TBX15基因啟動(dòng)子甲基化在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及其功能研究

龐婷 劉順 仇小強(qiáng) 李沭 秦小玲 李柯樺 劉美良 伍柳玉 曾小云

作者單位：530021 南寧 廣西醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)學(xué)教研室

人類 TBX15（T-box transcription factor 15，TBX15）是T-box基因家族的成員之一，其編碼的生物蛋白是一種對(duì)疾病發(fā)展至關(guān)重要的轉(zhuǎn)錄因子［1］。大量研究表明，轉(zhuǎn)錄因子TBX15的甲基化水平可能影響人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展，如卵巢癌［2］、乳腺癌［3］、甲狀腺癌［4］、前列腺癌［5］和腎細(xì)胞癌［6］等，然而TBX15基因與肝細(xì)胞癌（簡(jiǎn)稱“肝癌”）發(fā)生發(fā)展關(guān)系的研究尚未見報(bào)道。全基因組DNA甲基化分析表明，TBX15在肝癌中高度甲基化且表達(dá)下調(diào)［7］。本課題組利用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)的肝癌數(shù)據(jù)對(duì)TBX15基因進(jìn)行生物信息學(xué)整合分析也發(fā)現(xiàn)，TBX15基因在肝癌中啟動(dòng)子的甲基化程度與mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，且與肝癌患者預(yù)后相關(guān)，據(jù)此推測(cè)TBX15基因可能在肝癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。本研究通過分析不同肝癌細(xì)胞系中TBX15基因啟動(dòng)子甲基化對(duì)mRNA表達(dá)的調(diào)控及對(duì)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，以進(jìn)一步了解該基因在肝癌發(fā)生發(fā)展中的調(diào)控機(jī)制，為肝癌的精準(zhǔn)治療提供新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

人肝癌細(xì)胞株HepG2、MHCC97H和SNU449購(gòu)自廣州賽庫(kù)生物技術(shù)有限公司；TBX15及GAPDH引物由廣州英贊生物科技有限公司合成；Lipofectamine 2000 Transfection Reagent購(gòu)自上海博耀生物科技有限公司；SYBR Premix Ex TaqⅡ試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司；0.25%胰蛋白酶及CCK-8試劑盒購(gòu)自北京智杰方遠(yuǎn)科技有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR（ABI StepOne Plus）儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司；凝膠成像系統(tǒng)（JS-1075）購(gòu)自上海培清科技有限公司；倒置熒光顯微鏡（CKX41）購(gòu)自日本Olympus公司。

1.2 構(gòu)建TBX15過表達(dá)載體

根據(jù)UCSC基因組生物信息庫(kù)查找TBX15基因的序列，對(duì)TBX15基因序列及pcDNA3.1（+）載體序列進(jìn)行分析，以人脂肪干細(xì)胞mRNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，PCR擴(kuò)增基因序列，將目的基因片段構(gòu)建到pcDNA3.1（+）載體中，再用KpnI和XbaI對(duì)上述PCR產(chǎn)物和載體進(jìn)行雙酶切，反應(yīng)條件：37℃水浴，30 min；80℃滅活，10 min。酶切后按照Axygen純化試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行產(chǎn)物純化，將酶切產(chǎn)物與T載體進(jìn)行連接和轉(zhuǎn)化，取菌液均勻涂在平板上，于37℃培養(yǎng)12 h。選取上述平板上的單菌落，送測(cè)序公司測(cè)序，進(jìn)行下一步鑒定。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

