應用高通量測序分析云南昭通不同栽培模式蘋果園根際土壤微生物種群

許姍姍，楊光柱，闞 望，孔寶華*，李 毅，馬 鈞*，李云國，蔡兆翔，譚安超，曹克強

(1.云南農(nóng)業(yè)大學植物保護學院，云南 昆明 650201；2.云南省農(nóng)業(yè)科學院園藝作物研究所，云南 昆明 650205；3.昭通市水果技術(shù)推廣站，云南 昭通 657000；4.河北農(nóng)業(yè)大學植物保護學院/國家蘋果產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系病蟲害防控研究室，河北 保定 071001)

1 材料與方法

1.1 土樣的采集

選取云南魯?shù)榭h文屏鎮(zhèn)硯池山村閘上(N27°08′57.54″、E103°31′48.30″)、魯?shù)榭h桃源鄉(xiāng)大水塘村(N27°11′01.05″、E103°38′01.47″)、昭陽區(qū)蘇家院鎮(zhèn)順山海升公司的蘋果果園(N27°17′32.64″、E103°31′46.81″)。3種不同果園：粗放果園、普通果園、精品果園。

于 2016年7-8月在供試3個果園內(nèi)分別選擇5株蘋果樹采集土壤，采用5點取樣法，去除土壤表層的腐殖質(zhì)，在距樹干基部0.5 m 處分別設(shè)置5個取樣點，每份約300 g，過2 mm 篩后；分裝，液氮中冷凍 3～4 h，然后轉(zhuǎn)移至-80 ℃ 或液氮中長期保存，干冰運輸至百邁克生物公司(BioMarker)進行DNA提取與測序，并在云南三標農(nóng)林科技有限公司檢測各項理化性質(zhì)。

1.2 土壤理化性質(zhì)測定

高溫外加熱重鉻酸鉀氧化容量法測定土壤有機質(zhì)，紫外分光光度校正因數(shù)法測定硝態(tài)氮，2 mol/L KCl 浸提-靛酚藍比色法測定銨態(tài)氮，濾紙條法測定有效磷，乙酸銨浸提-火焰光度計法測定速效鉀，磷鉬酸比色法測定蔗糖酶活性(以24 h后1 g土中含葡萄糖的毫克數(shù)表示)，3、5-二硝基水楊酸比色法測定纖維素酶活性(以24 h后1 g土中含葡萄糖的毫克數(shù)表示)，苯酚鈉-次氯酸鈉比色法測定脲酶活性(以24 h后1 g土中含NH3-N的毫克數(shù)表示)，磷酸苯二鈉比色法測定堿性磷酸酶活性(以24 h后1 g土釋放的酚的毫克數(shù)表示)，高錳酸鉀滴定法測定過氧化氫酶活性(以1 g土消耗0.1 mol/L KMnO4的毫升數(shù)表示)，采用水浸提電位法測定pH，水土比為2.5∶1[8]。

1.3 土壤微生物高通量多樣性測序分析

使用DNA提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)，提取樣品土壤微生物總DNA。

根據(jù)保守區(qū)設(shè)計得到引物，細菌主要是基于16S區(qū)，真菌主要基于18S區(qū)或ITS區(qū)(內(nèi)轉(zhuǎn)錄間區(qū))設(shè)計通用引物。采用細菌通用引物515F/806R ( F5’-AYTGGGYDTAAAGNG-3’，R5’-AYTGGGYDTAAAGNG -3’)，以DNA為模板，擴增16srDNA的V4可變區(qū)片段。同時采用真菌ITS1-ITS2區(qū)通用引物ITS1F/ITS2(5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’，5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’)，在引物末端加上測序接頭，以樣本DNA為模板，進行PCR擴增并對其產(chǎn)物進行純化、定量和均一化形成測序文庫，建好的文庫先進行文庫質(zhì)檢，質(zhì)檢合格的文庫基于Illumina HiSeq 2500測序平臺，利用雙末端測序(Paired-End)的方法，構(gòu)建小片段文庫進行測序。通過對 Reads 拼接過濾，使用QIIME[1](version 1.8.0)軟件中的UCLUST對Tags在97 %的相似度水平下進行OTUs(Operational Taxonomic Units)聚類，并基于Silva(細菌)和UNITE(真菌)分類學數(shù)據(jù)庫對OTU進行分類學注釋和多樣性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 三類蘋果園土壤理化性質(zhì)

