M2型巨噬細(xì)胞調(diào)控增生性瘢痕形成的權(quán)重基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析

王紫 孫婷也 陶筱婷 王昕 莊美婷 李海洲 李青峰

增生性瘢痕是皮膚組織損傷后傷口過(guò)度愈合形成的纖維增生性疾病。瘢痕的過(guò)度增生與攣縮，可導(dǎo)致局部畸形并產(chǎn)生功能障礙，是臨床治療的難題[1]。

研究表明，M2型巨噬細(xì)胞是參與增生性瘢痕形成的重要調(diào)控細(xì)胞。巨噬細(xì)胞是免疫反應(yīng)、組織修復(fù)和重塑過(guò)程中發(fā)揮主要作用的免疫細(xì)胞。在慢性炎癥中，持續(xù)積聚的巨噬細(xì)胞可導(dǎo)致組織破壞和纖維化。巨噬細(xì)胞的多能性與其表型密切相關(guān)。其中M1型為促炎表型，由Th1型細(xì)胞因子等激活后參與經(jīng)典的炎癥反應(yīng)[2]。M2型則由Th2型細(xì)胞因子等激活，產(chǎn)生抗炎因子并參與組織修復(fù)、重塑、發(fā)育及再生等過(guò)程[3]?，F(xiàn)有證據(jù)表明：①增生性瘢痕中IL-4 mRNA表達(dá)升高，是激活M2型巨噬細(xì)胞，誘導(dǎo)增生性瘢痕形成的重要因素[4]；②局部應(yīng)用IL-4和IL-13可激活M2型巨噬細(xì)胞，從而使組織中TGF-β表達(dá)上調(diào)，通過(guò)下游Smad信號(hào)通路直接促進(jìn)成纖維細(xì)胞膠原蛋白合成；③M2巨噬細(xì)胞可直接生成某些ECM（細(xì)胞外基質(zhì)）成分，包括Ⅵ型膠原蛋白、纖連蛋白和βIG-H3等[5-6]。由此可見，Th2細(xì)胞因子和M2型巨噬細(xì)胞在增生性瘢痕形成中具有重要作用。目前，這一免疫應(yīng)答的啟動(dòng)及調(diào)節(jié)機(jī)制仍未闡明，故尚無(wú)針對(duì)性的干預(yù)方法，臨床治療效果有限。

本研究擬采用加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析（WGCNA）[7]，對(duì)小鼠增生性瘢痕的全基因組表達(dá)數(shù)據(jù)GSE26390進(jìn)行處理，尋找與M2型巨噬細(xì)胞、Th2細(xì)胞因子和纖維化高度相關(guān)的共表達(dá)基因模塊，通過(guò)分析關(guān)鍵結(jié)點(diǎn)基因與目標(biāo)基因的關(guān)聯(lián)性，尋找到瘢痕形成過(guò)程中起到最關(guān)鍵作用的靶基因，從而為臨床預(yù)防和治療增生性瘢痕提供新的作用靶點(diǎn)，并為此類纖維化相關(guān)疾病的病理發(fā)生機(jī)制研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源

小鼠瘢痕的全基因組表達(dá)數(shù)據(jù)GSE26390（NCBI下載，數(shù)據(jù)來(lái)源為 Wong等的工作[8]）。

1.2 構(gòu)建共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)

在WGCNA算法中，每一個(gè)共表達(dá)基因組代表一個(gè)鄰接矩陣，鄰接矩陣包含了每對(duì)節(jié)點(diǎn)之間的關(guān)聯(lián)度，即每對(duì)基因 i和 j的相關(guān)系數(shù)為 Sij=|cor（m，n）|。算法的前提是共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)需服從無(wú)尺度網(wǎng)絡(luò)分布。因此，我們對(duì)基因的相關(guān)系數(shù)進(jìn)行加權(quán)處理。權(quán)重的選擇標(biāo)準(zhǔn)是能使得基因間的連接服從無(wú)尺度網(wǎng)絡(luò)分布（Scale-free networks），即連接數(shù)為 i的概率 P(i)與in成反比。

1.3 定義鄰接函數(shù)

最直接的鄰接函數(shù)使用硬閾值，節(jié)點(diǎn)之間的關(guān)聯(lián)度僅有“1”或“0”兩個(gè)數(shù)值。

即閾值設(shè)定為0.8，那么即便關(guān)聯(lián)度為0.79的節(jié)點(diǎn)仍定義為不相關(guān)。為了避免損失大量信息，我們引入冪指數(shù)鄰接函數(shù)，aij＝power(Sij，B)=|Sij|β（圖 1）。