人肝癌細(xì)胞株HepG2、MHCC97H和SNU449培養(yǎng)于含1%雙抗的DMEM培養(yǎng)液和10%胎牛血清中，培養(yǎng)條件：5%CO2、37℃，飽和濕度，每2~3 d換液傳代1次。按照Lipofectamine 2000 Transfection Reagent轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書將空白質(zhì)粒、空載質(zhì)粒pc3.1及TBX15過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至肝癌SNU449細(xì)胞。分別將5 μg DNA 和 15 μL Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑與500 μL Opti-MEM培養(yǎng)基混勻。再把上述2管溶液混合為轉(zhuǎn)染復(fù)合物，室溫靜置孵育10 min。將孵育后的轉(zhuǎn)染復(fù)合物均勻加入培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)6 h后換成完全培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)2~4 d后提取RNA，采用qPCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后3組質(zhì)粒細(xì)胞的mRNA表達(dá)水平，收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)功能實(shí)驗(yàn)。

1.4 亞硫酸氫鹽測(cè)序法檢測(cè)肝癌細(xì)胞中TBX15的甲基化狀態(tài)

提取 HepG2、MHCC97H和 SNU449肝癌細(xì)胞DNA，按照 EpiTect Fast DNA Bisulfite Kit（QIAGEN）試劑盒說(shuō)明書對(duì)DNA進(jìn)行亞硫酸氫鹽修飾。利用Methprimer在線預(yù)測(cè)CpG島軟件設(shè)計(jì)引物，外側(cè)（-489~23 bp，516 bp） 上游引物序列：TGTTGTAAGGTGGGAGAGTTGATTT，下游引物序列：AAAACCATAACTTTCCCAACCAAC；內(nèi)側(cè)（-364~-92 bp，277 bp）上游引物序列：TATGATTGGTTTGTTTGGTTTTTTAG，下游引物序列：CTAACCATTCTTAATTCCCACACCT。配制反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件：95℃5 min，95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，30 個(gè)循環(huán)，72 ℃ 5 min。按照Axygen凝膠純化試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行PCR產(chǎn)物純化，回收片段。將目的片段DNA與線性化載體連接和轉(zhuǎn)化，取菌液均勻涂在平板上，于37℃過夜培養(yǎng)。選取上述平板上的單菌落，送測(cè)序公司測(cè)序進(jìn)行下一步鑒定。

1.5 qPCR檢測(cè)不同肝癌細(xì)胞中TBX15 mRNA的表達(dá)

按照Qiagen試劑盒中的步驟提取HepG2、MHCC97H和SNU449肝癌細(xì)胞的總RNA，用Nanodrop2000超微量分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度和純度，核酸電泳儀測(cè)定RNA的完整性。逆轉(zhuǎn)錄cDNA，TBX15上游引物序列：GGTGTGGGCGGCTAAAATGA，下游引物序列：GCTCTGCTCAGAATCCGGG。內(nèi)參GAPDH上游引物序列：GAAGGTGAAGGTCGGAGT，下游引物序列：GAAGATGGTGATGGGATTTC。按照SYBR Premix Ex TaqⅡ試劑盒說(shuō)明書，每組為20 μL的Real-time PCR體系，每孔設(shè)3個(gè)復(fù)孔。反應(yīng)條件：95℃30s，95℃5 s，60℃30 s，40個(gè)循環(huán)。取PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中電泳，電壓120 V，15 min。實(shí)時(shí)熒光定量結(jié)果采用相對(duì)定量分析法，采用2-△△Ct方法計(jì)算TBX15基因的mRNA 表達(dá)量［8］。

1.6 Western blot檢測(cè)肝癌細(xì)胞中TBX15蛋白的表達(dá)

取轉(zhuǎn)染后的空白質(zhì)粒組、空載質(zhì)粒pc3.1組以及TBX15過表達(dá)質(zhì)粒組肝癌SNU449細(xì)胞，加入200 μL裂解液在冰上裂解30 min，4℃、13 000 r/min離心30 min，然后移取上清至潔凈離心管中。將高濃度待測(cè)蛋白以一定倍數(shù)稀釋后與4×Loading Buffer以3∶1的體積比混合，沸水浴5 min，取出樣品管置于冰上，待其恢復(fù)至室溫后離心震蕩，按照上樣順序點(diǎn)樣，電泳30 min。以濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，將膜浸入5%BSA的封閉液中，室溫封閉1 h。取出已封閉的PVDF膜，浸于1×TBS-T緩沖液中，于搖床上緩慢洗滌15 min。然后移入第一抗體中，4℃下孵育過夜。加入有對(duì)應(yīng)HRP標(biāo)記的第二抗體中，室溫?fù)u床孵育1 h。采用ECL化學(xué)發(fā)光顯色，移至凝膠成像分析儀中，曝光顯影。用Image J軟件對(duì)目的條帶進(jìn)行灰度值計(jì)算，以內(nèi)參為基數(shù)，計(jì)算公式：相對(duì)灰度值=TBX15基因灰度值/GAPDH基因灰度值。