土壤理化性質(zhì)檢測結(jié)果(表1)表明在3種不同栽培模式蘋果園采集的根際土壤中有機質(zhì)、硝態(tài)氮、銨態(tài)氮、有效磷、速效鉀、蔗糖酶、纖維素酶、脲酶的含量均是普通果園和精品果園高于粗放果園，且差異較大，只有pH、堿性磷酸酶和過氧化氫酶的含量為粗放果園高于普通果園和精品果園，粗放果園pH呈中性，普通果園和精品果園的pH呈酸性，差異較大?？傮w來說，普通果園和精品果園的土壤狀況優(yōu)于粗放果園。

表1 三類栽培模式果園的土壤理化性質(zhì)

2.2 三類蘋果園操作分類單元OTUs(Operational Taxonomic Units)檢測到土壤微生物的物種數(shù)量

在97 %的相似度水平下，得到每個樣品的OTU個數(shù)(圖1)，精品果園根際土所含細菌、真菌的種水平上的微生物數(shù)量均最多，普通果園次之，粗放果園最少，同一果園不同樣本之間存在差異。

2.3 三類蘋果園根際土壤微生物的主要門

對三類栽培模式蘋果園根際土壤細菌物種進行分析，共同高頻檢測到Proteobacteria、Acidobacteria、Actinobacteria、Chloroflexi、Gemmatimonadetes、Bacteroidetes、Firmicutes、Verrucomicrobia優(yōu)勢細菌門與Ascomycota、Mortierellomycota、Basidiomycota、Chytridiomycota、Cercozoa、Glomeromycota優(yōu)勢真菌門。

2.4 三類果園根際土壤微生物的主要屬與種

在屬水平上對樣品和OTU 類型(樣品所含菌屬)進行聚類，對聚類后各樣品中不同OTU(不同菌屬)所含序列的豐度作熱圖(圖2～3，見封3)。結(jié)果顯示普通果園與精品果園高頻檢測出的細菌屬菌群親緣關(guān)系比較接近，而粗放果園高頻檢測出的細菌屬菌群差別較大， 親緣關(guān)系較遠。

粗放果園、普通果園與精品果園的高頻檢出的真菌屬的種群總體為親緣關(guān)系相近的真菌屬在聚在同一個果園，然而精品果園高頻檢測到的真菌屬種群親緣關(guān)系更遠。3類果園根際土壤中的真菌種群各不相同。

3類果園檢測到的細菌與真菌種(表2)各不相同，具有特有的細菌與真菌種，只有粗放果園與普通果園存在Verticilliumdahliae、Verticilliumleptobactrum2個共同的真菌屬不同的種。

3 討 論

研究表明普通果園與精品果園高頻檢測到的細菌屬菌群親緣關(guān)系比較接近，而粗放果園高頻檢測到的細菌屬菌群差別較大，親緣關(guān)系較遠。

粗放果園、普通果園與精品果園的高頻檢測到的真菌屬的種群總體為親緣關(guān)系相近的真菌屬聚在同一個果園，但是精品果園高頻檢測到的真菌屬種群親緣關(guān)系更遠，結(jié)果表明栽培模式與真菌菌群相關(guān)，精品果園栽培模式更有利于根際土壤微生物多樣性。在3種不同栽培模式蘋果園采集的根際土壤理化性質(zhì)不同，栽培方式影響土壤理化性質(zhì)，從而影響微生物種群，最終影響蘋果生長與健康。

