辛伐他汀延緩生酮飲食導(dǎo)致的骨量丟失的實(shí)驗(yàn)觀察

楊舟 劉祺 許曉林 劉雅普 吳秀華 黃志平 黃祖成 孔剛剛 丁建羊 朱青安

南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院脊柱骨科，廣東 廣州 510515

生酮飲食(ketogenic diet，KD)是一種高脂肪、低碳水化合物的配方飲食，可將機(jī)體從糖代謝轉(zhuǎn)變?yōu)橹狙趸┠埽黾油w代謝，目前在臨床上是治療兒童耐藥性癲癇的手段之一[1]，也對急性和退變性神經(jīng)系統(tǒng)疾病和急性脊髓損傷等具有治療作用[2]。然而，Hahn等[3]于1979年首次報道生酮飲食相關(guān)性骨量丟失，也有研究發(fā)現(xiàn)兒童難治性癲癇的患者在長期使用生酮飲食干預(yù)后發(fā)生骨量丟失[4]。本課題組前期研究證實(shí)了生酮飲食導(dǎo)致小鼠骨量丟失、力學(xué)性能下降[5]。因此由于生酮飲食在臨床上的應(yīng)用而導(dǎo)致骨量丟失的不良反應(yīng)不容忽視。

他汀類藥物是3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A 還原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A，HMG-CoA) 的抑制劑，通過抑制膽固醇合成鏈中的限速酶HMG-CoA還原酶來減少膽固醇的合成。1999 年 Mundy 等[6]首次發(fā)現(xiàn)，他汀類藥物有激活成骨細(xì)胞、促進(jìn)骨合成代謝的作用。隨后研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，辛伐他汀能在體內(nèi)和體外環(huán)境下通過提升骨形態(tài)發(fā)生蛋白2和堿性磷酸酶的表達(dá)水平刺激骨形成，還可以刺激骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化[7-8]，可能成為新的有效的治療骨質(zhì)疏松癥的藥物。然而辛伐他汀對于生酮飲食引起的骨質(zhì)疏松癥的治療未見報道。

本研究目的是通過分析股骨遠(yuǎn)端松質(zhì)骨和中段皮質(zhì)骨的骨微結(jié)構(gòu)、生物力學(xué)性能以及骨形態(tài)的改善等評價辛伐他汀對生酮飲食引起的骨質(zhì)疏松癥的治療作用。

1 材料和方法

1.1 動物模型與分組

40只雌性8周齡C57BL/6 J小鼠，購自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，平均體重為16～18 g。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為5組，分別為對照組(Sham)、卵巢切除組(OVX組)、卵巢切除加辛伐汀干預(yù)組(OVX+ST組)、生酮飲食組(KD組)、生酮飲食加辛伐他汀干預(yù)組(KD+ST組)。OVX和OVX+ST組小鼠在異氟烷麻醉下行雙側(cè)卵巢切除術(shù)，方法參照以往研究[9]。KD及KD+ST組小鼠予以碳水化合物與脂肪比為1∶3的生酮飲食(Zeneca，深圳，廣東，中國)喂養(yǎng)，而Sham組、OVX組、OVX+ST組喂以普通飲食(購自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心) (兩種飲食基本營養(yǎng)素含量見表1)。辛伐他汀治療組小鼠予以辛伐他汀20 mg/(kg·d)灌胃，方法參照以往研究[10]。12周取材，獲取血清及雙側(cè)股骨，左側(cè)股骨置于-80 ℃保存?zhèn)溆?，右?cè)股骨置于4%多聚甲醛中浸泡固定24 h備用。

表1 普通飼料與生酮飲食成分Table 1 Basic nutrient content in SD and KD

1.2 體重、血酮、血糖和子宮重量的測量

干預(yù)12周后，用CS 200電子稱(Ohaus Pine Brook NJ 美國)稱量小鼠體重。采用剪尾法獲取小鼠血液標(biāo)本，并用血糖儀(JPS-5 怡成 北京 中國)、血酮儀(Meter T-1 Sentest Inc. 臺灣 中國)測量血糖和血酮。過量麻醉處死小鼠，仔細(xì)分離子宮后，于4 ℃冰箱生理鹽水中浸泡備用，紗布吸干生理鹽水后稱重。

1.3 顯微CT掃描

對所有小鼠的右側(cè)股骨行顯微CT(μ80 Scanco公司瑞士)掃描。預(yù)掃完畢后分別選擇股骨遠(yuǎn)端1/3的部位和股骨中段180層作為掃描區(qū)域。掃描參數(shù)為電壓55 kV，電流145μA，層厚為12 μm。掃描結(jié)束后，以股骨髁消失作為第一層選取100層分析松質(zhì)骨顯微結(jié)構(gòu)，測量總礦物質(zhì)密度(TMD)、骨體積分?jǐn)?shù)(BV/TV)、骨小梁數(shù)目(Tb.N)、骨小梁分離度(Tb.Sp)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁連接密度(Conn.D)等。測量股骨中段的100層皮質(zhì)骨的厚度(Ct.Th)、皮質(zhì)骨總面積(Tarea)、皮質(zhì)骨橫截面面積(Barea)。