1.7 CCK-8法檢測(cè)肝癌SNU449細(xì)胞的增殖情況

采用CCK-8法檢測(cè)轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒、空載質(zhì)粒pc3.1和TBX15過表達(dá)質(zhì)粒后肝癌SNU449細(xì)胞的增殖情況，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。取上述3組處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，分別加入0.25%胰蛋白酶0.5 mL，消化至細(xì)胞變圓脫落，加入全培養(yǎng)液5 mL終止消化，吹打成細(xì)胞懸液并轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入檢測(cè)培養(yǎng)液3 mL重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)，將細(xì)胞密度調(diào)整至 1×105個(gè)/mL，以 100 μL/孔加入96孔板中，每組細(xì)胞設(shè)置2個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞孵育24 h、48 h、72 h后分別加入CCK-8顯色液，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育60 min。取出96孔板于酶標(biāo)儀讀取各孔OD450吸光值。計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，計(jì)算公式：細(xì)胞增殖抑制率=［1-（過表達(dá)質(zhì)粒組吸光值/空白質(zhì)粒組或空載質(zhì)粒組吸光值）］×100%。

1.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)肝癌SNU449細(xì)胞的凋亡情況

采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒、空載質(zhì)粒pc3.1和TBX15過表達(dá)質(zhì)粒后肝癌SNU449細(xì)胞的凋亡情況，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。將上述3組細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)后，取約1.5×105個(gè)細(xì)胞置于離心管中，1200r/min離心5 min，棄上清液。然后分別加入 150 μL 1×Binding Buffer，重懸（理想濃度為106個(gè)細(xì)胞/L）后分成實(shí)驗(yàn)樣品管和陰性對(duì)照管，實(shí)驗(yàn)樣品管加入5μLAnnexinV-PE和5μL7-AAD染料，陰性對(duì)照管不加任何染料。室溫下避光孵育15 min，分別加入 200μL1×AnnexinVBindingBuffer，1h內(nèi)上機(jī)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本研究實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Excel整理后采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間差異比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），若整體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD法。以雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TBX15基因在3種肝癌細(xì)胞中的甲基化狀態(tài)

采用TBX15啟動(dòng)子引物對(duì)亞硫酸氫鹽修飾的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)BSP結(jié)果計(jì)算啟動(dòng)子甲基化率。結(jié)果顯示，肝癌HepG2、MHCC97H、SNU449細(xì)胞均發(fā)生了異常甲基化，其啟動(dòng)子甲基化率分別為57.4%、78.9%和89.5%，其中TBX15啟動(dòng)子在肝癌SNU449細(xì)胞中甲基化程度最高。

2.2 3種肝癌細(xì)胞中TBX15 mRNA的表達(dá)水平

采用qPCR檢測(cè)3種肝癌細(xì)胞中TBX15 mRNA的表達(dá)水平，擴(kuò)增曲線、溶解曲線良好。以肝癌MHCC97H細(xì)胞檢測(cè)的2-△△Ct值為1，計(jì)算其余細(xì)胞的平均 2-△△Ct值。結(jié)果顯示，TBX15 mRNA在肝癌SNU449細(xì)胞中幾乎不表達(dá)，在肝癌HepG2細(xì)胞中高表達(dá)，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖1。

