān)信息后凍存在-80℃。

1.2.2? 大腸桿菌的活化與藥敏試驗(yàn)? 采用平板劃線法將凍存的大腸桿菌活化;挑取單菌落并在營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中增殖培養(yǎng);采用涂布平板法將增殖后的大腸桿菌涂布在LB固體培養(yǎng)基上，按照常規(guī)藥敏試驗(yàn)流程進(jìn)行大腸桿菌藥敏試驗(yàn)，并測(cè)量各藥敏片的抑菌圈直徑。

1.2.3? 大腸桿菌相關(guān)基因的檢測(cè)? 按照自動(dòng)核酸提取儀的操作說明提取大腸桿菌核酸，并將提取的核酸按照DNA擴(kuò)增試劑盒的說明配制反應(yīng)體系：Mix 10μl，Taq 酶1μl，上、下游引物各1μl（10pmol），模板3μl，用ddH2O補(bǔ)至20μl;PCR擴(kuò)增條件：預(yù)變性95℃ 2min，變性95℃ 30s，退火30s（退火溫度見表2），延伸72℃（延伸時(shí)間見表2），重延伸10min。將PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 細(xì)菌分離鑒定結(jié)果? 對(duì)發(fā)?。ㄋ溃╇u的組織處理后，無菌條件下分離純化細(xì)菌，并對(duì)分離得到的細(xì)菌進(jìn)行鑒別。首先在LB固體培養(yǎng)基上可觀察到中間凸起、圓形、光滑濕潤(rùn)、邊緣整齊的黃色菌落（圖1A）;在顯色培養(yǎng)基上可觀察到綠色凸起、光滑濕潤(rùn)的菌落（圖1B）;光學(xué)顯微鏡下，麥康凱培養(yǎng)基上的菌落呈圓形，邊緣整齊，略呈玫瑰紅色（圖1C）;鏡檢經(jīng)革蘭氏染色處理后的大腸桿菌可見視野內(nèi)大小不一的革蘭氏陰性菌，呈桿狀或粗桿狀（圖1D）。

2.2? 藥敏試驗(yàn)結(jié)果? 按照常規(guī)藥敏試驗(yàn)流程，對(duì)包括標(biāo)準(zhǔn)大腸桿菌菌株在內(nèi)的20株大腸桿菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，根據(jù)抑菌圈大小，分為耐藥、中度敏感和高度敏感。該次試驗(yàn)結(jié)果表明，青霉素G和萬古霉素對(duì)20株大腸桿菌均無抑制作用，而抑菌效果較好的抗生素主要有阿米卡星、慶大霉素。有兩株大腸桿菌分離株對(duì)上述16種抗生素均有耐藥性。17株大腸桿菌對(duì)超過5種以上抗生素具有耐藥性。總體而言，本次所使用的16中抗生素?zé)o一能抑制所有被檢菌株。結(jié)果如圖2所示：

2.3? 相關(guān)基因檢測(cè)結(jié)果? 根據(jù)大腸桿菌相關(guān)基因檢測(cè)情況，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析;其中13株含有5種以上毒力因子相關(guān)基因，占比65%;4株同時(shí)含有7種毒力因子相關(guān)基因，占比20%;僅1株不含

上述基因。結(jié)果如圖3所示：

3? 討論

禽大腸桿菌病是一種多發(fā)性疾病，尤其在規(guī)?；B(yǎng)殖環(huán)境中易出現(xiàn)擁擠、潮濕、通風(fēng)不良等有利于誘發(fā)大腸桿菌病的因素[3，5]。眾所周知，抗生素的不合理使用是產(chǎn)生耐藥菌的主要原因，而耐藥菌的毒力基因和耐藥基因產(chǎn)生是其致病力和自我保護(hù)的適應(yīng)性變化[5，8，9]。Ast A基因與鐵離子攝取與轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)有關(guān)，cvi基因與大腸桿菌素有關(guān)， 這兩個(gè)基因都常存在于大腸桿菌質(zhì)粒中，二者均為大腸桿菌的毒力基因中的主要成員[4，8]。黏附素與大腸桿菌粘附在宿主的腸絨毛上有關(guān)，可引起宿主腹瀉、脫水[6]。血清抗性蛋白可明顯增強(qiáng)大腸桿菌對(duì)血清的抗性，利于大腸桿菌迅速增殖擴(kuò)散[6]。溫度敏感血凝素與細(xì)菌早期定殖有關(guān)，可引起家禽氣囊炎[5，6]。鐵離子攝取系統(tǒng)與宿主深部組織損傷關(guān)系密切[6]。溶血素與細(xì)菌吸附紅細(xì)胞和產(chǎn)生炎癥等過程有關(guān)[5，6，11]。大腸桿菌質(zhì)粒編碼的 TEM、CTX-M和SHV型β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs），染色體編碼的OXA型ESBLs、質(zhì)粒介導(dǎo)的Amp C 酶、16S甲基化酶、氨基糖苷類-N-乙?；福ˋACs）等是其對(duì)β-內(nèi)酰胺類、四環(huán)素類、磺胺類及氨基糖苷類抗生素耐藥的原因[5]。

由本次試驗(yàn)結(jié)果可知，此次所檢測(cè)的20株大腸桿菌中含有5種毒力因子基因的大腸桿菌占比65%，這也表明對(duì)應(yīng)菌株具有較強(qiáng)的致病力;絕大多數(shù)菌株對(duì)5種以上常用抗生素具有耐藥性，這間接表明了大腸桿菌耐藥的嚴(yán)峻形勢(shì)。建議避免使用細(xì)菌明顯具有耐藥性的藥物，如青霉素G、萬古霉素、恩諾沙星和鏈霉素等。只有合理使用抗生素和搞好環(huán)境衛(wèi)生，加強(qiáng)飼養(yǎng)管理才能降低大腸桿菌病的發(fā)病率，將損失降至最低。以上試驗(yàn)結(jié)果同樣對(duì)保障公共健康、以防耐藥菌株通過食物鏈進(jìn)入人體造成危害具有參考價(jià)值。

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Abstract：To understand the virulence factors and drug resistance of poultry Escherichia Coli in Shandong province in recent years， to analyze potential public safety issues， In this study， PCR detection and drug susceptibility test of virulence gene were performed simultaneously for the standard strain of Escherichia Coli preserved in our laboratory and the strain isolated from the diseased （dead） chickens. The results showed that among the 16 kinds of common antibiotics， penicillin G and vancomycin had no inhibitory effect on 20 strains of Escherichia Coli. Two strains of Escherichia coli isolates were not sensitive to the above 16 kinds of antibiotics， and 17 strains of Escherichia coli were resistant to more than 5 kinds of antibiotics.The 13 strains contained more than 5 virulence factor genes， accounting for 65%.The 4 strains contained 7 virulence factor genes at the same time， accounting for 20%.Only 1 strain did not contain the tested virulence gene. The above results show that the situation of Escherichia coli drug resistance is very serious， and some strains have strong pathogenicity. The results of this experiment also have reference significance for public health protection and preventing drug-resistant strains from entering the human body through the food chain and causing harm.

Key Words：Chicken-derived Escherichia Col;Virulence factor;Drug resistance;Drug sensitive test