糖化bFGF對(duì)HUVEC體外血管化的效應(yīng)研究

肖嫻 黃瑤 倪鵬文 謝挺

目前,全球3.87億糖尿病患者中，有15%的患者引發(fā)足部潰瘍，每20秒就有1例糖尿病下肢潰瘍患者需接受截肢治療[1]。糖尿病導(dǎo)致機(jī)體病變主要通過(guò)4條途徑：多元醇通路活性增高、晚期糖化終末產(chǎn)物（Advanced glycation end products，AGEs）形成增加、蛋白激酶 C（Protein kinase C，PKC）激活和氨基己糖通路活性增高[2]。文獻(xiàn)表明，AGEs局部蓄積的病理效應(yīng)導(dǎo)致皮膚微環(huán)境的改變，是糖尿病創(chuàng)面難愈的重要因素。在創(chuàng)面修復(fù)的諸多環(huán)節(jié)中，bFGF是維系皮膚組織正常代謝和創(chuàng)面愈合過(guò)程的重要成員。bFGF主要來(lái)源于包括內(nèi)皮細(xì)胞在內(nèi)的多種組織細(xì)胞，并廣泛分布于人體組織，通過(guò)與受體結(jié)合，對(duì)局部組織細(xì)胞增殖、趨化，細(xì)胞外基質(zhì)生成和微血管化有明顯作用[3]。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，bFGF在慢性潰瘍和增生性瘢痕組織中的表達(dá)增多[4]；糖尿病小鼠腦脊液中，可檢測(cè)出被顯著糖化的bFGF[5]。這些研究結(jié)果提示，bFGF作為一種蛋白質(zhì)，理論上在糖尿病皮膚組織中是可以被糖化的，生成糖化bFGF。

創(chuàng)面愈合時(shí)，血管內(nèi)皮細(xì)胞是皮膚的主要修復(fù)細(xì)胞之一。創(chuàng)面正常愈合必須依靠足量、有效的血管化，血管內(nèi)皮細(xì)胞通過(guò)發(fā)揮其增殖和遷移能力，對(duì)維護(hù)血管完整性、促進(jìn)血管再生起重要作用。但AGEs的蓄積，抑制了內(nèi)皮細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡。將葡萄糖與bFGF混合后的基質(zhì)膠種植模型植入非糖尿病大鼠中，可抑制血管生成和肉芽形成[6]。bFGF糖化后發(fā)生功能異常，使其不能發(fā)揮正常的促愈效應(yīng)，可能是創(chuàng)面難愈的重要原因之一。本實(shí)驗(yàn)擬制備糖化bFGF模型，了解bFGF糖化后對(duì)其主要效應(yīng)細(xì)胞-血管內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，以期為糖尿病創(chuàng)面愈合中生長(zhǎng)因子的相關(guān)研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

bFGF（美國(guó) Gibco公司）；CHCA、果糖粉劑、葡萄糖-6-磷酸粉劑（美國(guó)Sigma公司）；乙腈、三氟乙酸（德國(guó) Merck 公司）；SyncronisC18 column（美國(guó) Thermo公司）；HUVEC、內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基（即用型）、胰蛋白酶/EDTA（0.04%/0.03%）、胰蛋白酶中和溶液（TNS）、無(wú)血清凍存液、HEPES緩沖鹽溶液（德國(guó)Promocell公司）；CCK-8試劑盒（日本DOJINDO公司）；Matrigel Basement Membrane Matrix（美國(guó)Corning公司）；FITC Annexin V凋亡檢測(cè)試劑盒（美國(guó)BD公司）。

Mass Standards Kit for the 5800 Proteomics Analyzer（美國(guó) ABI公司）；5800 MALDI TOF/TOFTM Analyzer（美國(guó) SCIEX 公司）；Ultimate 3000UHPLC（美國(guó)Thermo公司）。

