PPAR-γ受體激動(dòng)劑羅格列酮對(duì)兔準(zhǔn)分子激光角膜切削術(shù)后角膜上皮下霧狀混濁的影響△

隋文君 高洪蓮 劉奇奇 張磊

準(zhǔn)分子激光角膜切削術(shù)(photorefractive keratectomy，PRK)自1983年由Trokel發(fā)明至今，經(jīng)過不斷改良，以及圍手術(shù)期處理的不斷改善，以其安全高效、無角膜瓣并發(fā)癥困擾、可個(gè)體化等優(yōu)勢(shì)而被廣泛應(yīng)用[1]。PRK術(shù)后，不同程度的角膜下霧狀混濁(haze)、術(shù)后疼痛、視力恢復(fù)時(shí)間長等并發(fā)癥也受到廣泛關(guān)注。Haze的形成是PRK術(shù)后角膜基質(zhì)細(xì)胞纖維化、膠原纖維排列紊亂導(dǎo)致的[2]，目前臨床控制PRK術(shù)后haze形成的藥物主要有絲裂霉素、類固醇激素等，但可引起激素性高眼壓、淺層點(diǎn)狀角膜炎、輕度的前房炎癥等[3]。羅格列酮為過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARγ)激動(dòng)劑，為噻唑烷二酮類的降糖藥，在一些研究中發(fā)現(xiàn)，PPARγ配體可以通過轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)/Smad通路改善內(nèi)臟和皮膚等纖維化程度[4-6]。本研究通過探討haze的形成機(jī)制，明確PPARγ受體激動(dòng)劑羅格列酮是否可以改善角膜纖維化的程度，進(jìn)而抑制PRK術(shù)后haze的形成。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組健康普通級(jí)新西蘭大白兔64只(濟(jì)南西嶺角養(yǎng)殖繁育中心提供)，雌雄不限，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，裂隙燈顯微鏡排除眼前節(jié)疾病，隨機(jī)分為28 μmol·L-1羅格列酮組、14 μmol·L-1羅格列酮組、1 g·L-1二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)+生理鹽水組、單純PRK組，每組16只(16眼)。本研究遵守濱州醫(yī)學(xué)院動(dòng)物管理委員會(huì)的動(dòng)物福利倫理要求(編號(hào)：20180209-03)。

1.1.2 主要試劑及儀器DAB顯色試劑盒(DA1015)、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)(D8370，北京索萊寶生物科技有限公司)，羅格列酮(R2408，美國Sigma-Aldrich公司)，3 g·L-1氧氟沙星眼膏(沈陽興齊眼藥股份有限公司)，4 g·L-1鹽酸奧布卡因滴眼液(日本參天制藥株式會(huì)社)；小鼠抗兔TGF-β1單克隆抗體(ab190503，150)、小鼠抗兔α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)單克隆抗體(ab7817，1100)、小鼠抗兔基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinases-2，MMP-2)單克隆抗體(ab2462，1100，英國Abcam公司)；辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG H+L(ZB-2305，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；準(zhǔn)分子激光儀VISA STAR S4(美國AMO公司)；裂隙燈顯微鏡(BQ-900，瑞士Haag-Streit公司)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型制作普通級(jí)新西蘭大白兔64只(64眼)，30 g·L-1戊巴比妥鈉經(jīng)耳緣靜脈推注行全身麻醉，4 g·L-1鹽酸奧布卡因滴眼液滴眼行表面麻醉成功后行右眼PRK手術(shù)，激光參數(shù)：采用準(zhǔn)分子激光治療性角膜切削術(shù)(phototherapeutic keratectomy，PTK)去除上皮，角膜中央?yún)^(qū)切削直徑6.0 mm，切削厚度100 μm。術(shù)后平衡鹽溶液(復(fù)方氯化鈉注射液，山東齊都藥業(yè)有限公司)沖洗角膜，吸水海綿吸干角膜表面水分，繃帶式角膜接觸鏡(Pure Vision，美國Bausch & Lomb公司)覆蓋右眼，3 g·L-1氧氟沙星眼膏滴眼，每天3次，每次1滴。各組分別給予28 μmol·L-1羅格列酮、14 μmol·L-1羅格列酮、1 g·L-1DMSO+生理鹽水滴眼，每天3次，每次1滴；單純PRK組未行任何特殊處理。PRK術(shù)后 7 d、28 d，各組分別處死8只(8眼)兔，取角膜固定、包埋制作4 μm石蠟切片。

