吡格列酮對人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1增殖、凋亡的影響及分子機(jī)制研究

李俊玲 張敬毅 闞方功 翟愛娣 郝瑩

作者單位：255200 淄博 山東省淄博市第一醫(yī)院藥學(xué)部

胰腺癌（pancreatic cancer）是消化道系統(tǒng)惡性程度較高的惡性腫瘤，預(yù)后較差［1］。2015年統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，我國胰腺癌病死率居腫瘤相關(guān)死亡的第6位［2］。臨床上以吉西他濱（gemcitabine）等化療藥物治療胰腺癌的效果不理想，患者總體生存期僅為6.8個(gè)月［3］。尋找新的有效抗胰腺癌藥物，對提高患者生存時(shí)間，改善預(yù)后具有十分重要的意義。吡格列酮（pioglitazone）是噻唑烷二酮類藥物，屬于胰島素增敏劑，臨床上常用于治療2型糖尿?。?］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，吡格列酮可能通過上調(diào)PPARγ表達(dá)而抑制胃癌細(xì)胞生長，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡［5］。然而其在胰腺癌中的作用至今鮮有報(bào)道，基于此，本研究通過分析吡格列酮對人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1增殖、凋亡的影響，旨在探討吡格列酮對胰腺癌的分子作用機(jī)制，以期為臨床診治提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1購自北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司，吡格列酮（純度98%）購自上海科順生物科技有限公司，吉西他濱（純度98%）購自上海恒斐生物科技有限公司，Bcl-2、Bax、caspase-3 抗體與 ERK、p-ERK抗體及β-actin購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司，PI/RNase購自廈門研科生物技術(shù)有限公司，AnnexinVFITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自上海一基實(shí)業(yè)有限公司，RP-MI1640培養(yǎng)基購自上海研生實(shí)業(yè)有限公司，DAPI染色試劑盒購自上海貝博生物科技有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1常規(guī)培養(yǎng)至RP-MI1640培養(yǎng)基（10%胎牛血清，100 U/mL青霉素，100 μg/mL鏈霉素），于37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待70%～80%細(xì)胞貼壁融合時(shí)，采用胰蛋白酶消化傳代，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 CCK-8法檢測胰腺癌細(xì)胞增殖情況

調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度，并以每孔1×103個(gè)/mL細(xì)胞接種于96孔板，隨機(jī)分為0 μmol/L吡格列酮組、10 μmol/L吡格列酮組、20 μmol/L吡格列酮組、50μmol/L吡格列酮組、50 μmol/L吉西他濱組（以下實(shí)驗(yàn)均以此分組）。每組細(xì)胞設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，并置于37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后，分別加入終濃度為0 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、50 μmol/L 的吡格列酮及 50 μmol/L 的吉西他濱，分別于培養(yǎng) 0 h、12 h、24 h、48h、72h時(shí)，各孔細(xì)胞加入0.01mL的CCK-8，培養(yǎng)結(jié)束后，在全自動(dòng)酶標(biāo)儀上測定各孔吸光度值（OD490），計(jì)算細(xì)胞存活率（%）=OD490實(shí)驗(yàn)組/OD490空白對照組×100%（0 μmol/L 吡格列酮組為空白對照組，10 μmol/L吡格列酮組、20 μmol/L 吡格列酮組、50 μmol/L 吡格列酮組、50 μmol/L吉西他濱組為實(shí)驗(yàn)組），并篩選合適的藥物作用時(shí)間。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測胰腺癌細(xì)胞周期

將對數(shù)生長期細(xì)胞濃度調(diào)至1×105個(gè)/mL，并接種于6孔板中，按照1.3的方法分組，于常規(guī)37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至90%融合時(shí)，分別加入終濃度為 0 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、50 μmol/L 的吡格列酮及50 μmol/L的吉西他濱，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，然后收集各組細(xì)胞，PBS洗滌2次，棄上清液，70%酒精固定，4℃過夜，PBS洗滌后將細(xì)胞重懸于PI/RNase染色緩沖液中，37℃避光孵育30 min后，采用流式細(xì)胞儀檢測，計(jì)算G0/G1期、S期、G2/M期細(xì)胞比例。每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測胰腺癌細(xì)胞凋亡情況

