利塞膦酸鈉對神經(jīng)病理性疼痛大鼠模型的抗炎鎮(zhèn)痛作用*

卜慧蓮 連一聞 許繼田 馬民玉△

（1鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院疼痛科，鄭州450052；2鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理教研室，鄭州450052）

神經(jīng)病理性疼痛[1](neuropathic pain, NP) 是中樞和/或外周感覺神經(jīng)系統(tǒng)損傷所引起的慢性疼痛綜合征，其典型的癥狀包括自發(fā)性疼痛、痛覺過敏和痛覺超敏，該疾病在全球其患病率可高達(dá)21.6%，進(jìn)而越來越被臨床醫(yī)生及基礎(chǔ)研究學(xué)者重視。在神經(jīng)損傷后，小膠質(zhì)細(xì)胞釋放大量促炎癥細(xì)胞因子如TNF-α、IL-1β以及IL-6等[2]，由此引起的神經(jīng)炎癥反應(yīng)是造成NP的重要原因。關(guān)于NP的臨床藥物治療主要包括局部麻醉藥、非甾體類抗炎鎮(zhèn)痛藥、抗癲癇藥及阿片類鎮(zhèn)痛藥物，非甾體類藥物大多具有消化系統(tǒng)副作用，阿片類鎮(zhèn)痛藥主要作用于外周或脊髓背角的阿片類受體，但長期服用后會產(chǎn)生藥物鎮(zhèn)痛耐受，同時引起便秘、疲乏、過度鎮(zhèn)靜等副作用[3]?？贵@厥藥目前廣泛用于神經(jīng)病理性疼痛的治療，但其對認(rèn)知功能的損害一直是不可忽視的重點(diǎn)[4]。因此尋找新的藥物治療思路顯得尤為重要。

利塞膦酸鈉 (risedronate, RIS) 是第三代含氮雙膦酸鹽，主要用于骨質(zhì)疏松癥、骨癌痛及佩吉特病等[5]，最新的《神經(jīng)病理性疼痛診療指南專輯》中提出，雙膦酸鹽類藥物可用于治療神經(jīng)病理性疼痛，為B級推薦用藥，但關(guān)于RIS是否對NP產(chǎn)生抗炎鎮(zhèn)痛作用未見有報道。研究表明RIS具有抗炎作用，其在炎性痛動物模型中抑制破骨細(xì)胞產(chǎn)生促炎癥細(xì)胞因子，進(jìn)而發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用[6]；而破骨細(xì)胞與神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞同屬于單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)[7]，同時Rahn等[8]發(fā)現(xiàn)雙膦酸鹽的一種阿倫膦酸鈉減弱了腫瘤誘導(dǎo)的外周和中樞致敏標(biāo)志物，如星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP，因此推測RIS可能會抑制小膠質(zhì)細(xì)胞分泌促炎癥細(xì)胞因子來產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用，因此本研究旨在探討RIS對大鼠NP的鎮(zhèn)痛作用及其對脊髓 (spinal cord, SP) 和背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion, DRG) 中炎癥因子表達(dá)的影響。

方 法

1.實(shí)驗動物

本實(shí)驗選取230～250 g成年雄性SD大鼠（河南省鄭州市實(shí)驗動物中心），采取分籠飼養(yǎng)，自由攝食飲水，室溫24±2℃，濕度60%～70%，8:00～20:00光照，動物適應(yīng)環(huán)境3 d后開始實(shí)驗。進(jìn)行疼痛行為學(xué)檢測的大鼠用隨機(jī)數(shù)字表法分為6組 (n= 8)：假手術(shù) (Sham + saline) 組、手術(shù) (SNL +saline) 組、RIS低劑量治療 [R (L)]、RIS中劑量治療組[R (M)]、RIS高劑量治療組 [R (H)]及空白對照組 (Control + RIS)；其中RIS劑量分別為0.1、0.5、1 mg/kg，0.1 ml/只，采用皮下注射，假手術(shù) (Sham)組、空白對照(C)組及手術(shù) (SNL) 組注射等體積無菌生理鹽水。根據(jù)上步實(shí)驗結(jié)果，在Elisa檢測中將大鼠隨機(jī)分為4組 (n= 6)：手術(shù)組 (SNL + saline)，RIS中劑量治療組 [R (M)]假手術(shù)組 (Sham + saline) 及空白對照組 (Control + RIS)，分別皮下注射0.5 mg/kg RIS或等體積的生理鹽水。所有動物實(shí)驗操作均符合鄭州大學(xué)動物保護(hù)協(xié)會和使用委員會的要求，并且與國家動物保護(hù)研究所的指南一致。