圖1 冪指數(shù)鄰接函數(shù)Fig.1 Power exponent adjacency function

1.4 構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)模塊（Module）

模塊是指高度關(guān)聯(lián)的共表達(dá)基因群，在WGCNA算法中即為符合高度拓?fù)涓采w的節(jié)點(diǎn)群。我們引入TOM離散度來(lái)構(gòu)建分層聚類樹，利用動(dòng)態(tài)切割去除非必要基因，從而獲得所需的基因模塊組。

1.5 模塊向量基因（Eigengenes）

模塊向量基因代表模塊內(nèi)關(guān)聯(lián)度最高的基因。模塊向量基因可以通過(guò)對(duì)表達(dá)數(shù)據(jù)的奇異性分解得到（X=UDVT），X是指定模塊的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，V表示模塊向量基因。

1.6 將模塊與外部特征相關(guān)聯(lián)

計(jì)算每個(gè)基因模塊的特征值與外部特征的相關(guān)系數(shù)，然后利用t檢驗(yàn)分析基因重要性，確定模塊與外部特征是否相關(guān)，從而縮小基因模塊，定位關(guān)鍵基因（Hub gene）所在模塊。

1.7 模塊聯(lián)盟分析（Module membership，MM）和關(guān)鍵調(diào)控基因識(shí)別

通過(guò)計(jì)算基因i與模塊內(nèi)的向量基因的關(guān)聯(lián)得到模塊聯(lián)盟：MM(i)=|cor(x(i)，ME)|。然后通過(guò)基因重要性（Gene significance）尋找模塊中處于關(guān)鍵地位的靶基因。

2 結(jié)果

2.1 共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

為了盡量滿足無(wú)尺度網(wǎng)絡(luò)分布前提條件，編寫探索鄰接矩陣權(quán)重參數(shù)取值，使參數(shù)取值1～18，計(jì)算相應(yīng)的模型，選擇統(tǒng)計(jì)量繪制圖形（圖2），以權(quán)重值10為相關(guān)系數(shù)的平方取值較高（達(dá)到0.8）。

圖2 權(quán)重值的選擇與平均關(guān)聯(lián)性Fig.2 Weight value selection and average correlation

以TOM離散度來(lái)構(gòu)建分層聚類樹，使用動(dòng)態(tài)剪切法確定基因模塊后，依次計(jì)算每個(gè)模塊的特征向量值，然后對(duì)模塊進(jìn)行聚類分析，將距離較近的模塊合并成新的模塊，設(shè)置高度為0.25。

小鼠瘢痕的全基因組表達(dá)數(shù)據(jù)GSE26390分析結(jié)果顯示，小鼠瘢痕形成全基因組數(shù)據(jù)中共形成31個(gè)網(wǎng)絡(luò)模塊。這些模塊是通過(guò)基于拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)重疊的不相似性的聚類方法分析檢測(cè)到的，每一個(gè)模塊用一種顏色來(lái)表示（圖3）。不同基因間、不同模塊間的TOM 離散度不同，組成了熱圖（圖4）。

圖3 合并距離較近的模塊并形成最終模塊Fig.3 Merge modules closer together and form the finalmodule

圖4 TOM離散度熱圖Fig.4 TOM discrete heat map

2.2 核心調(diào)控基因的篩選

通過(guò)進(jìn)一步運(yùn)算基因模塊成員關(guān)系運(yùn)算（Gene-module membership），獲得了每個(gè)特定基因與各個(gè)模塊間的關(guān)系。結(jié)合前期文獻(xiàn)檢索得到的巨噬細(xì)胞、纖維化相關(guān)基因。挑選Blue2、magenta、green4及darkmargenta模塊進(jìn)行進(jìn)一步的模塊內(nèi)分析工作。其中，Blue2模塊與M2型巨噬細(xì)胞及纖維化相關(guān)表型有很強(qiáng)的正相關(guān)性（圖5）。

圖5 基因模塊成員關(guān)系圖，各個(gè)模塊與相關(guān)巨噬細(xì)胞及纖維化基因指標(biāo)的關(guān)系Fig.5 Gene module membership diagram,relationship between each module and related macrophage and fibrosis gene indicators

對(duì)Blue2模塊進(jìn)行進(jìn)一步的分析。首先，利用DAVID功能注釋生物信息學(xué)芯片分析系統(tǒng)（DAVID Bioinformatics Resources 6.7）對(duì)Blue2模塊進(jìn)行富集分析（Functional Annotation Clustering），形成 169 個(gè)類聚簇，其中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、膠原、組織愈合等類聚簇富集化程度較高。進(jìn)一步的KEEG信號(hào)通路富集分析發(fā)現(xiàn)34個(gè)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的相關(guān)信號(hào)通路，其中包括Leukocyte transendothelial migration、Fc gamma R-mediated phagocytosis、Toll-like receptor signaling 等多個(gè)免疫細(xì)胞相關(guān)信號(hào)通路（表1）。

表1 Blue2模塊的KEEG通路富集分析Table 1 Functional annotation clustering of KEEG pathway in the Blue2 module

