枯草芽孢桿菌發(fā)酵玉米黃粉制備可溶性肽

陳丹陽，張振洋，黎劍，王志翠，徐立華，孫付保*

1(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122) 2(紐綏笙特殊醫(yī)用食品江蘇有限公司，江蘇 泰州，225300)

玉米黃粉(corn gluten meal,CGM)是玉米濕法生產(chǎn)淀粉的主要副產(chǎn)物[1]，其蛋白含量高達(dá)60%，是一種具有極大開發(fā)價(jià)值的蛋白資源[2-5]。但由于玉米蛋白不溶于水且氨基酸組成不均衡，目前玉米黃粉在我國主要用于低值粗飼料生產(chǎn)或自然排放，造成蛋白質(zhì)資源的極大浪費(fèi)和環(huán)境污染[6-8]。若將玉米黃粉開發(fā)成玉米肽等高附加值產(chǎn)品，將能大幅度提升玉米深加工企業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益[9]。玉米肽是玉米蛋白經(jīng)過水解得到的分子質(zhì)量小且可溶于水的肽混合物，其組成包含分子質(zhì)量大小不一的玉米多肽、低聚肽以及少量氨基酸?，F(xiàn)代營養(yǎng)學(xué)研究表明與蛋白質(zhì)和氨基酸相比，肽類物質(zhì)特別是低聚肽(分子質(zhì)量≤1 000 Da)更容易被機(jī)體吸收利用[10-11]。

目前制備玉米肽的方法主要有酶解法和微生物發(fā)酵法，其中酶解法是制備玉米肽最常用的方法。陳芳[12]利用堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶雙酶水解底物質(zhì)量濃度為50 g/L的玉米黃粉，得到可溶性肽含量為21 g/L，其中低聚肽含量占比67.1%；楊弈[13]利用微波協(xié)同堿性蛋白酶酶解底物質(zhì)量濃度為90 g/L的玉米蛋白，得到可溶性肽含量為1.71 g/L；張學(xué)忠[14]利用堿性蛋白酶酶解底物質(zhì)量濃度為100 g/L的玉米蛋白，得到可溶性肽含量為26.19 g/L，低聚肽含量占比高達(dá)75%。雖然酶解法已經(jīng)得到廣泛的應(yīng)用，但酶解法制備玉米肽對(duì)原料要求較高，酶制劑價(jià)格高昂，且酶解結(jié)束后玉米肽常出現(xiàn)嚴(yán)重苦味，而去除玉米肽苦味的程序繁瑣且成本較高，這些都限制了酶解法制備玉米肽在發(fā)展中國家的工業(yè)化擴(kuò)大生產(chǎn)。

與酶解法相比，微生物發(fā)酵法是通過微生物發(fā)酵過程中分泌的蛋白酶將原料蛋白水解為小分子肽，是一個(gè)微生物產(chǎn)酶和蛋白水解同步進(jìn)行的過程。在發(fā)酵過程中微生物通過自身的代謝將小肽之間的肽鍵重排轉(zhuǎn)接，對(duì)某些苦味基團(tuán)進(jìn)行修飾、轉(zhuǎn)移和重組，小肽氨基酸又經(jīng)過同化代謝作用，最終轉(zhuǎn)化為具有生物活性的玉米肽[15]。但是，目前國內(nèi)外對(duì)微生物發(fā)酵法制備玉米肽的報(bào)道還很少?；诖?，本文利用產(chǎn)蛋白酶豐富的枯草芽孢桿菌發(fā)酵玉米黃粉制備玉米可溶性肽，建立較優(yōu)發(fā)酵工藝參數(shù)并對(duì)發(fā)酵所得可溶性肽的理化性質(zhì)進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

枯草芽孢桿菌(BacillussubtilusCICC 20030)，中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；玉米黃粉(蛋白含量60%)，購于山東百盛生物科技有限公司；市售玉米肽和市售大豆肽，購于湖北瑞邦生物有限公司；鄰菲羅啉、鄰苯三酚、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼均為分析純，購自美國Sigma公司。