1.2 方法

1.2.1 bFGF和糖化bFGF的制備

分別用果糖和葡萄糖-6-磷酸（G-6-P）制備糖化bFGF[7-8]。以下為果糖制備糖化bFGF的方法（同G-6-P制備糖化bFGF方法）。①制備0.25 M果糖溶液。將0.45 g果糖粉劑分別溶解于10 mL PBS中，震蕩混勻，用0.22 μm濾器過(guò)濾備用；②制備10 μg/mL bFGF溶液。將1 mg bFGF粉劑溶解于1 mL PBS溶液中，形成1 mg/mL bFGF溶液，取出其中10 μL bFGF溶液加入990 μL PBS溶液中；③取出500 μL 0.25 M 果糖溶液和 500 μL 10 μg/mL bFGF 溶液，將其混合于1.5 mL Eppendorf管中，形成5 μg/ml糖化bFGF溶液，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育7 d。同時(shí)，另外制備5 μg/ml糖化bFGF溶液，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育48 h；④制備5 μg/mL bFGF溶液。分別取出 500 μL PBS 溶液和 500 μL 10 μg/mL bFGF 溶液，將其混合于1.5 ml Eppendorf管中。

1.2.2 質(zhì)譜鑒定糖化bFGF體外模型

取制備好的糖化bFGF樣品適量，使用C8StageTip柱進(jìn)行鹽分洗脫，上樣到色譜柱的蛋白樣品使用0.1%的三氟乙酸（TFA）重復(fù)沖洗多次，確保樣品中鹽分被充分洗脫，最后使用80%的乙晴（ACN）和0.1%TFA將蛋白洗脫下來(lái)，保存待檢。

取1 μL糖化bFGF樣品，直接點(diǎn)于樣品靶上，讓溶劑自然干燥，再取0.5 μL過(guò)飽和的α-氰基-4-羥基肉桂酸（CHCA）基質(zhì)溶液（溶劑為 50%ACN，0.1%TFA）點(diǎn)至對(duì)應(yīng)靶位上并自然干燥。樣品靶經(jīng)氮?dú)獯祪艉蠓湃雰x器進(jìn)靶槽并用5800串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析，激光源為355 nm波長(zhǎng)的Nd:YAG激光器，加速電壓為2.5 KV，采用正離子模式和自動(dòng)獲取數(shù)據(jù)的模式采集數(shù)據(jù)，質(zhì)量掃描范圍為800～35 000 Da。

1.2.3 色譜法分析糖化bFGF模型成分

分別取50 μL bFGF溶液和 100 μL糖化 bFGF溶液，濃縮后，用 18 μL A 液（0.1%TFA）復(fù)溶后，上樣；進(jìn)樣量為15 μL；紫外吸收波長(zhǎng)254 nm；流動(dòng)相包括 A 液（0.1%TFA）和 B 液（CAN）液；色譜梯度：總60 min（3～30 min，5%～50%B）。

1.2.4 bFGF和糖化bFGF干預(yù)條件的確定

參考文獻(xiàn)[8-10]方法，選擇2～80 ng/mL的濃度梯度來(lái)篩選bFGF和糖化bFGF的干預(yù)濃度。利用CCK-8方法，觀察兩組OD值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。確定干預(yù)濃度的標(biāo)準(zhǔn)是：兩組之間OD值差異最為明顯。

配制 80 ng/mL、40 ng/mL、20 ng/mL、10 ng/mL、4 ng/mL、2 ng/mL的 bFGF和糖化 bFGF （表 1-2）。bFGF和糖化bFGF的初始濃度為5 μg/mL。