上述結(jié)果表明，Blue2模塊是介導(dǎo)免疫細(xì)胞參與纖維化過(guò)程的主要模塊，對(duì)該模塊中的核心基因進(jìn)行調(diào)控，作為靶向干預(yù)手段，可能對(duì)治療瘢痕有一定作用。為此，我們?cè)谏鲜龌A(chǔ)上，將基因關(guān)聯(lián)性數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape程序，分別對(duì)重要模塊的基因作核心基因可視化分析。通過(guò)比較模塊內(nèi)連通性和基因重要性可以找到一些免疫調(diào)控瘢痕的關(guān)鍵基因。在模塊中與其他基因關(guān)聯(lián)性越多的基因，往往在模塊中的作用越重要。通過(guò)Cytoscape對(duì)基因間關(guān)聯(lián)性和模塊內(nèi)基因重要性的篩選，確定以下8個(gè)基因?yàn)槠鸬疥P(guān)鍵作用的核心調(diào)控基因：CLEC4A、CYBA、LOXL2、Hcvn1、NCKAP1L、PRRX2、LGALS9、CMTM3（圖 6）。

圖6 Blue2模塊中的核心基因可視化分析及相互關(guān)系Fig.6 Visualization analysis and correlation of core genes in the Blue2 module

3 討論

增生性瘢痕是一種發(fā)生于皮膚的纖維增生性疾病，涉及多種細(xì)胞、細(xì)胞因子及信號(hào)通路，發(fā)病機(jī)制仍未明確。以往病理學(xué)研究多以單個(gè)基因或蛋白為靶點(diǎn)，僅能幫助明確疾病發(fā)病機(jī)制的局部，難以從整體進(jìn)行系統(tǒng)分析研究。權(quán)重基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析（WGCNA）可尋找協(xié)同表達(dá)的基因模塊，并探索基因網(wǎng)絡(luò)與關(guān)注表型之間的關(guān)聯(lián)性。利用高通量的微陣列技術(shù)，應(yīng)用基因表達(dá)芯片得到實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，從轉(zhuǎn)錄（mRNA）水平探索基因網(wǎng)與疾病或者研究者關(guān)注的性狀之間的關(guān)系[9]。利用WGCNA，我們可應(yīng)對(duì)復(fù)雜數(shù)據(jù)的歸納整理，進(jìn)而用于關(guān)聯(lián)性狀研究、代謝通路建模、基因互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建等。研究中，通過(guò)權(quán)重基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析（WGCNA）處理小鼠增生性瘢痕的全基因組表達(dá)數(shù)據(jù)GSE26390，識(shí)別出與M2型巨噬細(xì)胞、Th2細(xì)胞因子以及纖維化高度相關(guān)的共表達(dá)基因模塊。隨后運(yùn)用分析關(guān)鍵結(jié)點(diǎn)基因與目標(biāo)基因關(guān)聯(lián)性，找到瘢痕形成過(guò)程中的8個(gè)核心調(diào)控基因：CLEC4A、CYBA、LOXL2、Hcvn1、NCKAP1L、PRRX2、LGALS9、CMTM3。