將對數(shù)生長期細(xì)胞濃度調(diào)至1×105個(gè)/mL，接種于6孔板中，按照1.3的方法分組，以50 μmol/L吉西他濱及 0 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、50 μmol/L 吡格列酮作用后，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。收集各組細(xì)胞，胰蛋白酶消化，1 000 r/min離心5 min，PBS洗滌2次，棄上清液，用500 μL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，加入5 μL AnnexinV/PITC 混勻，再加入 5 μL PI，混勻，避光、室溫培養(yǎng)15 min后上流式細(xì)胞儀檢測，檢測細(xì)胞數(shù)約為1×104個(gè)/組。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 4，6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚染色法檢測胰腺癌細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)變化

將對數(shù)生長期細(xì)胞濃度調(diào)至1×105個(gè)/mL，接種在6孔培養(yǎng)板中，按照1.3中的方法分組，以50μmol/L吉西他濱及 0 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、50 μmol/L 吡格列酮作用后，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。收集各組細(xì)胞，采用4，6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚（DAPI）染色試劑盒檢測細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)的變化，按試劑盒說明書檢測。DAPI染色結(jié)果判定：正常細(xì)胞DAPI染色呈藍(lán)白色熒光，早期凋亡細(xì)胞出現(xiàn)核濃縮，染色加深，晚期凋亡細(xì)胞表現(xiàn)為核碎裂呈大小不等的圓形小體，并被細(xì)胞膜包繞。

1.7 Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白及MAPK/ERK信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

將對數(shù)生長期細(xì)胞濃度調(diào)至1×105個(gè)/mL，接種在6孔培養(yǎng)板中，按照1.3中的方法分組，以50μmol/L吉西他濱及 0 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、50 μmol/L 的吡格列酮處理后，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。收集各組細(xì)胞，PBS洗滌2次后，加裂解液，冰上裂解30 min，離心取上清液，以Lowry法進(jìn)行蛋白定量。取50 μg蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，然后取出凝膠，切膠，并將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，在95 mA電流下轉(zhuǎn)移3 h，5%脫脂牛奶封閉3 h，室溫封閉1 h，加入一抗，4 ℃孵育過夜。TBST（0.1%Tween20）洗膜3次，加入相應(yīng)二抗及TBST緩沖液，室溫孵育2 h，TBST洗膜，ECL化學(xué)發(fā)光法顯色，Quantity One凝膠成像分析軟件拍照并分析各蛋白相對表達(dá)量，以β-actin作為內(nèi)參照。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，若組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，進(jìn)一步的多重比較采用Bonferroni檢驗(yàn)。以雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 吡格列酮對人胰腺癌PANC-1細(xì)胞增殖的影響

與 0 μmol/L 吡格列酮組相比，50 μmol/L 吉西他濱組及 10 μmol/L、20 μmol/L、50 μmol/L 吡格列酮組PANC-1細(xì)胞作用24 h、48 h、72 h的OD值均顯著降低（P＜0.05），且吡格列酮濃度越高，PANC-1細(xì)胞 OD值越低。與50 μmol/L吉西他濱組相比，10 μmol/L吡格列酮組PANC-1細(xì)胞作用24 h、48 h、72 h的OD值均升高（P＜0.05），而 50 μmol/L 吡格列酮組 PANC-1細(xì)胞OD值均降低（P＜0.05）。見表1。各組細(xì)胞作用48 h與72 h的OD值相差不大，表明細(xì)胞作用48 h后，增殖速度趨于平穩(wěn)，因此本實(shí)驗(yàn)選擇藥物作用時(shí)間為48 h進(jìn)行后續(xù)研究。

