人耳軟骨細(xì)胞凍存復(fù)蘇后的體外成軟骨能力及體內(nèi)轉(zhuǎn)歸的研究

于瑤 殷宗琦 李丹 周廣東 曹誼林 劉豫

軟骨缺損在臨床上較為常見，因軟骨自我修復(fù)與再生能力低，自體軟骨供體有限，使軟骨缺損修復(fù)極為困難[1]。組織工程技術(shù)為從根本上解決組織、器官缺損的治療提供了新的希望[2]，但組織構(gòu)建過程所采用的支架材料極易在皮下等免疫機(jī)能活躍的移植部位引發(fā)炎癥反應(yīng)，干擾軟骨再生。

我們的前期研究已建立了基于自體軟骨細(xì)胞的組織工程軟骨膜片和可注射軟骨再生技術(shù)。該技術(shù)不依賴任何支架材料，不存在支架材料引起的免疫排斥反應(yīng)，僅需極少量種子細(xì)胞，即可在體外誘導(dǎo)培養(yǎng)成新生軟骨膜片[3]，可用于修復(fù)氣管損傷、耳再造或全鼻再造等[4]。此外，將新生的軟骨膜片進(jìn)行顆?；庸ず笾瞥绍浌莿驖{，可用于微創(chuàng)注射隆鼻或改善面部凹陷畸形[5]。但該技術(shù)采用的自體細(xì)胞來源有限，獲得方式有創(chuàng)，且軟骨細(xì)胞反復(fù)傳代易老化，其形態(tài)、活性、表型會(huì)發(fā)生變化，部分功能將喪失。因此，對(duì)剩余種子細(xì)胞的儲(chǔ)存就顯得極為重要。

目前，深低溫冷凍保存是應(yīng)用于各類細(xì)胞長期儲(chǔ)存最普遍的方式。本研究利用深低溫冷凍保存技術(shù)，將獲得的人耳軟骨細(xì)胞進(jìn)行1個(gè)月的儲(chǔ)存，并在復(fù)蘇后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增、傳代及體內(nèi)外軟骨再生等一系列實(shí)驗(yàn)，研究凍存對(duì)人耳軟骨細(xì)胞的細(xì)胞活力、增殖和體外/體內(nèi)軟骨再生能力的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

普通健康裸鼠 （上海甲干生物科技有限公司），4～6周齡，雌雄不限，用于可注射軟骨體內(nèi)植入評(píng)價(jià)。實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格依照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)指南的要求進(jìn)行。

1.2 實(shí)驗(yàn)器材與試劑

高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素-鏈霉素-兩性霉素 B（Hyclone公司，美國），膠原酶（Sigma公司，美國）、0.25%胰蛋白酶（Gibco 公司，美國），bFGF（R&D 公司，美國），CCK-8試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所），Quant-iT PicoGreen dsDNA試劑盒（Sigma公司，美國），Ⅱ型膠原定量試劑盒（Sigma公司，美國），酶標(biāo)儀 （Multiskan Ascent V1.22,354-00187T，Instrument Type 公司，美國），全波長酶標(biāo)儀（Thermo Fisher公司，美國），程序降溫儀（Thermo Fisher公司，美國）。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及設(shè)計(jì)

軟骨種子細(xì)胞的獲取過程都存在一定的創(chuàng)傷性，為避免再次獲取種子細(xì)胞造成的創(chuàng)傷、反復(fù)傳代對(duì)細(xì)胞的影響以及種子細(xì)胞的浪費(fèi)，本研究將原代軟骨細(xì)胞培養(yǎng)并擴(kuò)增至第1代 （P1），然后分成2組：將收集的P1代軟骨細(xì)胞用FBS重懸后加入含10%DMSO的FBS混合液，經(jīng)程序降溫后儲(chǔ)存至液氮中，1個(gè)月后復(fù)蘇，隨后進(jìn)行擴(kuò)增、傳代與種膜，設(shè)為實(shí)驗(yàn)組（Exp組）；細(xì)胞不經(jīng)凍存并繼續(xù)擴(kuò)增和傳代至第3代（P3），按相同密度接種生成軟骨膜片，設(shè)為對(duì)照組（Ctrl組）。評(píng)估兩組體外軟骨膜片的濕重、體積及形成質(zhì)量。將兩組軟骨膜片分別顆?；笞⑸渲谅闶笃は?，體內(nèi)培養(yǎng)8周后評(píng)估體內(nèi)再生軟骨的濕重、體積、軟骨得率及形成質(zhì)量等。