1.2.2 羅格列酮滴眼液的配制DMSO助溶羅格列酮，配制為28 mmol·L-1原液，在無菌操作下分別用生理鹽水稀釋為14 μmol·L-1羅格列酮滴眼液、28 μmol·L-1羅格列酮滴眼液，DMSO含量1 g·L-1，4 ℃ 分裝保存于高壓滅菌后的2 mL離心管(MCT-200-C，美國Axygen生物技術(shù)有限公司)中，PRK術(shù)后采用2 mL一次性無菌巴氏吸管(318112，無錫耐思生物科技有限公司)給藥，每天3次，每次1滴。

1.2.3 術(shù)后眼前節(jié)觀察及處理PRK術(shù)后每天用裂隙燈顯微鏡觀察角膜上皮愈合情況并用前節(jié)照相記錄術(shù)后7 d、28 d haze情況，行 Fantes 分級(jí)：0級(jí)：角膜完全透明；0.5級(jí)：裂隙燈斜照法可見輕度角膜混濁；1級(jí)：裂隙燈直照法可見輕度角膜混濁，不影響觀察虹膜紋理；2級(jí)：裂隙燈直接聚焦可見角膜輕度混濁，影響觀察虹膜紋理；3級(jí)：角膜中度混濁，明顯影響觀察虹膜紋理；4級(jí)：角膜重度混濁，無法透見虹膜紋理[7]。

1.2.4 免疫組織化學(xué)法檢測角膜TGF-β1、α-SMA及MMP-2的表達(dá)取PRK術(shù)后7 d、28 d的角膜石蠟切片，經(jīng)脫蠟、復(fù)水，高壓修復(fù)抗原、封閉后，分別滴加小鼠抗兔一抗TGF-β1、α-SMA及MMP-2孵育，沖洗后滴加辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠二抗孵育，行DAB顯色，角膜中出現(xiàn)棕黃色著染即為陽性。蘇木素染色、脫水、透明后封片，于光學(xué)顯微鏡下觀察角膜組織陽性表達(dá)，每張切片選擇3個(gè)視野，通過IPP圖像分析系統(tǒng)采集圖像并測量平均吸光度(A)值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。所有數(shù)據(jù)經(jīng)Shapiro-Wilk檢驗(yàn)呈正態(tài)分布，經(jīng)Levene檢驗(yàn)符合方差齊性，均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。各組PRK術(shù)后角膜上皮完全愈合時(shí)間行方差分析F檢驗(yàn)；PRK術(shù)后7 d、28 d的haze分級(jí)和TGF-β1、α-SMA、MMP-2的平均A值應(yīng)用單因素方差分析，組間多重比較行LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 角膜上皮愈合時(shí)間PRK術(shù)后每天采用裂隙燈觀察兔眼，各組角膜上皮于3～4 d愈合，角膜上皮愈合時(shí)間比較，組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

2.2 Haze分級(jí)PRK術(shù)后7 d、28 d，各組角膜均出現(xiàn)不同程度haze，其中28 μmol·L-1羅格列酮組haze最輕；14 μmol·L-1羅格列酮組次之，明顯輕于1 g·L-1DMSO+生理鹽水組與單純PRK組。PRK術(shù)后7 d、28 d時(shí)，各組角膜haze分級(jí)組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)，除1 g·L-1DMSO+生理鹽水組與單純PRK組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)外，其余組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)，見表1、圖1。