表1 2～80 ng/mL bFGF的配制Table 1 Preparation of 2-80 ng/mL bFGF

表2 2～80 ng/mL糖化bFGF的配制Table 2 Preparation of 2-80 ng/mL glycated bFGF

用2～80 ng/ml濃度的bFGF或糖化bFGF干預(yù)96孔板中的HUVEC，培養(yǎng)24 h后以CCK-8法測(cè)量OD值。

1.2.5 培養(yǎng)HUVEC

預(yù)先將HUVEC生長(zhǎng)培養(yǎng)基（即用型）10 mL加入培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱30 min；取出細(xì)胞株后迅速置于37℃恒溫水浴箱，靜置2 min，吸取細(xì)胞懸液至預(yù)溫過(guò)的培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱；待細(xì)胞生長(zhǎng)至培養(yǎng)瓶面積的70%～90%，即可傳代。傳代時(shí)棄去舊培養(yǎng)液，按100 μL/cm2的比例加入HEPE緩沖液，輕柔沖洗細(xì)胞15 s后棄去；然后按100 μL/cm2的比例加入EDTA （0.04%/0.03%）溶液，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，待80%細(xì)胞變圓后，按100 μL/cm2的比例加入胰蛋白酶中和液TNS；收集細(xì)胞懸液，220 g離心4 min，棄去上清液；加入適量?jī)?nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱。

1.2.6 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)bFGF和糖化bFGF干預(yù)人真皮微血管內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）后的細(xì)胞增殖效應(yīng)

將指數(shù)生長(zhǎng)期的HUVEC用胰蛋白酶/EDTA（0.04%/0.03%）消化，按 5×103個(gè)/孔的密度接種于96孔板，每組5個(gè)副孔，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)；次日，每孔用100 μL PBS溶液洗板。分別用內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基、20 ng/mL bFGF內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基、20 ng/mL糖化bFGF內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基刺激細(xì)胞，每孔 100 μL；分別于刺激后 1 d、3 d及 7 d后測(cè)定HUVEC的增殖活性。測(cè)定前，棄96孔板中舊培養(yǎng)液，每孔用100 μL PBS溶液洗板。將內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基和CCK-8溶液按10∶1的比例混合后，每孔加入100 μL混合液，同時(shí)設(shè)置空白孔，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱，于2 h后用酶標(biāo)儀在450 nm處讀取吸光度值。實(shí)驗(yàn)分成3組：①空白組（0 ng/mL bFGF內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基）；②實(shí)驗(yàn)組（含有20 ng/mL糖化bFGF的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基）；③對(duì)照組（含有20 ng/mL bFGF的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基）。該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。以空白組第1天OD值均數(shù)為基數(shù)，其余各時(shí)相點(diǎn)（含空白組第3天及第7天、實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組所有時(shí)相點(diǎn)）OD值除以空白組第1天OD值均數(shù)，獲得細(xì)胞增殖百分?jǐn)?shù)表示細(xì)胞增殖活性。

1.2.7 bFGF和糖化bFGF干預(yù)后的HUVEC血管形成能力

將Matrigel Basement Membrane Matrix置于冰盒后放入4℃冰箱過(guò)夜，同時(shí)將實(shí)驗(yàn)使用的48孔板和Tip頭均置于4℃冰箱預(yù)冷；次日，將液化后的Matrigel Basement Membrane Matrix 按 150 μL/孔加入48孔板中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱30 min；將指數(shù)生長(zhǎng)期的HUVEC用胰蛋白酶/EDTA（0.04%/0.03%）消化，待80%細(xì)胞變圓，加入胰蛋白酶中和液TNS，以220 g離心4 min，棄上清，加內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)，按2×104個(gè)/孔的密度接種于已固化于48孔板的Matrigel Basement Membrane Matrix中，每組3個(gè)副孔，同時(shí)加入100 μL內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基、40 ng/mL bFGF內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基、40 ng/mL糖化bFGF內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基，形成終濃度為0 ng/mL、20 ng/mL bFGF和20 ng/mL糖化bFGF的刺激液，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱，6 h后倒置顯微鏡觀察血管樣結(jié)構(gòu)。實(shí)驗(yàn)分成3組：①空白組 （0 ng/mL bFGF內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基）；②實(shí)驗(yàn)組（含20 ng/mL糖化bFGF的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基）；③對(duì)照組（含20 ng/mL bFGF的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果采用Image J軟件分析，包括節(jié)點(diǎn)數(shù)量、交叉點(diǎn)數(shù)量、網(wǎng)眼數(shù)量和主干分段數(shù)量。