1.4 股骨遠(yuǎn)端松質(zhì)骨壓縮試驗(yàn)

通過有限元模型分析軟件(SCANCO Medical AG，版本1.13)，采用高分辨率骨微結(jié)構(gòu)的三維圖像建立股骨遠(yuǎn)端松質(zhì)骨壓縮的有限元模型，在線彈性范圍內(nèi)進(jìn)行軸向壓縮仿真試驗(yàn)，按同質(zhì)和各向同性的彈性材料來模擬。其中骨材料的參數(shù)分別為泊松比ν=0.3，楊氏模量E=10 000 MPa，方法參照以往研究[11]。采用“Z軸方向高摩擦壓縮試驗(yàn)”模擬股骨壓縮試驗(yàn)，計算股骨遠(yuǎn)端松質(zhì)骨壓縮剛度。

1.5 股骨中段三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)

左側(cè)股骨標(biāo)本在室溫下解凍1 h后，采用電磁伺服材料試驗(yàn)機(jī)(E1000 Instron公司 美國)進(jìn)行股骨三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)。具體方法如下：采用游標(biāo)卡尺確定股骨的中點(diǎn)，將股骨放置于自制的三點(diǎn)彎曲平臺上，支架的跨距為10 mm，兩端支架到股骨中點(diǎn)的距離為5 mm，以2 mm/min的速度在股骨中點(diǎn)向下橫向施壓至破壞(圖1)。連續(xù)記錄載荷和位移，從載荷-位移曲線中得到最大載荷、最大位移、剛度、最大能量吸收。

圖1 股骨三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)Fig.1 Three-point bending test for the femurs

1.6 股骨骨組織學(xué)分析

顯微CT掃描后，右側(cè)股骨置于10%EDTA脫鈣4周后，自來水流水沖洗過夜，梯度乙醇脫水，石蠟包埋。每組標(biāo)本行矢狀面切片，厚度約5 μm，HE染色，在光學(xué)顯微鏡選40倍鏡下觀察骨小梁結(jié)構(gòu)。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

所得數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用單因素方差分析評價體重、子宮重量、血糖、血酮、血鈣、血磷、骨結(jié)構(gòu)參數(shù)和力學(xué)參數(shù)。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體重、子宮重量、血液指標(biāo)

干預(yù)12周后各組間小鼠體重差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義。OVX組和OVX+ST組小鼠子宮重量分別為(0.04±0.01)g 和(0.03±0.01)g，明顯低于Sham組(0.13±0.02)g，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(表2)。

組別體重/(g)子宮重量/(g)Sham20.3±0.760.13±0.02OVX21.8±1.160.04±0.01?OVX+ST20.3±1.280.03±0.01?KD20.8±1.670.13±0.03KD+ST20.4±1.340.13±0.03

注：與Sham組相比，*P<0.05。

12周時KD組和KD+ST組血酮分別為(1.28±0.36)mmol/L和(1.48±0.53)mmol/L，均顯著高于Sham組(0.60±0.32)mmol/L。而各組之間的血糖、血清鈣或磷含量差異均沒有統(tǒng)計學(xué)意義(表3)。

組別血酮/(mmol/L)血糖/(mmol/L)血鈣/(mol/L)血磷/(mol/L)Sham0.60±0.327.25±1.032.20±0.102.36±0.28OVX0.75±0.177.33±0.992.17±0.132.29±0.26OVX+ST0.63±0.106.33±0.312.21±0.092.30±0.48KD1.28±0.36?7.83±0.812.14±0.032.38±0.52KD+ST1.48±0.53?6.25±0.682.12±0.132.10±0.36

注：與Sham組相比，*P<0.05。

2.2 股骨骨微結(jié)構(gòu)

OVX組和KD組小鼠股骨遠(yuǎn)端松質(zhì)骨的總礦物質(zhì)密度(TMD)分別為(36.3±8.84)mg/cm3和(39.2±13.5) mg/cm3，明顯低于Sham組(69.0±11.2) mg/cm3(P<0.05)。辛伐他汀治療后，OVX+ST組TMD為(53.0±10.1) mg/cm3，較OVX組顯著升高(P<0.05)。KD+ST組TMD為(51.8±6.20) mg/cm3，較KD組有所升高，但組間差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。骨小梁連接密度(Conn.D)的組間變化與TMD組間變化趨勢相似。OVX+ST組股骨骨體積分?jǐn)?shù)(BV/TV)顯著高于對照組(4%與6%)，同樣KD+ST組股骨骨體積分?jǐn)?shù)也顯著高于對照組(4%與7%)。各組間骨小梁數(shù)目的變化趨勢與各組間的骨體積分?jǐn)?shù)變化趨勢相同，而各組間骨小梁分離度的變化趨勢則相反(圖2)。