1.2 培養(yǎng)基

菌種活化固體培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨5.0，牛肉浸取物3.0，NaCl 5.0，瓊脂15.0，蒸餾水1.0 L，pH 7.0；

液體種子培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10.0，酵母膏5.0， NaCl 10.0，蒸餾水1.0 L，pH 7.0。

1.3 儀器與設(shè)備

UV-3200型分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司；MICROMAX RF230型離心機(jī)，美國Thermo Fisher公司；HPX-9052MBE型數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；HYL-C3型三層搖床，太倉市強(qiáng)樂實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；chromaster CM5110型日立高效液相色譜儀，日本日立公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 種子液的制備

用接種環(huán)挑取菌種接于裝有50 mL種子培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，在37 ℃、220 r/min的條件下振蕩培養(yǎng)18 h，待用。

1.4.2 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

玉米黃粉發(fā)酵前進(jìn)行脫淀粉處理[16]，脫淀粉玉米黃粉(destarch comgluten meal,DCGM)蛋白含量為80.09%?？莶菅挎邨U菌發(fā)酵DCGM條件為：以發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH 7.0和接種量6%，在溫度37 ℃和轉(zhuǎn)速220 r/min條件下發(fā)酵48 h。

(1)單因素實(shí)驗(yàn)

選擇DCGM添加量分別為10、30、50、70、90 g/L，以篩選最適DCGM添加量?？疾焯荚磿r(shí)，發(fā)酵培養(yǎng)基中DCGM添加量70 g/L，碳源包括葡萄糖、蔗糖、麥芽糖，添加量分別為2、4、6、8、10 g/L。選擇無機(jī)鹽時(shí)，發(fā)酵培養(yǎng)基中添加DCGM 70 g/L和蔗糖8 g/L，分別檢測(cè)NaCl、CaCl2、KCl、MgSO4、 MnSO4等無機(jī)鹽添加量為2、4、6、8、10 g/L時(shí)發(fā)酵48 h的玉米可溶性肽含量。

(2)發(fā)酵培養(yǎng)基的響應(yīng)面優(yōu)化

在上述單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，實(shí)驗(yàn)根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)選擇玉米黃粉添加量(A)、蔗糖添加量(B)、NaCl添加量(C)3個(gè)因子作為自變量，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)基組分優(yōu)化。

1.4.3 培養(yǎng)條件優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)以上述最佳發(fā)酵培養(yǎng)基在接種量6%、發(fā)酵初始pH 7.0、培養(yǎng)溫度37 ℃、轉(zhuǎn)速220 r/min等基礎(chǔ)培養(yǎng)條件下考察發(fā)酵時(shí)間、接種量、發(fā)酵溫度和轉(zhuǎn)速等對(duì)玉米可溶性肽發(fā)酵產(chǎn)量的影響。

(1)單因素實(shí)驗(yàn)

選擇發(fā)酵時(shí)間，在上述發(fā)酵過程中于24、36、48、60、72、84 h取樣檢測(cè)。在選擇發(fā)酵初始pH時(shí)，維持其他條件不變，僅改變發(fā)酵初始pH值分別為6.0、7.0、 8.0、9.0、10.0、11.0。在選擇接種量時(shí)調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基pH值為8.0，僅改變上述基礎(chǔ)發(fā)酵條件接種量分別為2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%。在選擇發(fā)酵溫度時(shí)培養(yǎng)基初始pH 8.0和4%接種量，設(shè)置發(fā)酵溫度分別為29、33、37、41、45 ℃時(shí)研究發(fā)酵溫度對(duì)產(chǎn)玉米可溶性肽含量的影響。選擇發(fā)酵轉(zhuǎn)速時(shí)培養(yǎng)基初始pH 8.0、4%接種量和發(fā)酵溫度37 ℃，分別考察140、180、220、240、260 r/min時(shí)產(chǎn)玉米可溶性肽含量。

(2) 發(fā)酵培養(yǎng)條件的響應(yīng)面優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)接著在上述單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，按照Box-Behnken中心組合試驗(yàn)對(duì)玉米可溶性肽產(chǎn)量影響較大的3個(gè)因素(發(fā)酵時(shí)間(A)、發(fā)酵pH(B)、發(fā)酵溫度(C)為自變量)進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化。