1.4 人耳軟骨細(xì)胞的獲取和培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用的臨床樣本均來源于小耳畸形患者術(shù)中廢棄的殘耳軟骨，均獲患者知情同意。

將殘耳軟骨塊剪成1 mm3碎塊，加入0.15%膠原酶，震蕩消化8～12 h，過濾，收集，去上清液，高糖DMEM重懸，按照0.5×106個(gè)/皿的密度接種于培養(yǎng)皿中，37℃、5%CO2及飽和濕度下培養(yǎng)。每3天換液一次，待軟骨細(xì)胞生長至75%～80%融合時(shí)傳代[6-7]。

1.5 細(xì)胞凍存與復(fù)蘇

收集細(xì)胞，F(xiàn)BS制備細(xì)胞懸液。配制冷凍保存溶液（使用前配制）：在離心管中加入含10%DMSO的FBS混合液，制成凍存液。取與細(xì)胞懸液等量的凍存液，加入細(xì)胞懸液中，制成細(xì)胞凍存懸液，最后DMSO的濃度為 5%～10%，細(xì)胞濃度為（1～5）×106cells/mL，分裝于冷凍保存管中，1～2 mL/vial。放入程序降溫儀中，按預(yù)先設(shè)定的程序執(zhí)行，溫度達(dá)到-80℃以下時(shí)，轉(zhuǎn)入液氮中保存。復(fù)蘇時(shí)用37℃溫水快速晃動(dòng)解凍，加入培養(yǎng)液后按0.5×106個(gè)/皿的密度接種到新培養(yǎng)皿中，隔天換液。

1.6 繪制細(xì)胞生長曲線

用CCK-8試劑盒測P3及復(fù)蘇后P3細(xì)胞的第1、3、5、7、9 天的 OD 值，繪制成細(xì)胞生長曲線。

1.7 構(gòu)建體外軟骨膜片

將人殘耳軟骨細(xì)胞收集后，用常規(guī)DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液重懸，按2.0×106個(gè)/孔的濃度接種于6孔板中，常規(guī)培養(yǎng)液培養(yǎng)3 d后改用無血清軟骨重分化培養(yǎng)液，每天換液，培養(yǎng)2周[8]。

1.8 軟骨膜片體外觀察、濕重體積測定及顆粒化

棄培養(yǎng)液，PBS清洗3遍，用鑷子將膜片與6孔板分離，用紗布盡量粘掉膜片表面的液體，稱量并記錄單個(gè)膜片的濕重，用排水法測得單個(gè)膜片體積。將膜片剪至漿狀后PBS清洗并離心3遍（1 800 r/mim，5 min），棄PBS，將漿狀軟骨膜片分裝至1 mL螺旋口注射器內(nèi)。全程均為無菌操作。

1.9 體內(nèi)再生軟骨大體觀察、濕重體積及軟骨得率測定

注射后 8周取材，剝離表面的包膜，進(jìn)行大體觀察及濕重、體積及軟骨得率的測量。

1.10 組織學(xué)染色

將標(biāo)本固定于4%多聚甲醛 24 h，脫水、石蠟包埋，切片（厚度為 5 μm），進(jìn)行蘇木素-伊紅染色，觀察組織結(jié)構(gòu)及細(xì)胞外基質(zhì)分泌情況。

1.11 生化成分定量檢測

采用Alcian Blue法檢測再生軟骨組織中的GAG含量，首先根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度梯度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，按照酶標(biāo)儀比色結(jié)果（波長520 nm）與標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本GAG含量。以樣本堿水解法檢測再生軟骨的總膠原含量，根據(jù)酶標(biāo)儀比色結(jié)果（波長550 nm）與計(jì)算公式得到樣本中總膠原的含量。采用hoechst 33258染色法進(jìn)行DNA定量檢測，根據(jù)DNA標(biāo)準(zhǔn)品濃度梯度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線后，按照酶標(biāo)儀檢測結(jié)果（激發(fā)光為480 nm，發(fā)射光為520 nm）與標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣本中DNA含量。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

分析體內(nèi)外再生軟骨的濕重、體積、生物化學(xué)定量檢測結(jié)果及體內(nèi)再生軟骨的軟骨得率等定量指標(biāo)，以（x±s）表示，SPSS 17.0 軟件進(jìn)行單樣本 t檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組軟骨細(xì)胞形態(tài)、活性、功能