1.2.8 bFGF和糖化bFGF干預(yù)后HUVEC的凋亡

將指數(shù)生長(zhǎng)期的HUVEC用胰蛋白酶/EDTA（0.04%/0.03%）消化，待80%細(xì)胞變圓，加入胰蛋白酶中和液TNS，220 g離心4 min，棄上清，加入內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基，重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)，按1×104個(gè)/孔的密度接種于6孔板，每組3個(gè)副孔，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)；次日，棄原培養(yǎng)板中的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基，每孔用1 mL PBS溶液洗板一次。分別用內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基、20 ng/mL bFGF內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基、20 ng/mL糖化bFGF內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基刺激細(xì)胞，每孔2 mL；分別于刺激后1 d、3 d、7 d后測(cè)定HUVEC的凋亡。測(cè)定當(dāng)日，吸取6孔板中舊培養(yǎng)液至流式管中，每孔用1 mL PBS溶液洗板一次后，加入500 μL無(wú)EDTA胰酶，顯微鏡下觀察細(xì)胞同時(shí)晃動(dòng)6孔板，待細(xì)胞變圓漂起即用原內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基中止消化。輕柔吹打細(xì)胞后，將細(xì)胞懸液吸至流式管中，1 500 r/min離心5 min，棄上清并倒扣于濾紙上。將試劑盒中的10×緩沖液用PBS配制成1×工作液，每管加入60 μL工作液重懸細(xì)胞，其中空白管加入100 μL工作液用于測(cè)定細(xì)胞大小及活性。然后除空白管外，每管加入3.8 μL Annexin V試劑，室溫避光10 min后，除空白管外，每管再依次加入3.8 μL PI試劑和100 μL工作液，充分混勻后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。實(shí)驗(yàn)分成3組：①空白組（0 ng/mL bFGF內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基）；②實(shí)驗(yàn)組（含有20 ng/mL糖化bFGF的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基）；③對(duì)照組（含有20 ng/mL bFGF的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基）。該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.9 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 體外糖化bFGF制備

MALDI-TOF-MS分析 bFGF和糖化 bFGF，確定bFGF相對(duì)分子量為16 700 Da，而使用G-6-P孵育48 h和7 d的糖化bFGF并未找到相應(yīng)分子量峰值，使用果糖孵育7 d的糖化bFGF也未找到相應(yīng)峰值，僅僅發(fā)現(xiàn)使用果糖孵育48 h的糖化bFGF的相對(duì)分子量呈現(xiàn)為16 992 Da（圖1）。

圖1 bFGF和糖化bFGF的質(zhì)譜分析圖譜Fig 1 Mass spectrometry of bFGF and glycated bFGF

2.2 糖化bFGF樣品的成分分析

通過(guò)MALDI-TOF-MS發(fā)現(xiàn)使用果糖孵育48 h的糖化bFGF能找到糖基化峰值，使用此種糖化bFGF實(shí)施高效液相色譜法，可看出在6～22 min的梯度區(qū)間內(nèi)，發(fā)現(xiàn)多個(gè)bFGF差異色譜峰 （同水相比）；在7～22 min的梯度區(qū)間內(nèi)，制備的糖化bFGF樣品與bFGF相比，有著極為相似的差異色譜分；制備的糖化bFGF樣品同H2O和bFGF相比，糖化bFGF在6～7 min之間出現(xiàn)差異色譜峰，且隨樣品濃度的增加，該色譜峰呈現(xiàn)增高的趨勢(shì)（圖2）。

圖2 H2O、bFGF、糖化bFGF在高效液相色譜法中的差異色譜峰Fig.2 Chromatographic peaks of H2O,bFGF and glycated bFGF in HPLC

2.3 bFGF和糖化bFGF干預(yù)細(xì)胞的濃度選擇

繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線發(fā)現(xiàn)5×103個(gè)/孔為最佳濃度。bFGF和糖化bFGF干預(yù)24 h后，bFGF總體上似乎表現(xiàn)出更好的促增殖效果，在濃度為20 ng/mL時(shí)，測(cè)得兩組間的OD值差異最為明顯，故以20 ng/mL作為本實(shí)驗(yàn)的干預(yù)濃度（圖3）。