2.2 吡格列酮對人胰腺癌PANC-1細(xì)胞周期的影響

與 0 μmol/L 吡格列酮相比，50 μmol/L 吉西他濱及 10 μmol/L、20 μmol/L、50 μmol/L 吡格列酮作用于胰腺癌細(xì)胞后，G0/G1期細(xì)胞比例均顯著升高（P＜0.05），S期細(xì)胞比例顯著降低（P＜0.05），且吡格列酮濃度越高，G0/G1期細(xì)胞比例越高，S期細(xì)胞比例越低，各組G2/M期細(xì)胞比例差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與50 μmol/L 吉西他濱組相比，10 μmol/L 吡格列酮組G0/G1期細(xì)胞比例降低（P＜0.05），S期細(xì)胞比例升高（P＜0.05），而 20 μmol/L 吡格列酮組 G0/G1期、S期細(xì)胞比例差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），50 μmol/L 吡格列酮組G0/G1期細(xì)胞比例升高（P＜0.05），S期細(xì)胞比例降低（P＜0.05）。見圖 1、表 2。

表1 吡格列酮對胰腺癌PANC-1細(xì)胞增殖的影響（x±s）Tab.1 Effects of pioglitazone on proliferation of human pancreatic cancer PANC-1 cells（x±s）

圖1 吡格列酮對胰腺癌PANC-1細(xì)胞周期的影響Fig.1 Effect of pioglitazone on cell cycle of pancreatic cancer PANC-1

表2 吡格列酮對胰腺癌PANC-1細(xì)胞周期的影響（x±s）Tab.2 Effect of pioglitazone on cell cycle of pancreatic cancer PANC-1（x±s）

2.3 吡格列酮對胰腺癌PANC-1細(xì)胞凋亡的影響

與 0 μmol/L 吡格列酮組相比，50 μmol/L 吉西他濱及 10μmol/L、20μmol/L、50μmol/L吡格列酮作用胰腺癌細(xì)胞后，細(xì)胞凋亡率均升高（P＜0.05），且吡格列酮濃度越高，細(xì)胞凋亡率越高。與50 μmol/L吉西他濱組相比，10 μmol/L、20 μmol/L 吡格列酮組細(xì)胞凋亡率均降低（P＜0.05），而50 μmol/L 吡格列酮組細(xì)胞凋亡率升高（P＜0.05）。見圖 2、表 3。

表3 吡格列酮對胰腺癌PANC-1細(xì)胞凋亡的影響（x±s）Tab.3 Effect of pioglitazone on apoptosis of pancreatic cancer PANC-1 cells（x±s）

圖2 吡格列酮對胰腺癌PANC-1細(xì)胞凋亡的影響Fig.2 Effects of pioglitazone on apoptosis of pancreatic cancer PANC-1 cells

2.4 吡格列酮對胰腺癌PANC-1細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)的影響

在倒置熒光顯微鏡下用DAPI染色劑檢查細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)特征，結(jié)果顯示，與0 μmol/L吡格列酮相比，50 μmol/L 吉西他濱及 10 μmol/L、20 μmol/L、50 μmol/L吡格列酮作用胰腺癌細(xì)胞后，細(xì)胞收縮程度逐漸加重，藍(lán)白色熒光逐漸加深，細(xì)胞核逐漸碎裂為大小不一的圓形小體，見圖3。

圖3 吡格列酮對胰腺癌PANC-1細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)的影響（×400）Fig.3 Effects of pioglitazone on apoptotic morphological of pancreatic cancer PANC-1 cells（×400）

2.5 吡格列酮對胰腺癌PANC-1細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與 0 μmol/L吡格列酮相比，50 μmol/L吉西他濱及 10 μmol/L、20 μmol/L、50 μmol/L 吡格列酮作用胰腺癌細(xì)胞后，Bcl-2 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），而 Bax、caspase-3蛋白表達(dá)增強(qiáng)（P＜0.05），且吡格列酮濃度越高，細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)水平越低，Bax、caspase-3蛋白表達(dá)水平越高。與50 μmol/L吉西他濱組相比，10 μmol/L吡格列酮組細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05），而 Bax、caspase-3 蛋白表達(dá)水平均降低（P＜0.05）；50 μmol/L 吡格列酮組細(xì)胞 Bcl-2 蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05），Bax、caspase-3蛋白表達(dá)水平均升高（P＜0.05）。見圖 4、表 4。