圖2 遠(yuǎn)端股骨骨松質(zhì)Micro-CT掃描注：與Sham組相比，*P<0.05；兩組間比較，#P<0.05。Fig.2 Micro-CT images and parameters of cancellous bone at the distal femurs

各組之間股骨中段皮質(zhì)骨骨面積(Barea)或骨皮質(zhì)厚度(Ct.Th)的差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。OVX+ST組股骨中段皮質(zhì)骨總面積(Tarea) 為(1.77±0.10)mm2，明顯高于OVX組(1.44±0.33)mm2(P<0.05)(圖3)。

圖3 中段股骨骨皮質(zhì)Micro-CT掃描注：與Sham組相比，*P<0.05；兩組間比較，#P<0.05。Fig.3 Micro-CT images and parameters of cortical bone at the middle femurs

2.3 股骨遠(yuǎn)端松質(zhì)骨壓縮試驗(yàn)

Sham組、OVX組、OVX+ST組、KD組和KD+ST組小鼠股骨遠(yuǎn)端松質(zhì)骨剛度分別為(320±146) N/mm、(47±41)N/mm、(233±74)N/mm、(35±15)N/mm和(161±38)N/mm。OVX組和KD組與Sham組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。OVX+ST組剛度大于OVX組，且組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。盡管KD+ST組剛度高于KD組，但組間剛度的差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(圖4)。

圖4 有限元分析股骨遠(yuǎn)端松質(zhì)骨壓縮剛度注：與Sham組相比，*P<0.05；兩組間比較，#P<0.05。Fig.4 The stiffness results of finite element analysis at the distal femurs

2.4 股骨中段三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)

圖5 股骨三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)的力學(xué)參數(shù)注：與Sham組相比，*P<0.05；兩組間比較，#P<0.05。Fig.5 Mechanical parameters of the three-point bending test for the femurs

Sham組、OVX組、OVX+ST組、KD組和KD+ST組小鼠股骨最大載荷分別為(12.4±1.4)N、(11.1±0.7)N、(17.1±0.8)N、(12.5±1.1)N、(19.4±3.0)N。OVX+ST組和KD+ST組與Sham組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，辛伐他汀治療組顯著高于對照組(P<0.05)。股骨最大位移、能量吸收、剛度三個指標(biāo)OVX+ST組比OVX組、KD+ST組比KD組、OVX+ST組和KD+ST組都比Sham組有所升高，但是組間差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而其中股骨最大能量吸收KD+ST組(2.46±0.73)mJ顯著高于Sham組(1.33±0.37)mJ和KD組(1.00±0.17)mJ(P<0.05)(圖5)。

2.5 股骨骨組織學(xué)分析

Sham組股骨遠(yuǎn)端骨骺板下見到的骨小梁結(jié)構(gòu)排列緊密、有規(guī)則，小梁間連接成網(wǎng)狀，骨小梁厚度較為一致。而OVX組和KD組骨小梁排列稀疏，總量明顯減少，骨小梁間連接性差，出現(xiàn)大量骨小梁盲端。辛伐他汀治療后骨小梁結(jié)構(gòu)、骨小梁壁厚度、形態(tài)均較OVX組和KD組明顯改善，結(jié)構(gòu)比較成熟，接近對照組(圖6)。

圖6 股骨遠(yuǎn)端HE染色結(jié)果Fig.6 Histological images of the distal femurs with HE staining

3 討論

本研究不僅觀察辛伐他汀對KD骨量丟失的作用，同時也觀察辛伐他汀對OVX骨量丟失的影響，較全面地評價辛伐他汀對KD骨量丟失的效應(yīng)。本文還從顯微CT和組織學(xué)兩個方面觀察了骨微結(jié)構(gòu)的改變，分別采用有限元模型和三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)評價了股骨遠(yuǎn)端松質(zhì)骨和中段皮質(zhì)骨的力學(xué)性能，從宏觀和微觀、結(jié)構(gòu)和功能等多個層面來評價辛伐他汀緩解骨量丟失的作用。本文的結(jié)果表明在辛伐他汀干預(yù)后，由OVX和KD引起的股骨遠(yuǎn)端松質(zhì)骨骨量減少得到了改善，股骨中段皮質(zhì)骨也得到增加，股骨三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)力學(xué)性能得到提升，說明辛伐他汀能夠改善由卵巢切除和生酮飲食導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松癥。