光鏡下兩組軟骨細(xì)胞的大小、形態(tài)均無明顯變化，未出現(xiàn)增大、鋪展、老化、去分化等，傳代擴(kuò)增到第3代時(shí)，細(xì)胞大小及形態(tài)均無明顯變化，2～3 d達(dá)80%～90%融合。復(fù)蘇后擴(kuò)增至第3代時(shí)依然呈現(xiàn)良好的形態(tài)特征?；?死染色、HE及阿利新藍(lán)染色可觀察到兩組軟骨細(xì)胞完全伸展后呈三角形或多角形，且細(xì)胞可正常分泌ECM（圖1）。

2.2 細(xì)胞增殖曲線

通過生長曲線可觀察到第3天時(shí)兩組軟骨細(xì)胞增殖能力均明顯增強(qiáng)，第7天開始細(xì)胞增殖變慢。增殖曲線符合細(xì)胞生長規(guī)律，并顯示Ctrl組與Exp組細(xì)胞增殖情況無明顯差異（圖2）。

2.3 細(xì)胞經(jīng)程控降溫儀程序降溫

本實(shí)驗(yàn)中降溫速度為-0.01～-60℃/min，溫控精確度達(dá)到了0.01℃/min，溫度達(dá)到-80℃以下時(shí)，轉(zhuǎn)入液氮中長期保存。有效控制了DMSO在4℃以上與細(xì)胞接觸的時(shí)間。

2.4 體外軟骨膜片及顆?；浌?/h3>

兩組軟骨細(xì)胞均按照相同密度接種，經(jīng)體外培養(yǎng)2周后，均形成了瓷白色、表面光滑且具有一定厚度及力學(xué)強(qiáng)度的軟骨膜片（膜片有一定的韌性、鑷子正常操作過程中無斷裂、破碎等現(xiàn)象）；用無菌剪刀將體外軟骨膜片剪碎成漿狀，分裝至1 mL螺口注射器中（圖 3）。

2.5 體內(nèi)再生軟骨組織大體及組織學(xué)觀察

兩組可注射軟骨注射至裸鼠皮下即刻，均有一定程度的水腫樣表現(xiàn)，8周時(shí)均有一定程度的吸收；8周后取材，兩組顆粒化軟骨均可在體內(nèi)形成軟骨樣組織塊，Ctrl組形成的軟骨樣組織顏色為白色，表面較光滑，具有一定的力學(xué)強(qiáng)度；Exp組表面光滑，顏色、質(zhì)地與Ctrl組相比較無明顯差異，但體積略??；兩組軟骨樣組織均有一定的硬度和彈性。HE染色可見體內(nèi)再生軟骨樣組織中軟骨塊并不是連續(xù)的，而是呈島狀分布，兩組軟骨樣組織均形成軟骨陷窩，陷窩間有藍(lán)染的胞外基質(zhì)成分，形態(tài)成熟，Ctrl組軟骨塊分布較稀疏，Exp組較為緊密（圖4）。

2.6 體外再生軟骨濕重及體積

體外培養(yǎng)2周時(shí)，Ctrl組及Exp組的體外膜片的濕重分別為（0.42±0.04） g和（0.38±0.45） g；體積為（0.33±0.03） mL 和（0.34±0.04） mL。 統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，Ctrl組膜片濕重與Exp組之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）；Ctrl組膜片體積與 Exp 組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.7 體內(nèi)再生軟骨濕重、體積及軟骨得率

體內(nèi)培養(yǎng)8周，Ctrl組及Exp組體內(nèi)再生軟骨的濕重分別為（0.17±0.005） g 和（0.18±0.005） g；體積為（0.21±0.02） mL 和（0.11±0.013） mL；軟骨得率為（42±4.00）%和（41.2±2.68）%。 Ctrl組體內(nèi)再生軟骨的濕重與Exp組比較，差異明顯（P＜0.05）；兩組體內(nèi)再生軟骨的體積和再生軟骨的得率均無明顯差異（P＞0.05）。由此可知，凍存對(duì)體內(nèi)軟骨的再生無明顯影響。

2.8 體內(nèi)外再生軟骨的DNA、總膠原及GAG定量檢測

體外培養(yǎng)2周后，Ctrl組與Exp組的DNA含量分別為（4.41±0.17）ng/mg 和（4.20±0.07） ng/mg；總膠原含量為（0.39±0.004） μg/mg和（0.35±0.01） μg/mg；GAG 含量為（10.75±0.69） μg/mg和（10.19±0.46） μg/mg。兩組的DNA及GAG定量無顯著性差異 （P＞0.05）；Ctrl組總膠原定量與Exp組相比差異明顯（P＜0.05）。