2.3 構(gòu)建TBX15過表達(dá)載體

分別將空白質(zhì)粒、空載質(zhì)粒和TBX15過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至甲基化程度最高和TBX15 mRNA表達(dá)水平最低的肝癌SNU449細(xì)胞，以空白質(zhì)粒組的2-△△Ct值為1，計(jì)算其余各組的平均2-△△Ct值。qPCR結(jié)果顯示，TBX15過表達(dá)質(zhì)粒組TBX15 mRNA的相對(duì)表達(dá)量為1 385.28±18.19，空載質(zhì)粒組和空白質(zhì)粒組分別為 1.14±0.30 和 1.00±0.16，TBX15 過表達(dá)質(zhì)粒組TBX15 mRNA的相對(duì)表達(dá)量較其余兩組顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），空載質(zhì)粒組和空白質(zhì)粒組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.450），見圖 2。采用Western blot檢測(cè)3組細(xì)胞中TBX15蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與空白質(zhì)粒組和空載質(zhì)粒組細(xì)胞相比，TBX15過表達(dá)質(zhì)粒組細(xì)胞中TBX15蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，見圖3。以上結(jié)果說(shuō)明TBX15過表達(dá)載體構(gòu)建成功。

圖1 3種肝癌細(xì)胞系中TBX15 mRNA的表達(dá)水平Fig.1The mRNA expression levels of TBX15 in three HCC cell lines

圖2qPCR檢測(cè)3組細(xì)胞中TBX15 mRNA的表達(dá)Fig.2 qPCR detecting the TBX15 mRNA expression in three groups

圖3 Western blot檢測(cè)3組細(xì)胞中TBX15蛋白的表達(dá)Fig.3 Western blot detecting the TBX15 protein expression in three groups

2.4 過表達(dá)TBX15對(duì)肝癌SNU449細(xì)胞增殖能力的影響

CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示，培養(yǎng)24 h后，空白質(zhì)粒組、空載質(zhì)粒組和TBX15過表達(dá)質(zhì)粒組肝癌SNU449細(xì)胞的OD值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1.525，P=0.291）；培養(yǎng)48 h后，3組OD值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=9.353，P=0.014），兩兩比較發(fā)現(xiàn)，TBX15過表達(dá)質(zhì)粒組肝癌SNU449細(xì)胞的增殖能力較空載質(zhì)粒組強(qiáng)（P=0.015）；培養(yǎng)72 h后，3組細(xì)胞的OD值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.326，P=0.734），見表 1。

表1 CCK-8檢測(cè)不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組肝癌SNU449細(xì)胞的OD值Tab.1 CCK-8 detecting the OD values of SNU449 cells in different plasmid groups

2.5 過表達(dá)TBX15對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示（圖4），空白質(zhì)粒組、空載質(zhì)粒組和過表達(dá)質(zhì)粒組肝癌SNU449細(xì)胞的早期凋亡比例差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=13.609，P=0.006），且兩兩比較發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)質(zhì)粒組肝癌SNU449細(xì)胞的凋亡能力高于空白質(zhì)粒組（P=0.002）；3組細(xì)胞晚期凋亡比例差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1.144，P=0.379）；3組細(xì)胞總凋亡比例差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=6.059，P=0.036），兩兩比較發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)質(zhì)粒組肝癌SNU449細(xì)胞的凋亡能力高于空白質(zhì)粒組（P=0.014），見表2。

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組肝癌SNU449細(xì)胞的凋亡情況Fig.4 Flow cytometry detecting the apoptosis of SNU449 cells in different plasmid groups

表2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組肝癌SNU449細(xì)胞的凋亡比例Tab.2 Flow cytometry detecting the apoptosisproportion of SNU449 cellsin differentplasmid groups