1.4.4 可溶性肽含量的測(cè)定

可溶性肽溶液：將發(fā)酵液進(jìn)行離心分離(8 000 r/min,10 min)，去除玉米黃粉殘?jiān)途w，得到發(fā)酵上清液。將發(fā)酵上清液進(jìn)行適當(dāng)稀釋用于可溶性肽含量的檢測(cè)。采用考馬斯亮藍(lán)顯色法進(jìn)行可溶性肽含量的測(cè)定[17]。

1.4.5 肽分子質(zhì)量分布的測(cè)定

采用高效液相色譜法進(jìn)行分子質(zhì)量分布的測(cè)定。色譜條件：TSK gel 2000 SWXL(7.8 mm×300 mm)色譜柱；檢測(cè)波長：220 nm；流動(dòng)相∶V(乙腈)∶V(水)∶V(三氟乙酸)=40∶60 ∶0.1；流速:0.5 mL/min；柱溫：30 ℃； 進(jìn)樣體積：20 μL。

1.4.6 肽抗氧化活性的檢測(cè)

將本實(shí)驗(yàn)所制備玉米可溶性肽配制成2 g/L的肽溶液，而后進(jìn)行自由基清除能力檢測(cè)以評(píng)估其抗氧化活性。玉米可溶性肽·OH清除能力測(cè)定采用涂勇剛等[18]的方法；O2-·清除能力測(cè)定采用鄰苯三酚自氧化方法，具體操作步驟采用劉建華[19]的方法；DPPH·清除能力測(cè)定方法采用CHEN等[20]的方法。

1.4.7 統(tǒng)計(jì)方法

利用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理，測(cè)定結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基組成對(duì)可溶性肽發(fā)酵產(chǎn)量的影響

2.1.1 發(fā)酵培養(yǎng)基組成的單因素優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基組成中的DCGM添加量、碳源種類及添加量、無機(jī)鹽種類及添加量進(jìn)行了單因素優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1-a～圖1-c。

a-DCGM添加量；b-碳源添加量；c-無機(jī)鹽添加量圖1 發(fā)酵培養(yǎng)基組成對(duì)可溶性肽含量的影響Fig.1 Effect of fermentation medium composition on soluble peptide content

由圖1-a可知，當(dāng)DCGM添加量為90和70 g/L時(shí)，在發(fā)酵過程中可溶性肽含量均優(yōu)于其他水平添加量。其中在發(fā)酵48 h時(shí)可溶性肽含量達(dá)到最高，DCGM添加量為90 g/L時(shí)，可溶性肽含量為1.79 g/L；DCGM添加量為70 g/L時(shí)，可溶性蛋白含量為1.71 g/L，考慮到蛋白轉(zhuǎn)化率和發(fā)酵培養(yǎng)基黏度選擇DCGM添加量為70 g/L。

由圖1-b可知，當(dāng)以蔗糖為碳源且蔗糖的添加量為8 g/L時(shí)，可溶性肽含量達(dá)到4.8 g/L，高于蔗糖其他添加量以及以葡萄糖、麥芽糖為碳源時(shí)可溶性肽含量。因此選擇蔗糖添加量為8 g/L。

由圖1-c可知，當(dāng)添加無機(jī)鹽為CaCl2、KCl、MgSO4、MnSO4時(shí)，發(fā)酵液中可溶性肽含量不足4.0 g/L，與未添加無機(jī)鹽時(shí)可溶性肽含量4.80 g/L相比有所降低，顯示CaCl2、KCl、MgSO4、MnSO4對(duì)DCGM發(fā)酵產(chǎn)可溶性肽均有抑制作用，表明發(fā)酵過程無需添加這些無機(jī)鹽。以NaCl作為無機(jī)鹽時(shí)，NaCl添加量低于5 g/L時(shí)，對(duì)可溶性肽含量的增加有促進(jìn)作用，其中NaCl添加量為1 g/L時(shí)，對(duì)可溶性肽含量的提升促進(jìn)作用最為明顯，此時(shí)可溶性肽含量可達(dá)5.66 g/L；當(dāng)NaCl添加量高于5 g/L時(shí)，可溶性肽含量隨著NaCl添加量的增加而有所下降。因此，實(shí)驗(yàn)選擇NaCl為無機(jī)鹽且添加量為1 g/L。