2.藥物

利塞膦酸鈉（揚(yáng)子江藥業(yè)批號：16122501），以無菌生理鹽水配置成相應(yīng)濃度溶液供皮下注射應(yīng)用。注射時間為術(shù)前30 min至術(shù)后7 d，持續(xù)注射，每只0.1 ml，每天1次。

3.NP模型制備

本實(shí)驗依照La Bu Da等[9]的方法采取大鼠左側(cè)第5腰椎脊神經(jīng)結(jié)扎模型(spinal nerve ligation,SNL)，利用異氟醚對大鼠進(jìn)行吸入麻醉，術(shù)區(qū)備皮，常規(guī)消毒皮膚，鋪無菌巾，平髂嵴，雙側(cè)髂后上棘連線中點(diǎn)向左旁開0.5 cm做縱行切口，切開皮膚及皮下筋膜，鈍性分離顯露脊椎，切除L5橫突后暴露其下方的L5脊神經(jīng)，用5-0絲線結(jié)扎神經(jīng)并剪斷，用3-0絲線逐層縫合口，大鼠蘇醒后禁食1 d，自由飲水，術(shù)畢送回動物飼養(yǎng)室，假手術(shù)(Sham)組僅暴露L5脊神經(jīng)，不進(jìn)行結(jié)扎剪斷處理。

4.機(jī)械性撤足閾值(mechanical withdraw threshold,MWT)的測定

按Tal等[10]的“up-down”方法，選用8根呈對數(shù)遞增的Von Frey Hair纖毛 (3.61、3.84、4.08、4.31、4.56、4.74、4.93、5.18) ，根據(jù)注藥方式不同，分別于手術(shù)前1 d和術(shù)后1、3、5、7、10、14 d檢測大鼠50%機(jī)械性撤足閾值。將大鼠置于金屬網(wǎng)架上，適應(yīng)環(huán)境20～30 min后，首先從4.31開始，通過網(wǎng)眼將纖毛垂直刺向其雙側(cè)后肢足底中心處，稍用力直至彎曲成S形，刺激持續(xù)時間約為3～4 s，大鼠出現(xiàn)抬足或舔足行為視為陽性反應(yīng)，若無反應(yīng)則視為陰性反應(yīng)。若縮足反應(yīng)為陰性，則選擇相鄰遞增Von Frey Hair刺激，若縮足反應(yīng)為陽性，則選擇相鄰遞減Von Frey Hair刺激，首次陽性反應(yīng)后，應(yīng)用Up-down法連續(xù)測量4次，每次間隔30 s，5次刺激中出現(xiàn)3次及3次以上陽性反應(yīng)即認(rèn)為發(fā)生機(jī)械痛覺超敏。

5.熱縮足潛伏期(thermal withdrawal latency,TWL)的測定

參照Hargreaves等[11]報道的方法，根據(jù)注藥方式不同，分別于手術(shù)前1 d和術(shù)后1、3、5、7、10、14 d測定大鼠TWL。調(diào)整輻射熱強(qiáng)度，使大鼠的基礎(chǔ)值維持在12～15 s，來設(shè)定熱測痛儀的參數(shù)。熱輻射照射時限設(shè)定為19.1 s。將大鼠置于玻璃板上，并罩以透明有機(jī)玻璃觀察框，大鼠適應(yīng)環(huán)境30 min后，調(diào)整輻射光源使其對其大鼠后足足底中心處，光源開始照射足底部，當(dāng)大鼠出現(xiàn)縮足反射或照射時間達(dá)到19.1 s，光源自動關(guān)閉，并自動記錄持續(xù)時間，即為熱痛閾值。正常對照大鼠的熱縮足潛伏期通常為12～15 s。每側(cè)足測量3次，每次間隔10～15 min，取其均值，作為該側(cè)足的熱縮足潛伏期。

6.酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)