在3種果園中，均能檢測到植物致病菌，如粗放果園的Plenodomus-biglobosus[9]，普通果園的Paraphoma-chrysanthemicola與Aspergillus-sydowii等[10-11]，精品果園的Nigrospora-oryzae等；也能檢測到有益微生物、生物防治菌，內(nèi)生菌等，如粗放果園的Thiobacillusspp.、Pseudomanosspp.、Flavobacteriumspp.[12-13]，Minimedusa-polyspora[14]Glomus-aggregatum[15]與Funneliformisspp.[16]等，普通果園的Aspergillus-niger[17]、Phialocephala-fortinii[18]等，精品果園的Bacillus-coagulans[19]、Debaryomycesspp.[20]等，能夠降低土壤中可交換鈉的含量，促進土壤中鹽分的滲出，降解土壤有害物質(zhì)。從粗放果園高頻檢測到生物防治菌對植物生長的促進作用。此外，還分離到一些環(huán)境微生物、昆蟲病原菌及人類致病菌。此外，實驗還檢測到Torula-hollandica、Torula-masonii、Mortierella-sarnyensis等的微生物，對其生態(tài)功能值得今后研究。粗放果園中的有益微生物Thiobacillus、Pseudomanos、Flavobacterium、Mortierella、Minimedusa、Funneliformis，其中Thiobacillus在普通果園中也存在，Pseudomanos、Flavobacterium、Mortierella、Minimedusa、Funneliformis在普通果園和精品果園中均有存在，分布較為廣泛；有害微生物Plenodomus在精品果園中也有存在。普通果園的有益微生物Aspergillus、Phialocephala在精品果園中存在，有害微生物Erysiphe、Verticillium、Fusicladium在普通、精品果園中均有存在。精品果園中有益微生物Bacillus、Debaryomyces在普通、精品果園均有存在；有害微生物Nigrospora在粗放果園中存在。其他檢測到的微生物在3類果園中均有存在。3類果園土壤中微生物均存在拮抗或者協(xié)同關(guān)系，值得今后進一步研究。

續(xù)表2 Continued table 2

果園類型Orchard type細菌屬名Genus of bacteria細菌種名Species of bacteria果園類型Orchard type真菌屬名Genus of fungi真菌種名Species of fungiLeucoagaricusLeucoagaricus-leucothitesCladophialophoraCladophialophora-chaetospiraFusicladiumunidentifiedSpirosphaeraSpirosphaera-carici-graminisNaganishiaUnknown精品果園Boutique orchardBacillusBacillus-coagulans;bacterium精品果園Boutique orchardDactylonectriaDactylonectria-anthuriicolaEscherichia-ShigellabacteriumDiutinaDiutina-catenulataPeptoclostridiumbacteriumParaglomusUnknownCaenimonasbacteriumThielaviaunidentifiedNitrosospiraNitrospira-sp.PyrenochaetopsisPyrenochaetopsis-leptosporaMycosphaerellaMycosphaerella-tassianaTrichocladiumTrichocladium-opacumParaphaeosphaeriaunidentifiedDebaryomycesUnknownNigrosporaNigrospora-oryzaePlectosphaerellaPlectosphaerella-cucumerinaCercophoraCercophora-samalaPhallusPhallus-rugulosusPleurotusUnknownHelicomaunidentified

云南昭通果園土壤微生物與中國渤海灣蘋果土壤微生物比較，有些菌群相同，有些不同。 渤海灣蘋果根際土壤中主要有Verticillium、Xanthomadaceae、Pseudomonas、Bacillium及Arthrobacterium、Chaetomium等具有拮抗作用的微生物[5]。在巴西蘋果園根際土壤之中也有Pseudomonas、Rhodanobacter屬的菌群[7]。云南昭通優(yōu)勢菌群也有Bacillium、Pseudomonas屬的菌群，表明這兩個屬的菌群具有更廣泛的適應性。在云南蘋果園根際土壤高頻檢測到的Arenimonas、Lactobacillus、Rhodanobacter、Edaphobacter、Sulfuriferula、Thiobacillus、Pseudomanos、Altererythrobacter、Flavobacterium、Staphylococcus、Terrimonas、Bacteroides、Crossiella、Pedobacter、Thermomonas、Massilia、Sphingopyxis、Acidiphilium、Modestobacter、Ktedonobacter、Bacillus、Escherichia-Shigella、PeptoclostridiumCaenimonas、Nitrosospira等為云南昭通特有的菌群，在巴西蘋果園并未檢測到，值得今后進一步關(guān)注。

4 結(jié) 論

研究結(jié)果為中國南方蘋果果樹栽培和果園管理以及生物菌肥的使用提供依據(jù)，為云南昭通蘋果園根際土壤有益微生物的研究與應用奠定基礎(chǔ)。