2.1.2 發(fā)酵培養(yǎng)基組成的響應(yīng)面優(yōu)化

根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原理，進(jìn)行17組發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化試驗(yàn)，結(jié)果見表1。利用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到二次多項(xiàng)回歸方程：Y可溶性肽=-58.84+ 4.16×A+147.35×B-248.79×C-4.02×AB+14.75×AC+210.00×BC-0.14×A2-86.729×B2-1.99×C2。

表1 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Experiments and experimental results of response surface methodology

通過單因素選擇和響應(yīng)面優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)最終得到最佳發(fā)酵培養(yǎng)基的重要組成：DCGM添加量100 g/L，蔗糖添加量8 g/L，NaCl添加量1.5 g/L，此時(shí)得到可溶性肽含量為9.20 g/L。與發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化前相比，可溶性肽產(chǎn)量提升為優(yōu)化前5.38倍。

2.2 培養(yǎng)條件對(duì)可溶性肽發(fā)酵含量的影響

2.2.1 發(fā)酵培養(yǎng)條件的單因素優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)條件中的發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵初始pH、接種量、發(fā)酵溫度及發(fā)酵轉(zhuǎn)速進(jìn)行了單因素優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2-a～圖2-e。

a-發(fā)酵時(shí)間;b-發(fā)酵pH;c-接種量；d-發(fā)酵溫度;e-發(fā)酵轉(zhuǎn)速圖2 發(fā)酵培養(yǎng)條件對(duì)可溶性肽含量的影響Fig.2 Effect of fermentation conditions on soluble peptide content

由圖2-a所示，在發(fā)酵初始階段，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加可溶性肽含量隨之提升；在發(fā)酵36 h可溶性肽含量達(dá)到最高值為10.51 g/L，隨后可溶性肽含量隨著發(fā)酵時(shí)間的增加趨于穩(wěn)定。因此，選擇發(fā)酵時(shí)長為36 h。

由圖2-b所示，在初始pH<8時(shí)，隨著初始pH的增大可溶性肽含量隨之增加；在pH>8時(shí)，隨著培養(yǎng)基初始pH的增大，可溶性肽含量隨之降低；在培養(yǎng)基初始pH=8時(shí)，可溶性肽含量達(dá)到最高為14.23 g/L。 因此，選擇培養(yǎng)基初始pH為8。

由圖2-c所示，在接種量<4%時(shí)，隨著接種量的增大可溶性肽的含量不斷增加；在接種量>4%時(shí)，隨著接種量的增大可溶性肽含量逐漸降低；在接菌量為4%時(shí)，可溶性肽含量達(dá)到最高為15.47 g/L。因此，選擇發(fā)酵接種量為4%。

由圖2-d所示，在發(fā)酵溫度<37 ℃時(shí)，隨著發(fā)酵溫度的增加，可溶性肽的含量不斷增加；在發(fā)酵溫度>37 ℃ 時(shí)，隨著發(fā)酵溫度的增加可溶性肽含量隨之降低，在發(fā)酵溫度為37 ℃時(shí)，可溶性肽含量達(dá)到最高。因此，選擇發(fā)酵溫度為37 ℃。

由圖2-e所示，在發(fā)酵轉(zhuǎn)速<180 r/min時(shí)，隨著轉(zhuǎn)速的增加可溶性肽含量不斷增加；在發(fā)酵轉(zhuǎn)速>180 r/min時(shí)，隨著轉(zhuǎn)速的增加可溶性肽含量逐漸降低；在發(fā)酵轉(zhuǎn)速為180 r/min時(shí)，可溶性肽含量達(dá)到最高，約達(dá)17.5 g/L。因此，選擇發(fā)酵轉(zhuǎn)速為180 r/min。

2.2.2 響應(yīng)面優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)條件結(jié)果

根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原理，進(jìn)行17組發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化試驗(yàn)，結(jié)果見表2。利用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到二次多項(xiàng)回歸方程：Y可溶性肽=-308.04+0.345 93×A+38.595 96×B+8.789 23×C+0.022×AB+0.047×AC-0.071×BC-0.032×A2-2.049×B2-0.140×C2。