測定脊髓 (SP) 及背根神經(jīng)節(jié) (dorsal root ganglion, DRG) 促炎癥細(xì)胞因子腫瘤壞死因子 -α (TNF-α)、白介素1β (IL-1β)以及白介素-6 (IL-6)表達(dá)測定。在連續(xù)注射RIS (0.5 mg/kg) 7 d后將大鼠斷頭處死，迅速截取L4-6脊髓腰膨大節(jié)段及雙側(cè)L4、L5背根神經(jīng)節(jié)(DRG)。將組織用微量勻漿器制成勻漿液，采用BCA法測定蛋白濃度后，將蛋白量濃度統(tǒng)一稀釋為1 μg/μl。按照ELISA試劑盒說明書測定促炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β以及IL-6的含量。將所需包被板條取出，像酶標(biāo)孔中加入洗滌液300 μl/孔，靜置30 s，洗板5次，每次甩掉洗滌液后均需在吸水紙上拍干，盡快使用，避免包被板干燥。參照說明書稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，再將稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品、樣本稀釋液和樣本加到相應(yīng)孔中，100 μl/孔,用封板紙封住板條，置于室溫下 (20～25℃)孵育2 h。洗板5次。按當(dāng)次實(shí)驗所需用量提前20 min配置生物素化抗體工作液，用抗體稀釋液將濃縮生物素化抗體稀釋到所需的濃度，100 μl/孔, 置于室溫下 (20～25℃) 用ELISA專用的微量振蕩器震蕩(100 rpm/min)孵育1 h。洗板5次。

采用Graphpad Prism 5.0軟件和SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(±SEM)表示，對于大鼠疼痛行為學(xué)測試數(shù)據(jù)分析，比較采用雙因素方差分析，相同時間點(diǎn)兩組之間比較應(yīng)用t檢驗；對于ELISA數(shù)據(jù)分析，差異性比較采用單因素方差分析，以P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。按當(dāng)次實(shí)驗所需用量提前20 min配制酶結(jié)合物工作液，用酶結(jié)合物稀釋液將濃縮鏈親和素標(biāo)記的辣根過氧化物酶稀釋劑稀釋到所需的濃度，100 μl/孔，置于室溫下 (20～25℃) 用ELISA專用的微量振蕩器震蕩(100 rpm)孵育30 min。洗板5次。加顯色劑 (TMB)，100 μl/孔，室溫下反應(yīng)，避光顯色10～20 min，顏色為藍(lán)色。加終止液，100 μl/孔，輕輕混勻，顏色呈黃色，在5 min內(nèi)用酶標(biāo)儀進(jìn)行雙波長檢測（450 nm為主波長，570 nm或630 nm為參考波長）。

7.統(tǒng)計學(xué)方法

結(jié) 果

1.利塞膦酸鈉對SNL大鼠機(jī)械縮足反應(yīng)閾值(MWT)的影響

各組術(shù)前1 d時MWT比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義；與術(shù)前1 d相比，Sham + saline組、C組雙側(cè)、及SNL + saline組、R (M) 組對側(cè)各時間點(diǎn)MWT比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。通過術(shù)前30 min至術(shù)后7 d皮下注射不同劑量RIS后，與Sham + saline組術(shù)側(cè)相比，SNL + saline組、R (L) 組、R (M) 組及R (H)組術(shù)側(cè)術(shù)后各時點(diǎn)MWT降低 (P＜ 0.05)，C組與Sham + saline組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義；與SNL組術(shù)側(cè)比較，在術(shù)后3、5、7、10、14 d，R (M) 組術(shù)側(cè) MWT 上升 (P＜ 0.05)，在術(shù)后 5、7、10、14 d R (H) 組術(shù)側(cè) MWT 上升 (P＜ 0.05)，R (L) 組術(shù)側(cè)各時間點(diǎn)MWT比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義；與R (M)組術(shù)側(cè)比較，在術(shù)后5、7、10、14 d時R (L)組及R (H) 組術(shù)側(cè)MWT較低 (P＜ 0.05)。結(jié)果證明，RIS可減輕神經(jīng)損傷后大鼠機(jī)械性痛覺超敏，并在劑量為0.5 mg/kg時鎮(zhèn)痛效果更佳，而對大鼠正常痛閾無明顯作用（見圖1A，B）。

2.利塞膦酸鈉對脊神經(jīng)結(jié)扎大鼠熱縮足潛伏期(TWL)的影響

各組術(shù)前1 d時TWL比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義；與術(shù)前1 d相比，Sham + saline組、C組兩側(cè)及SNL + saline組、R (M) 組對側(cè)各時間點(diǎn)比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＜ 0.05)。與Sham + saline組術(shù)側(cè)相比，SNL + saline組、R (L)組及R (H) 組術(shù)側(cè)術(shù)后5、7、10、14 d TWL均降低 (P＜ 0.05)， R (M)組、C組與Sham + saline組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義；與SNL + saline組術(shù)側(cè)比較，在術(shù)后5、7、10、14 d，R (L) 組、R (M) 組及 R (H) 組術(shù)側(cè)TWL升高(P＜0.05)；與R (M)組比較，在術(shù)后5、7、10、14 d時R (L)組及 R (H) 組術(shù)側(cè)TWL較低 (P＜ 0.05)。結(jié)果證明，RIS可減輕神經(jīng)損傷后大鼠熱痛覺過敏，并在劑量為0.5 mg/kg時鎮(zhèn)痛效果更佳，而對大鼠正常痛閾無明顯作用（見圖2A，B）。