圖3 不同濃度的bFGF和糖化bFGF干預(yù)對(duì)HUVEC增殖的影響Fig.3 The effect of different concentrations of bFGF and glycated bFGF on the proliferation of HUVEC

2.4 bFGF與糖化bFGF對(duì)HUVEC增殖的影響

干預(yù)后第1天，對(duì)照組較空白組的細(xì)胞增殖顯著增高（P＜0.01）；實(shí)驗(yàn)組較空白組的細(xì)胞增殖顯著增高（P＜0.05）；對(duì)照組較實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞增殖顯著增高（P＜0.01）（圖 4）。

干預(yù)后第3天，對(duì)照組較空白組的細(xì)胞增殖顯著增高（P＜0.001）；實(shí)驗(yàn)組與空白組的細(xì)胞增殖無(wú)顯著差異（P＞0.05）；對(duì)照組較實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞增殖顯著增高（P＜0.001）（圖 4）。

干預(yù)后第7天，對(duì)照組較空白組的細(xì)胞增殖顯著增高（P＜0.05）；實(shí)驗(yàn)組與空白組的細(xì)胞增殖無(wú)顯著差異（P＞0.05）；對(duì)照組較實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞增殖顯著增高（P＜0.001）（圖 4）。

圖4 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HUVEC增殖效應(yīng)Fig.4 CCK-8 assay for proliferation effect of HUVEC

2.5 bFGF與糖化bFGF對(duì)HUVEC血管形成的影響

Matrigel Basement Membrane Matrix培養(yǎng)條件下，與空白組相比，對(duì)照組干預(yù)6 h后，可明顯觀察到HUVEC的管樣結(jié)構(gòu)形成增多，其血管形成的節(jié)點(diǎn)數(shù)量、交叉點(diǎn)數(shù)量、網(wǎng)眼數(shù)量、主干分段數(shù)量都具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）；與空白組相比，實(shí)驗(yàn)組的管樣結(jié)構(gòu)較為稀疏和不完整，血管形成的節(jié)點(diǎn)數(shù)量、交叉點(diǎn)數(shù)量、主干分段數(shù)量均顯著減少（P＜0.05），網(wǎng)眼數(shù)量與空白組相比無(wú)顯著差異（圖5）。

圖5 Matrigel凝膠實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HUVEC血管形成效應(yīng)Fig.5 Matrigel gel assay for HUVEC angiogenesis

2.6 bFGF與糖化bFGF對(duì)HUVEC凋亡的影響

干預(yù)后第1、3天，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的細(xì)胞凋亡無(wú)顯著差異（P＞0.05）；干預(yù)后第7天，實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組的細(xì)胞凋亡顯著增高（P＜0.01）（圖 6）。

圖6 流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)HUVEC凋亡效應(yīng)Fig.6 Flow cytometry assay for HUVEC apoptosis

3 討論

我們選擇0.25 M 果糖、G-6-P與10 μg/mL的bFGF在37℃條件下分別孵育48 h和7 d，以制備糖化bFGF。質(zhì)譜顯示果糖孵育48 h后，bFGF被糖化。高效液相色譜法證實(shí)糖化bFGF制備成功。

體外制備糖化蛋白已有很多報(bào)道，多種條件均可成功制備糖化蛋白。這些研究涉及不同濃度的孵育原料，孵育時(shí)間從 1 h 至 30 d 不等[5，7-8，11]。其中，生長(zhǎng)因子糖化的孵育最長(zhǎng)為168 h[7]。相關(guān)研究表明，果糖能夠更好地與蛋白發(fā)生糖化反應(yīng)[5，7]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，果糖與bFGF孵育48 h，質(zhì)譜顯示的峰值最為明顯。高效液相色譜法檢測(cè)結(jié)果也給予了證實(shí)。