2.3 免疫組織化學(xué)法檢測角膜中TGF-β1、α-SMA、MMP-2表達(dá)PRK術(shù)后7 d，各組均出現(xiàn)TGF-β1、α-SMA、MMP-2表達(dá)(圖2-圖4)，在1 g·L-1DMSO+生理鹽水組及單純PRK組中呈中等陽性，其次為14 μmol·L-1羅格列酮組，28 μmol·L-1羅格列酮組最輕，呈弱陽性；PRK術(shù)后28 d，各實(shí)驗(yàn)組TGF-β1、α-SMA、MMP-2表達(dá)增強(qiáng)。PRK術(shù)后7 d、28 d時(shí)，TGF-β1、α-SMA、MMP-2表達(dá)組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)，其中除1 g·L-1DMSO+生理鹽水組與單純PRK組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)外，其余組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)，見表1。

圖1 各組兔眼術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)觀察角膜haze情況。術(shù)后7 d：單純PRK組角膜見輕度haze(A)，1 g·L-1DMSO+生理鹽水組角膜見輕度haze(B)，14 μmol·L-1羅格列酮組角膜見微量haze(C)，28 μmol·L-1羅格列酮組角膜見少許haze(D)；術(shù)后28 d：單純PRK組角膜見中度haze(E)，1 g·L-1DMSO+生理鹽水組角膜見中度haze(F)，14 μmol·L-1羅格列酮組角膜見輕度haze(G)，28 μmol·L-1羅格列酮組角膜見少許haze(H)

圖2 免疫組織化學(xué)檢測兔術(shù)區(qū)角膜α-SMA的表達(dá)(DAB，×400)。術(shù)后7 d：單純PRK組(A)，1 g·L-1 DMSO+生理鹽水組(B)，14 μmol·L-1羅格列酮組(C)，28 μmol·L-1羅格列酮組(D)；術(shù)后28 d：單純PRK組(E)，1 g·L-1DMSO+生理鹽水組(F)，14 μmol·L-1羅格列酮組(G)，28 μmol·L-1羅格列酮組(H)

圖3 免疫組織化學(xué)檢測兔術(shù)區(qū)角膜TGF-β1的表達(dá)(DAB，×400)。術(shù)后7 d：單純PRK組(A)，1 g·L-1 DMSO+生理鹽水組(B)，14 μmol·L-1羅格列酮組(C)，28 μmol·L-1羅格列酮組(D)；術(shù)后28 d：單純PRK組(E)，1 g·L-1DMSO+生理鹽水組(F)，14 μmol·L-1羅格列酮組(G)，28 μmol·L-1羅格列酮組(H)

表1 PRK術(shù)后各組角膜上皮愈合時(shí)間、haze分級(jí)、平均A值比較

3 討論

PRK術(shù)后haze的形成主要是由TGF-β1介導(dǎo)的角膜基質(zhì)細(xì)胞纖維化的過程，是角膜創(chuàng)傷愈合及細(xì)胞凋亡的結(jié)果。haze導(dǎo)致了PRK術(shù)后角膜透明性的下降以及屈光回退的發(fā)生。PRK術(shù)后角膜細(xì)胞凋亡，角膜基質(zhì)細(xì)胞在TGF-β1等細(xì)胞因子的作用下轉(zhuǎn)化為角膜成纖維細(xì)胞，分化為角膜肌成纖維細(xì)胞，TGF-β1為這一過程的關(guān)鍵調(diào)控因子[8-10]。肌成纖維細(xì)胞特征性地表達(dá)α-SMA[11]，并促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的大量合成。MMP-2作為ECM重建所必需的細(xì)胞因子，由成纖維細(xì)胞產(chǎn)生，為Ⅳ型膠原酶，可降解基質(zhì)主要骨架蛋白，并促使膠原纖維排列紊亂[12]，ECM也可反向促進(jìn)肌成纖維細(xì)胞增生，膠原的新生與降解失去平衡，膠原纖維排列紊亂，從而形成haze。本研究結(jié)果顯示，PRK術(shù)后7 d，各組均產(chǎn)生不同程度的haze，TGF-β1、α-SMA、MMP-2在角膜中表達(dá)；PRK術(shù)后28 d，haze較前加重，同時(shí)角膜中TGF-β1、α-SMA、MMP-2的表達(dá)增加，與haze的嚴(yán)重程度相一致。由此證明，在haze的發(fā)生發(fā)展過程中，TGF-β1、α-SMA、MMP-2等細(xì)胞因子發(fā)揮了重要作用。