生酮飲食是一種以低碳水化合物而高脂為特點(diǎn)的飲食，用于治療難治性癲癇已有近百年的歷史，且它對心血管疾病的預(yù)防、神經(jīng)損傷的保護(hù)甚至腫瘤的治療也被越來越多的報道[12]。盡管KD被認(rèn)為是相對安全的治療方式，但是引起的不良反應(yīng)卻不容忽視，尤其在治療小兒難治性癲癇時對骨的生長發(fā)育和代謝的影響[4]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)了生酮飲食能誘導(dǎo)不同程度的骨量丟失、力學(xué)性能下降[5]，包括松質(zhì)骨骨容量減少、間隔增寬、連接密度變低、骨小梁數(shù)下降、皮質(zhì)骨厚度及剛度減弱等眾多方面。本研究結(jié)果顯示KD組較Sham組股骨遠(yuǎn)端松質(zhì)骨的TMD、Conn.D、BV/TV、Tb.N降低而Tb.Sp增加，再一次驗(yàn)證了KD會引起小鼠骨量的丟失。

血鈣、血磷與骨組織中的鈣、磷保持動態(tài)平衡，血鈣、血磷水平的測定能反映出骨組織的代謝情況。血鈣和血磷在骨骼生長中具有重要的作用，血鈣水平下降會導(dǎo)致破骨細(xì)胞活性的增加，引起骨骼中的鈣被溶解，從腎臟流失，而血磷水平升高會引發(fā)骨吸收加速，最終導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥[13]。本研究中各組之間的血清鈣或磷含量差異均沒有統(tǒng)計學(xué)意義，故OVX和KD引起的骨骼系統(tǒng)的變化不是由于鈣元素缺乏或血磷過高所引起。本研究股骨中段皮質(zhì)骨KD組變化不大，與前期研究皮質(zhì)骨厚度降低不一致，而其可能原因是兩次研究所用的生酮飲食的配方不同，舊配方中鈣元素含量偏低，而本研究用的生酮飲食中營養(yǎng)素含量符合美國營養(yǎng)學(xué)會(AIN93)大小鼠純化型標(biāo)準(zhǔn)飼料標(biāo)準(zhǔn)，保證了鈣、磷、維生素D的充足供應(yīng)。

臨床上治療骨質(zhì)疏松癥主要包括防止骨質(zhì)吸收和促進(jìn)骨形成兩種機(jī)制的藥物，前者有激素替代療法、選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑、雙膦酸鹽類，包括選擇性雄激素受體調(diào)節(jié)劑、甲狀旁腺素類似物、催產(chǎn)素類似物等[14]。然而對于已經(jīng)出現(xiàn)骨量丟失或是骨質(zhì)疏松的患者，促進(jìn)骨形成的藥物急需開發(fā)。辛伐他汀是3-羥基3-甲基戊二酰輔酶A還原酶抑制劑家族成員之一，通過抑制膽固醇合成鏈中的限速酶HMG-CoA還原酶，減少膽固醇合成，臨床上主要用于治療高脂血癥[15]。Mundy 等[6]首次發(fā)現(xiàn)，他汀類藥物有激活成骨細(xì)胞、促進(jìn)骨合成代謝的作用，大量研究已經(jīng)報道辛伐他汀可能通過促進(jìn)成骨細(xì)胞分化影響骨的形成[16-17]，可干擾破骨細(xì)胞、前體細(xì)胞向多核破骨細(xì)胞的融和過程[18-19]等機(jī)制對骨質(zhì)疏松有延緩改善的作用。本研究發(fā)現(xiàn)KD+ST組較KD組TMD、Conn.D、BV/TV、Tb.N有所增加而Tb.Sp下降，最大載荷、最大位移、能量吸收、剛度增高，辛伐他汀緩解了由生酮飲食導(dǎo)致的骨量丟失。除此之外，OVX+ST組和OVX組相比在上述指標(biāo)的變化趨勢相似，辛伐他汀同樣緩解由卵巢切除導(dǎo)致的骨量丟失，結(jié)論與其他學(xué)者實(shí)驗(yàn)結(jié)論一致。

本研究發(fā)現(xiàn)了辛伐他汀對生酮飲食導(dǎo)致的骨量丟失的緩解作用，但是并沒有研究不同劑量及不同時間點(diǎn)對生酮飲食所引起的骨質(zhì)疏松的影響。其次，本研究僅觀察到了辛伐他汀改善骨質(zhì)疏松的現(xiàn)象，并沒有涉及其作用的機(jī)制。

總而言之，生酮飲食能夠誘導(dǎo)松質(zhì)骨骨量丟失、生物力學(xué)性能下降，而辛伐他汀對于生酮飲食導(dǎo)致的骨量丟失和生物力學(xué)性能下降具有一定的緩解作用。