細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，我們對(duì)干預(yù)條件進(jìn)行了篩選。結(jié)果顯示，在2 ng/mL到80 ng/mL的濃度區(qū)間內(nèi)，經(jīng)過(guò)24 h培養(yǎng)，bFGF和糖化bFGF均表現(xiàn)出對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的促增殖效應(yīng)，兩組在20 ng/mL濃度下OD值的差異最為明顯，故我們以此作為最終干預(yù)條件。在20 ng/mL濃度bFGF和糖化bFGF條件下進(jìn)行1 d的細(xì)胞培養(yǎng)，細(xì)胞數(shù)量均可增加，但bFGF干預(yù)后的細(xì)胞數(shù)量增加更為顯著[7-8]，符合本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。

以該干預(yù)濃度，我們觀察了1 d、3 d、7 d的細(xì)胞增殖、凋亡。結(jié)果顯示，與空白組相比，bFGF組表現(xiàn)出更好的促增殖效應(yīng)，糖化bFGF組僅在第1天表現(xiàn)出促增殖效應(yīng)，其余時(shí)相點(diǎn)未見(jiàn)明顯差異。在凋亡檢測(cè)中，糖化bFGF組在干預(yù)后第7天的細(xì)胞凋亡較bFGF組更為明顯。從總體上看，糖化bFGF在本實(shí)驗(yàn)條件下無(wú)促增殖效應(yīng)，但也未表現(xiàn)出抑制細(xì)胞增殖的效應(yīng)，且在一定干預(yù)時(shí)間后誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

對(duì)于上述結(jié)果，我們認(rèn)為bFGF的促增殖效應(yīng)是肯定的。但糖化bFGF并未表現(xiàn)出對(duì)細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)控作用，可能是本研究制備的糖化bFGF為包含糖化與非糖化bFGF的混合物，因此當(dāng)用于干預(yù)細(xì)胞時(shí)，對(duì)于細(xì)胞增殖的影響可能是一種綜合效應(yīng)，既包含了未糖化bFGF的促增殖效應(yīng)，也包含了糖化bFGF的增殖抑制效應(yīng)，最終表現(xiàn)為與正常培養(yǎng)條件相似的細(xì)胞增殖效應(yīng)。但因糖化bFGF的存在，隨干預(yù)時(shí)間延長(zhǎng)，仍會(huì)表現(xiàn)出誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的效應(yīng)。

本實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞成管效應(yīng)的結(jié)果與細(xì)胞增殖有所不同。bFGF干預(yù)細(xì)胞后能促進(jìn)血管形成；糖化bFGF干預(yù)后，細(xì)胞的成管明顯抑制。事實(shí)上，血管內(nèi)皮細(xì)胞在Matrigel培養(yǎng)條件下形成管樣結(jié)構(gòu)，不僅與細(xì)胞增殖有關(guān)，還涉及細(xì)胞遷移等其他細(xì)胞行為。這些行為與細(xì)胞骨架、細(xì)胞外基質(zhì)骨架等多種復(fù)雜因素有關(guān)。文獻(xiàn)顯示，糖化蛋白與這些分子事件顯著相關(guān)[12-13]。本實(shí)驗(yàn)所制備的糖化bFGF，不能促進(jìn)細(xì)胞增殖，但理論上可負(fù)向介導(dǎo)與細(xì)胞遷移相關(guān)的分子事件，從而表現(xiàn)為抑制血管形成。

綜上所述，我們用果糖與bFGF在37℃溫箱中孵育48 h，成功制備出糖化bFGF。bFGF可明顯促進(jìn)細(xì)胞增殖，對(duì)血管形成效應(yīng)也有促進(jìn)作用；糖化bFGF未顯示出對(duì)細(xì)胞增殖的明顯作用，但對(duì)血管形成有抑制作用。本實(shí)驗(yàn)為后期開(kāi)展生長(zhǎng)因子糖化后受體相關(guān)事件提供了基礎(chǔ)，也對(duì)糖尿病創(chuàng)面的難愈機(jī)制研究提出了新的思路。