3 討論

腫瘤抑制基因的表觀遺傳沉默是導(dǎo)致人類癌癥發(fā)生、進(jìn)展的主要事件，這些基因啟動(dòng)子區(qū)域中的CpG島超甲基化是腫瘤抑制因子表達(dá)失活的重要機(jī)制［9］。越來(lái)越多的研究證明，DNA在腫瘤患者中甲基化異常與腫瘤分化差、侵襲高和不良預(yù)后等有關(guān)［10-11］，因此DNA甲基化可能成為不同類型腫瘤的潛在診斷和預(yù)后標(biāo)志物。本研究結(jié)果顯示，TBX15基因在肝癌MHCC97H和SNU449細(xì)胞中呈高度甲基化狀態(tài)，在肝癌HepG2細(xì)胞中呈中度甲基化狀態(tài)。采用qPCR檢測(cè)3株細(xì)胞TBX15 mRNA的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)TBX15 mRNA在肝癌MHCC97H和SNU449細(xì)胞中表達(dá)失活，證實(shí)了啟動(dòng)子高甲基化與肝癌中TBX15表達(dá)缺失有關(guān)，提示DNA甲基化可能是導(dǎo)致肝癌TBX15基因沉默的主要機(jī)制。

研究表明，在某些特定腫瘤中，由于啟動(dòng)子中CpG島的超甲基化，許多腫瘤抑制基因功能缺失，可能抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展［12］。研究發(fā)現(xiàn)，越來(lái)越多的基因甲基化參與肝細(xì)胞的癌變和轉(zhuǎn)移［13-14］。LI等［3］研究發(fā)現(xiàn)TBX15可通過抑制腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移而阻礙乳腺癌的發(fā)生發(fā)展。本研究體外功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染過表達(dá)TBX15質(zhì)粒48 h后，發(fā)現(xiàn)可促進(jìn)肝癌SNU449細(xì)胞增殖，與上述研究結(jié)果不一致，原因可能是觀察24 h后部分細(xì)胞還未轉(zhuǎn)染成功，而這部分細(xì)胞還可以繼續(xù)分裂增長(zhǎng)，在轉(zhuǎn)染48 h后3組細(xì)胞增長(zhǎng)的速度開始出現(xiàn)明顯差異，72 h后趨于平穩(wěn)。ARRIBAS等［4］研究發(fā)現(xiàn)TBX15過表達(dá)可以改變促凋亡/抗凋亡蛋白質(zhì)的比例，下調(diào)線粒體凋亡，促使細(xì)胞色素c降低，裂解減少，從而抑制腫瘤細(xì)胞凋亡。然而本研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)TBX15促進(jìn)了肝癌細(xì)胞的凋亡，具體機(jī)制尚未知。以上結(jié)果提示TBX15基因在肝癌惡變和轉(zhuǎn)移中可能發(fā)揮促癌與抑癌的雙重功能。

既往研究認(rèn)為細(xì)胞分化和增殖紊亂是惡性腫瘤發(fā)生機(jī)制的全部?jī)?nèi)容［15］，近年發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞喪失自發(fā)凋亡能力也是其發(fā)病的重要機(jī)制之一，腫瘤細(xì)胞在快速增殖的同時(shí)可能也伴隨著細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)TBX15誘導(dǎo)肝癌SNU449細(xì)胞凋亡能力可能比細(xì)胞增殖能力強(qiáng)，在一定程度上抑制腫瘤細(xì)胞的進(jìn)展，提示TBX15基因可能是治療肝癌的潛在靶點(diǎn)。

綜上所述，TBX15基因啟動(dòng)子甲基化可能與肝細(xì)胞癌惡性生物學(xué)行為相關(guān)，為研究肝癌的發(fā)生進(jìn)展機(jī)制提供新的方向。本研究?jī)H在肝癌SNU449細(xì)胞中進(jìn)行功能研究，未能充分排除腫瘤異質(zhì)性的影響，而TBX15基因在其他肝癌細(xì)胞株是否發(fā)揮相同作用尚未知。此外，本研究?jī)H在細(xì)胞水平進(jìn)行功能探討，仍需在多種肝癌細(xì)胞株和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證。