圖4 吡格列酮對胰腺癌PANC-1細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effects of pioglitazone on apoptosis-related protein expression in PANC-1 cells

表4 吡格列酮對胰腺癌PANC-1細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（x±s）Tab.4 Effect of pioglitazone on apoptosis-related protein expression in PANC-1 cells（x±s）

2.6 吡格列酮對胰腺癌PANC-1細(xì)胞MAPK/ERK信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與 0 μmol/L吡格列酮相比，50 μmol/L吉西他濱及 10 μmol/L、20 μmol/L、50 μmol/L 吡格列酮作用胰腺癌細(xì)胞后，p-ERK蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05），且吡格列酮濃度越高，p-ERK蛋白表達(dá)水平越高，各組ERK蛋白表達(dá)水平，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與50 μmol/L吉西他濱組相比，10 μmol/L吡格列酮組細(xì)胞p-ERK 蛋白水平降低（P＜0.05），20 μmol/L 吡格列酮組細(xì)胞p-ERK蛋白水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而50 μmol/L吡格列酮組細(xì)胞p-ERK蛋白水平升高（P＜0.05）。見圖 5、表 5。

圖5 吡格列酮對胰腺癌PANC-1細(xì)胞中MAPK/ERK信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Effects of pioglitazone on the expression of MAPK/ERK signaling pathway-related proteins in PANC-1 cells

表5 吡格列酮對胰腺癌PANC-1細(xì)胞中MAPK/ERK信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（x±s）Tab.5 Effects of pioglitazone on the expression of MAPK/ERK signaling pathway-related proteins in PANC-1 cells（x±s）

3 討論

胰腺癌起病隱匿、侵襲性強(qiáng)、進(jìn)展迅速、早期診斷困難、手術(shù)切除率低，且對放療、化療敏感性差［6］。5年生存率約為5%，手術(shù)切除后中位生存期仍不足2年，大多數(shù)患者因腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移死亡［7］。目前臨床上尚缺乏有效的治療方案。吡格列酮為噻唑烷二酮類藥物，具有抗氧化、抗炎及改善胰島素抵抗和高血糖等功效［8］，亦有研究表明吡格列酮可抑制成骨細(xì)胞增殖，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡［9］。只璟泰等［10］研究報(bào)道吡格列酮治療甲狀腺癌PAX8-PPARγ融合基因陽性患者可取得一定效果。李莉等［11］研究亦發(fā)現(xiàn)吡格列酮能夠明顯促進(jìn)大鼠胰島素瘤細(xì)胞凋亡并抑制其增殖。本研究結(jié)果顯示，與0 μmol/L吡格列酮作用相比，50 μmol/L吉西他濱及 10 μmol/L、20 μmol/L、50 μmol/L 吡格列酮作用PANC-1細(xì)胞24 h、48 h、72 h后OD值均明顯降低，且吡格列酮濃度越高，PANC-1細(xì)胞的OD值越低，與李莉等［11］研究結(jié)果相似。提示吡格列酮能夠抑制胰腺癌細(xì)胞增殖，且吡格列酮濃度越高，其對胰腺癌細(xì)胞增殖抑制越明顯，可能具有抗腫瘤作用。進(jìn)一步采用流式細(xì)胞術(shù)檢測胰腺癌細(xì)胞周期，發(fā)現(xiàn)與0 μmol/L吡格列酮作用相比，50 μmol/L吉西他濱、10μmol/L、20μmol/L、50μmol/L吡格列酮作用后G0/G1期細(xì)胞比例均升高，而S期細(xì)胞比例降低，說明吡格列酮作用胰腺癌細(xì)胞后，大部分細(xì)胞被阻滯在G0期、G1期，從而抑制細(xì)胞增殖。