PPARs是一種轉(zhuǎn)錄因子，屬于配體活化型核受體超家族成員，通過被配體激活，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞功能，可分為PPARα、PPARβ和PPARγ三種亞型。在近幾年的研究中顯示，激活PPARγ可以有效抑制眼部組織纖維化，進(jìn)而用于眼結(jié)膜、角膜瘢痕化的治療[13-14]，羅格列酮為PPAR-γ的合成型配體，可以激活PPAR-γ發(fā)揮作用。有研究顯示，應(yīng)用PPAR-γ激動(dòng)劑羅格列酮干預(yù)人眼Tenon囊成纖維細(xì)胞后，可以抑制TGF-β1的表達(dá)[15]。Huxlin等[16]在對(duì)角膜抗瘢痕藥物的研究中證實(shí)，局部應(yīng)用羅格列酮可以減輕貓角膜的瘢痕形成，抑制TGF-β1和α-SMA的表達(dá)；本研究發(fā)現(xiàn)，PRK術(shù)后給予羅格列酮滴眼，角膜haze較1 g·L-1DMSO+生理鹽水組及單純PRK組明顯減輕，TGF-β1、α-SMA、MMP-2的表達(dá)均受到抑制，這與Huxlin等[16]研究結(jié)果相一致。另外，有研究顯示，不同濃度羅格列酮對(duì)人眼Tenon囊成纖維細(xì)胞TGF-β1的抑制作用存在差異，高濃度抑制作用強(qiáng)于低濃度[15]，本研究結(jié)果同樣證實(shí)了這一觀點(diǎn)，我們發(fā)現(xiàn)在PRK術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)，28 μmol·L-1羅格列酮組角膜中TGF-β1的表達(dá)低于14 μmol·L-1羅格列酮組，提示羅格列酮對(duì)PRK術(shù)后haze的抑制作用存在濃度依賴性。

綜上所述，PRK術(shù)后haze的形成是多種細(xì)胞因子共同參與的復(fù)雜過程，TGF-β1介導(dǎo)的角膜肌成纖維細(xì)胞增生紊亂是haze的始發(fā)因素之一，α-SMA、MMP-2等因子相繼促進(jìn)了haze的發(fā)展，TGF-β1介導(dǎo)角膜基質(zhì)細(xì)胞纖維化的過程主要通過細(xì)胞內(nèi)Smad信號(hào)通路介導(dǎo)[17]，Smad蛋白作為TGF-β1受體的細(xì)胞內(nèi)激酶底物，介導(dǎo)TGF-β1細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，分為激活型、輔助型以及抑制型Smad，其中Smad 2、Smad 3為激活型蛋白，Smad 7為抑制型蛋白[18]。兔PRK術(shù)后應(yīng)用PPAR-γ受體激動(dòng)劑羅格列酮可以有效抑制角膜TGF-β1、α-SMA、MMP-2的表達(dá)，減少haze的形成，并且呈濃度依賴性。其機(jī)制可能與競爭性抑制TGF-β1/Smad通路介導(dǎo)促纖維化作用有關(guān)，其他動(dòng)物器官纖維化的研究提示，TGF-β1/Smad發(fā)揮細(xì)胞效應(yīng)需要募集輔活化因子P300，與Smad 2、Smad 3及靶基因結(jié)合從而調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄，發(fā)生纖維化過程；PPARγ在胞內(nèi)通過與配體結(jié)合激活時(shí)，也需要與P300結(jié)合，引起靶基因轉(zhuǎn)錄，而TGF-β1/Smad通路與PPAR-γ通路共用的輔活化因子P300在細(xì)胞內(nèi)數(shù)量有限，因此存在競爭-抑制現(xiàn)象[19-24]。但是，PPAR-γ與TGF-β1/Smad通路間的具體作用機(jī)制尚未完全清楚，羅格列酮給藥濃度界限也需要通過進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行明確，我們會(huì)在接下來的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步研究。