體內(nèi)8周后，Ctrl組與Exp組的DNA含量分別為（16.17±0.34） ng/mg 和（15.86±0.07）ng/mg；總膠原含量為（0.34±0.08） μg/mg 和（0.492±0.08） μg/mg；GAG含量為（17.05±0.83） μg/mg和（16.22±1.09）μg/mg。兩組的DNA及GAG定量無顯著性差異 （P＞0.05）；Ctrl組總膠原定量與Exp組相比差異明顯 （P＜0.05）?？傮w觀察，體內(nèi)再生軟骨的DNA、總膠原、GAG含量整體高于體外再生軟骨。

圖1 兩組軟骨細(xì)胞的形態(tài)、活/死及組織學(xué)染色Fig.1 Morphological observation,live/dead and histological staining of chondrocytes in the 2 groups

圖2 兩組軟骨細(xì)胞的增殖曲線Fig.2 Growth curve of chondrocytes in the 2 groups

圖3 體外2周軟骨膜片F(xiàn)ig.3 Chondrocyte sheet after 2 weeks'culture in vitro

圖4 體內(nèi)培養(yǎng)8周再生軟骨的大體及組織學(xué)觀察Fig.4 Gross view and histological observation of regenerated cartilage after 8 weeks'culture in vitro

3 討論

組織工程技術(shù)為從根本上解決組織、器官缺損的治療提供了新的希望[9]。軟骨膜片由自體軟骨細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成，不依賴任何支架材料，不存在支架材料引起的免疫排斥反應(yīng)，已在軟骨再生領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[10-11]。軟骨膜片進(jìn)行顆粒化加工后制成軟骨勻漿，可用于微創(chuàng)注射隆鼻或改善面部凹陷畸形[9]。但種子細(xì)胞的獲取依然是限制其發(fā)展的一個(gè)重要因素。

目前，低溫冷凍保存是應(yīng)用于各類細(xì)胞長期儲(chǔ)存的最普遍方式。凍存和復(fù)蘇的過程包括：程序降溫-低溫儲(chǔ)存-融凍-培養(yǎng)-傳代-接種，其中任一步驟的失敗都會(huì)影響細(xì)胞的活性，并導(dǎo)致細(xì)胞不可逆的損傷[12]。在方法得當(dāng)、操作正規(guī)的基礎(chǔ)上，DMSO低溫凍存的人軟骨細(xì)胞復(fù)蘇后，其細(xì)胞形態(tài)與凍存前無明顯差異，增殖與分化能力可保持3～4代[13]。本實(shí)驗(yàn)中，從光鏡、細(xì)胞爬片染色、增殖曲線來看，Ctrl組與Exp組細(xì)胞均可正常增殖，且具備良好的活力和基質(zhì)分泌功能。體外再生軟骨樣組織的大體及組織學(xué)染色觀察可見Ctrl組與Exp組細(xì)胞均形成大量軟骨陷窩，且有蛋白聚糖及Ⅱ型膠原的表達(dá)，兩組DNA及總GAG定量均未表現(xiàn)出明顯差異。實(shí)驗(yàn)組體外膜片濕重及總膠原定量略高于對(duì)照組，提示Exp組膜片含水量較高及所分泌的總膠原較高，總膠原的組成成分及兩組間的差異尚需更為深入的研究。

體內(nèi)培養(yǎng)8周后，兩組再生軟骨樣組織表面較光滑，顏色為白色；組織學(xué)染色可見兩組軟骨細(xì)胞均形成大量軟骨陷窩；軟骨得率都在40%左右；兩組DNA及總GAG定量均未表現(xiàn)出明顯差異；體內(nèi)再生軟骨的總膠原定量兩組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這可能是由于體內(nèi)再生軟骨樣組織中軟骨塊并非連續(xù)存在而是成島狀分布導(dǎo)致的。

通過濕重、體積、軟骨得率、組織學(xué)及生化成分定量檢測可觀察到，Ctrl組體內(nèi)外再生軟骨與Exp組相比，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說明凍存對(duì)軟骨細(xì)胞沒有明顯影響。

本實(shí)驗(yàn)中，兩組軟骨細(xì)胞在體內(nèi)外均形成了正常的軟骨樣組織，說明凍存對(duì)體內(nèi)外軟骨再生能力無明顯影響。但本實(shí)驗(yàn)凍存的時(shí)間僅1個(gè)月，更長期的凍存是否會(huì)對(duì)再生軟骨造成影響尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。

4 結(jié)論

經(jīng)凍存的軟骨細(xì)胞在形態(tài)、活力、增殖能力、軟骨特異的GAG分泌能力、體內(nèi)外軟骨形成能力等方面與未經(jīng)凍存的軟骨細(xì)胞相比沒有明顯差異。