圖1 術(shù)前30 min至術(shù)后7 d皮下注射RIS后各組大鼠不同時間點(diǎn)MWT的比較 (±SEM)(A)術(shù)側(cè)；(B)對側(cè) *P ＜ 0.05，與Sham + saline組比較；#P ＜ 0.05，與SNL + saline組比較；△P ＜ 0.05，與R (M)組比較Fig.1 The change of MWT of rats at different time points after RIS injection (±SEM)(A) ipsilateral; (B) contralateral *P ＜ 0.05, compared with sham + saline rats; #P ＜ 0.05, compared with SNL + saline rats; △P ＜ 0.05, compared with group R (M).

3.利塞膦酸鈉對SNL大鼠背根神經(jīng)節(jié)(DRG)中表達(dá)的影響

根據(jù)疼痛行為學(xué)數(shù)據(jù)分析結(jié)果，采取中劑量組0.5 mg/kg利塞膦酸鈉進(jìn)行皮下注射，持續(xù)7 d，在術(shù)后7 d時，與Sham + saline組比較，SNL + saline組促炎癥細(xì)胞因子IL-1β、IL-6 以及TNF-α表達(dá)水平升高(P＜ 0.05)；而與SNL + saline組相比，R (M)組中表達(dá)水平降低(P＜ 0.05)。結(jié)果證明，結(jié)果證明，RIS可下調(diào)神經(jīng)損傷后大鼠脊髓(SP)及背根神經(jīng)節(jié)(DRG)內(nèi)促炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)水平，進(jìn)而對NP產(chǎn)生抗炎鎮(zhèn)痛作用 （見圖3A-C，4A-C）。

圖2 術(shù)前30 min至術(shù)后7 d皮下注射RIS后各組大鼠不同時間點(diǎn)TWL的比較 (±SEM)(A)術(shù)側(cè)；(B) 對側(cè) *P ＜ 0.05，對側(cè)與 Sham + saline 組比較；#P ＜ 0.05，與 SNL + saline 組比較；△P ＜ 0.05，與R (M)組比較Fig.2 The change of TWL of rats at different time points after RIS injection (±SEM)(A) ipsilateral; (B) contralateral *P ＜ 0.05, compared with sham + saline rats; #P ＜ 0.05, compared with SNL + saline rats;△P ＜ 0.05, compared with group R (M).

圖3 術(shù)前30 min至術(shù)后7 d皮下注射RIS后各組大鼠術(shù)側(cè)SP促炎癥細(xì)胞因子IL-1β、IL-6 以及TNF-α的表達(dá)變化 (±SEM)(A) IL-1β；(B) IL-6；(C) TNF-α *P ＜ 0.05，與 Sham + saline組比較；#P ＜ 0.05，與 SNL + saline組比較Fig.3 The change of pro-in fl ammatory cytokines levels in the spinal cord after RIS injection (±SEM)(A) IL-1β; (B) IL-6; (C) TNF-α *P ＜ 0.05, compared with sham + saline rats; #P ＜ 0.05, compared with SNL + saline rats.

圖4 術(shù)前30 min至術(shù)后7 d皮下注射RIS后各組大鼠DRG促炎癥細(xì)胞因子IL-1β、IL-6 以及TNF-α的表達(dá)變化 (±SEM)(A) IL-1β；(B) IL-6；(C) TNF-α *P ＜ 0.05，與 Sham + saline組比較；#P ＜ 0.05，與 SNL + saline組比較Fig.4 The change of pro-in fl ammatory cytokines levels in the DRG after RIS injection (±SEM)(A) IL-1β; (B) IL-6; (C) TNF-α *P ＜ 0.05, compared with sham + saline rats; #P ＜ 0.05, compared with SNL + saline rats.