正常條件下，細(xì)胞的凋亡與增殖維持著動(dòng)態(tài)平衡。但在腫瘤組織中，這種平衡被打破，因此在腫瘤治療中，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡是關(guān)鍵［12］。研究表明吡格列酮可能通過改變細(xì)胞膜電位，促進(jìn)急性胰腺炎細(xì)胞凋亡［13］。本研究結(jié)果顯示，與0 μmol/L吡格列酮相比，50 μmol/L 吉西他濱及 10 μmol/L、20 μmol/L、50 μmol/L吡格列酮作用后胰腺癌細(xì)胞凋亡率升高，且吡格列酮濃度越高，胰腺癌細(xì)胞凋亡率越高，提示吡格列酮可能促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞凋亡。王云等［14］研究亦表明吡格列酮能明顯抑制肺癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。DAPI作為一種熒光染料，可以穿透細(xì)胞膜與細(xì)胞核中的雙鏈DNA結(jié)合，進(jìn)而發(fā)揮標(biāo)記作用，在顯微鏡下可看到顯藍(lán)白色熒光的細(xì)胞，根據(jù)熒光的強(qiáng)度及細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核的形態(tài)可檢測出細(xì)胞凋亡情況。因此，本研究采用DAPI細(xì)胞核染色觀察細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)特征，發(fā)現(xiàn)與0 μmol/L吡格列酮作用相比，50 μmol/L吉西他濱及10 μmol/L、20 μmol/L、50 μmol/L 吡格列酮作用胰腺癌細(xì)胞后，細(xì)胞收縮程度逐漸加重，藍(lán)白色熒光亦逐漸加深，細(xì)胞核逐漸碎裂為大小不一的圓形小體。說明胰腺癌DANC-1細(xì)胞在不同濃度吡格列酮作用下，細(xì)胞凋亡程度逐漸加重。

為進(jìn)一步探索胰腺癌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，本研究檢測凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax、caspase-3等的表達(dá)情況。其中Bcl-2是常見促凋亡基因；Bax基因具有抗Bcl-2蛋白、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用［15-16］；caspase-3是細(xì)胞凋亡過程中最重要的剪切酶，在細(xì)胞凋亡中具有重要的作用［17］。本研究Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與0μmol/L吡格列酮相比，50μmol/L吉西他濱及10μmol/L、20 μmol/L、50 μmol/L 吡格列酮作用 PANC-1 細(xì)胞后Bcl-2蛋白表達(dá)水平均降低，而Bax、caspase-3表達(dá)均增強(qiáng)，且吡格列酮作用濃度越高Bcl-2蛋白表達(dá)水平越低，Bax、caspase-3表達(dá)水平越高，提示吡格列酮作用后可能通過抑制抗凋亡蛋白表達(dá)，增強(qiáng)促凋亡蛋白表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。MAPK/ERK是細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶信號，亦是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的重要通路［18］。其中p-ERK蛋白水平是反映MAPK/ERK信號通路激活情況的重要指標(biāo)［19］。YI等［20］研究表明吡格列酮能夠劑量依賴性地抑制人子宮平滑肌肉瘤SK-UT-1細(xì)胞p-ERK蛋白的表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，與0μmol/L吡格列酮相比，50 μmol/L 吉西他濱及 10 μmol/L、20 μmol/L、50 μmol/L吡格列酮作用后 PANC-1細(xì)胞 p-ERK蛋白表達(dá)水平降低，且吡格列酮濃度越高，p-ERK蛋白表達(dá)水平越低，提示MAPK/ERK信號通路活化可能參與胰腺癌PANC-1細(xì)胞凋亡過程。

綜上所述，吡格列酮能抑制胰腺癌細(xì)胞PANC-1增殖，并誘導(dǎo)其凋亡，吡格列酮可能通過調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白及MAPK/ERK通路而誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞PANC-1凋亡，吡格列酮調(diào)控胰腺癌細(xì)胞增殖與凋亡的機(jī)制十分復(fù)雜，具體調(diào)控機(jī)制仍需進(jìn)一步探索。