CLEC4A基因是C型凝集素/C型凝集素樣（CTL/CTLD）超家族的成員，其編碼蛋白存在于樹突細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和粒細(xì)胞中[10]。研究發(fā)現(xiàn)，其組成與巨噬細(xì)胞凝集素高度同源，可能參與了巨噬細(xì)胞抗原的提呈過(guò)程[11-12]。CYBA基因編碼細(xì)胞色素的輕鏈（α鏈）蛋白，是NADPH酶的重要組成部分[13-14]，而NADPH的氧化是吞噬細(xì)胞免疫反應(yīng)的初步過(guò)程。吞噬細(xì)胞通過(guò)利用氧化應(yīng)激過(guò)程中產(chǎn)生的活性氧（ROC）殺死外來(lái)物質(zhì)，完成相關(guān)免疫過(guò)程。當(dāng)CYBA基因發(fā)生突變時(shí)，可導(dǎo)致ROS水平升高，從而引起一系列免疫相關(guān)疾病，如慢性肉芽腫性疾病等[15]。LOXL2（賴氨酸氧化酶樣蛋白-2）是賴氨酰氧化酶家族（LOXs）的成員之一，其他成員包括 LOX、LOXL-1、LOXL-3、LOXL-4，能催化膠原及彈力蛋白的交聯(lián)，使其成為不可溶的纖維，對(duì)形成正常的細(xì)胞外基質(zhì)形態(tài)和完成組織修復(fù)有極其重要的作用[16]。研究認(rèn)為，LOXs在腫瘤抑制及轉(zhuǎn)移、細(xì)胞增殖和細(xì)胞趨化中扮演重要作用，也參與了肝臟、肺等臟器的纖維化過(guò)程[17-18]。電壓門控質(zhì)子通道-1（Hydrogen voltage gated channel 1，Hvcn1）的作用非常廣泛，包括調(diào)節(jié)氣道PH、嗜堿性粒細(xì)胞釋放組胺等[19-20]，有證據(jù)表明，在吞噬細(xì)胞中，Hvcn1釋放氫離子或?qū)⑵渚奂谕淌尚◇w內(nèi)可代償細(xì)胞代謝過(guò)程中產(chǎn)生的大量超氧化胺，從而保持細(xì)胞的活性和吞噬功能[21-22]。 Nck 相關(guān)蛋白-1（NCKAP1），編碼的蛋白也稱造血蛋白1（HEM1），HEM1是Scar/WAVE復(fù)合體的一部分[23]。在免疫應(yīng)答中活化的Rac（屬于Rho-GTPase家族）激動(dòng)細(xì)胞骨架F-actin的聚集，Scar/WAVE復(fù)合體在其中起信號(hào)傳遞的作用，因此，HEM-1是Rac的效應(yīng)蛋白[24]。研究認(rèn)為，HEM-1可能參與了免疫細(xì)胞黏附、趨化和吞噬過(guò)程中細(xì)胞骨架的重塑過(guò)程，阻斷該通路上的蛋白會(huì)導(dǎo)致免疫功能缺陷[25]。PRRX2是編碼表達(dá)一組DNA相關(guān)的人類同源蛋白質(zhì)（Homeobox）的轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因，參與調(diào)節(jié)胎兒成纖維細(xì)胞的增殖、胎兒和成人皮膚生發(fā)層細(xì)胞的增殖。相關(guān)研究表明，人類皮膚創(chuàng)傷后，在胎兒時(shí)期，PRRX2可上調(diào)該類蛋白的表達(dá)，促進(jìn)皮膚無(wú)瘢痕愈合，并只局限在傷口周圍組織；而在成人時(shí)期，PRRX2在皮膚瘢痕愈合調(diào)節(jié)中呈弱表達(dá)[26]。LGALS9（Lectin galactoside-binding soluble 9），該基因編碼的蛋白是一種可溶于水的S型半乳糖凝素。研究表明，LGLAS9編碼表達(dá)的Galectin-9可通過(guò)多種途徑參與調(diào)節(jié)T細(xì)胞免疫反應(yīng)[27]。而CMTM3（CKLF-like MARVEL transmembrane domain containing 3）基因是趨化因子樣基因超家族（Chemokine-like factor gene superfamily）中的一員。在免疫系統(tǒng)方面，CMTM3基因不僅高表達(dá)于外周血中B淋巴細(xì)胞，也高表達(dá)于富含B細(xì)胞的脾臟中，可能影響B(tài)細(xì)胞的分化成熟及免疫功能；同時(shí)也高表達(dá)于CD4+T細(xì)胞及單核細(xì)胞中，可能對(duì)免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)發(fā)揮作用[28]。

因此，M2型巨噬細(xì)胞和Th2型細(xì)胞因子通過(guò)上述8個(gè)核心調(diào)控基因，可能經(jīng)由多種途徑促進(jìn)組織膠原蛋白合成及纖維化：激活的M2型巨噬細(xì)胞使組織中TGF-β表達(dá)上調(diào)，通過(guò)下游Smad信號(hào)通路直接促進(jìn)成纖維細(xì)胞膠原蛋白合成[29]；活化的M2型巨噬細(xì)胞合成及成纖維細(xì)胞遷移過(guò)程中產(chǎn)生纖連蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)成分，促進(jìn)纖維化進(jìn)程[30]；在M2型巨噬細(xì)胞占優(yōu)勢(shì)的組織中，精氨酸酶活性強(qiáng)于誘導(dǎo)型一氧化氮合酶系統(tǒng)，從而促進(jìn)膠原蛋白合成及細(xì)胞增殖，進(jìn)而導(dǎo)致增生性瘢痕形成[31]。本研究結(jié)果為相關(guān)纖維化疾病的病理發(fā)生機(jī)制的研究及臨床預(yù)防、治療增生性瘢痕提供了新的靶點(diǎn)，拓寬了思路。本研究采用的全基因表達(dá)數(shù)據(jù)從小鼠增生性瘢痕皮膚中獲得，而人類皮膚結(jié)構(gòu)及免疫細(xì)胞的活化和浸潤(rùn)狀態(tài)與瘢痕模型小鼠仍有差異，因此需要進(jìn)一步探究這些基因在增生性瘢痕形成中的相互作用，以期更透徹地認(rèn)識(shí)M2型巨噬細(xì)胞及Th2型細(xì)胞因子參與增生性瘢痕形成的過(guò)程，提高相關(guān)纖維化疾病的診療水平。