討 論

神經(jīng)病理性疼痛的病理生理機(jī)制非常復(fù)雜，目前認(rèn)為神經(jīng)炎癥反應(yīng)在其中起著重要的作用[12]。在神經(jīng)損傷后，病理改變不僅僅局限于神經(jīng)元系統(tǒng)活性的變化，還會引起免疫系統(tǒng)的反應(yīng)，其中一些免疫細(xì)胞可分泌促炎癥細(xì)胞因子和趨化因子來參與疼痛維持[13,14]。一旦免疫系統(tǒng)激活，組織可釋放大量的炎性介質(zhì)，包括一氧化氮(NO)，TNF-α，IL-1β，IL-6，興奮性氨基酸、ATP等[15]，這些炎性介質(zhì)可降低激活閾值或者直接激發(fā)神經(jīng)元。另外，由于鞘內(nèi)給予IL-1β和TNF受體拮抗劑以及IL-6中和抗體會減弱神經(jīng)病變模型中的疼痛行為[16]，因此已證明這些促炎癥細(xì)胞因子介導(dǎo)疼痛超敏反應(yīng)。

第三代雙膦酸鹽[5]是骨吸收的抑制劑，利塞膦酸鈉可通過調(diào)節(jié)破骨及成骨細(xì)胞的活性、促炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)、金屬蛋白酶-1 (MMP-1)的表達(dá)以及CGRP信號通路的活化等有效緩解骨質(zhì)疏松癥、炎性痛、骨癌痛；但目前利塞膦酸鈉對于神經(jīng)病理性疼痛的具體鎮(zhèn)痛機(jī)制尚不清楚。雙膦酸鹽類藥物可通過中樞及外周抑制急性痛，且鎮(zhèn)痛機(jī)制與骨破壞無關(guān)[17]；Bianchi和Nakai等[18,19]表明雙膦酸鹽類藥物能夠減少大鼠炎性痛模型中傷害感受增加時的炎癥性水腫和痛覺過敏。小鼠足底預(yù)先注射利塞膦酸鈉，可減少福爾馬林引起的組織內(nèi)促炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)（例如 TNF-α，IL-1β，IL-6）。Caraglia等[20]報道第三代雙膦酸鹽可抑制外周神經(jīng)結(jié)扎所引起的神經(jīng)病理性疼痛。這些研究表明利塞膦酸鈉可能通過調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)的表達(dá)，從而對神經(jīng)病理性疼痛產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用。

本實(shí)驗采用的脊神經(jīng)結(jié)扎模型 (SNL) 已廣泛用于研究神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)病機(jī)制及治療方法，本研究結(jié)果表明術(shù)后大鼠出現(xiàn)了明顯的機(jī)械性痛覺超敏和熱痛覺過敏,提示大鼠模型制備成功；同時表明，SNL大鼠持續(xù)注射RIS可減輕其因神經(jīng)損傷所引起的痛覺過敏和痛覺超敏，并在第7天停藥后，鎮(zhèn)痛作用持續(xù)存在。并且R (M) 組及空白對照 (C) 組對側(cè)的行為學(xué)無明顯差異，表明不干擾正常的痛覺。本研究結(jié)果顯示，SNL大鼠術(shù)后脊髓 (SP) 及背根神經(jīng)節(jié) (DRG) 中的促炎癥細(xì)胞因子IL-1β、IL-6 以及TNF-α表達(dá)明顯升高，在持續(xù)7天皮下注射RIS后，相應(yīng)炎癥因子明顯下降，表明RIS可抑制神經(jīng)病理性疼痛所引起的炎癥因子的表達(dá)，進(jìn)而產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用。然而，利塞膦酸鈉有劑量依賴性的細(xì)胞毒性[21]，本研究結(jié)果顯示，0.5 mg/kg而非1 mg/kg的利塞膦酸鈉可以產(chǎn)生最佳的鎮(zhèn)痛作用，可能是因為1 mg/kg的劑量反而有毒性作用，但這需要進(jìn)一步的研究去證實(shí)。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，利塞膦酸鈉可通過下調(diào)促炎癥細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表達(dá)，可以抑制過度的炎癥反應(yīng)，減輕神經(jīng)的炎癥損傷，對SNL大鼠產(chǎn)生抗炎鎮(zhèn)痛作用，本文未對RIS抑制炎癥因子的具體機(jī)制進(jìn)行探討，推測RIS抗神經(jīng)病理性疼痛的作用可能與其抑制膠質(zhì)細(xì)胞的活化進(jìn)而下調(diào)促炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)有關(guān)，該研究為RIS應(yīng)用于抗神經(jīng)病理性疼痛提供了實(shí)驗依據(jù)，其具體的作用機(jī)制還需要進(jìn)一步探討。