表2 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Experiments and experimental results of response surface methodology

目前國內(nèi)對(duì)發(fā)酵法制備玉米肽的研究還較少。祁尼娜等[21]利用納豆芽孢桿菌發(fā)酵底物濃度10%的玉米黃粉，在34 ℃條件下發(fā)酵50 h得到可溶性肽含量為22.15 g/L；牟金秀[22]利用枯草芽孢桿菌發(fā)酵底物濃度5.89%玉米黃粉，在33 ℃條件下發(fā)酵85 h得到可溶性肽含量為22.90 g/L；宋占蘭[23]利用納豆芽孢桿菌發(fā)酵底物濃度13.5%玉米黃粉，在32 ℃條件下發(fā)酵42 h得到可溶性肽含量為12.84 g/L。與以上研究相比，本實(shí)驗(yàn)所制備玉米肽的方法具有發(fā)酵可溶性肽產(chǎn)量較高，發(fā)酵耗時(shí)較短和發(fā)酵效率高的優(yōu)勢(shì)。

2.3 玉米可溶性肽的理化性質(zhì)分析

2.3.1 分子質(zhì)量分布

表3分析檢測(cè)最佳發(fā)酵條件下制備的玉米可溶性肽分子質(zhì)量分布。該可溶性肽中分子質(zhì)量<1 000 Da低聚肽含量較高，占總肽含量的76.36%。相似地，陳芳[12]、張學(xué)忠[14]和權(quán)文吉[24]利用酶法所制備玉米肽中低聚肽含量占比分別為67.1%、75%和63%。與這些報(bào)道相比，本實(shí)驗(yàn)利用發(fā)酵法制備的玉米肽在低聚肽含量上處于較高水平。

表3 可溶性肽分子質(zhì)量分布Table 3 Soluble peptide molecular weight distribution

2.3.2 玉米可溶性肽抗氧化活性檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)接著對(duì)所制備玉米肽進(jìn)行抗氧化活性(·OH、O2-· 及DPPH·清除能力)檢測(cè)，結(jié)果見表4。發(fā)酵法所制備的玉米肽對(duì)·OH清除率為99.31%、O2-·清除率為58.38%和DPPH·清除率為80.27%。與市售玉米肽和大豆肽相比，發(fā)酵玉米肽對(duì)3種自由基清除能力均優(yōu)于市售玉米肽和大豆肽。該分析顯示，發(fā)酵制備的玉米肽具有很高的抗氧化性，意味著該活性肽可能具有重要的生理功能，值得將來進(jìn)一步研究。

表4 抗氧化能力的檢測(cè)Table 4 Determination of antioxidant activity of peptides

3 結(jié)論

經(jīng)過對(duì)玉米黃粉添加量、碳源及無機(jī)鹽種類和添加量、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵pH、接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵轉(zhuǎn)速等相關(guān)因素的單因素和響應(yīng)面綜合試驗(yàn)，確定利用枯草芽孢桿菌CICC20030發(fā)酵生產(chǎn)可溶性肽的最佳發(fā)酵條件為：玉米黃粉添加量100 g/L，蔗糖添加量8 g/L，NaCl添加量1.0 g/L，發(fā)酵時(shí)間42 h，培養(yǎng)基初始pH 9.0，發(fā)酵溫度37 ℃，接種量4%，發(fā)酵轉(zhuǎn)速 180 r/min。在此條件下得到的可溶性肽含量為22.7 g/L， 是優(yōu)化前產(chǎn)量的8倍。在最佳發(fā)酵條件下所制備的玉米肽中低聚肽含量較高，占玉米肽總含量的76.36%。同時(shí)對(duì)最佳發(fā)酵條件下所制備的玉米肽清除·OH、O2-·、DPPH·的能力進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)其對(duì)3種自由基的清除能力分別為99.31%、58.38%、80.27%，對(duì)3種自由基的清除能力均優(yōu)于市售玉米肽及市售大豆肽。