高效液相色譜法測定菠菜中維生素C的含量

湯冬梅 王雄輝 劉 敏 董文惠 林 磊

（嘉興威凱檢測技術(shù)有限公司 嘉興 314050）

引言

維生素C又稱抗壞血酸[1]，具有解毒[2]、抗癌癥[3]、清除自由基等功能，是人體必需的營養(yǎng)素之一，廣泛存在于新鮮蔬菜和水果中。研究表明，維生素C能阻斷致癌物亞硝酸銨的形成[4]。在胃酸作用下，亞硝酸物首先與維生素C反應(yīng)，導(dǎo)致沒有足夠的亞硝酸物與胺結(jié)合成亞硝酸銨。近年來胃癌在死亡病因中成逐漸下降趨勢，研究人員意識到主要?dú)w功于食物有了冰箱冷藏，加以運(yùn)輸發(fā)達(dá)，人們能夠吃到更新鮮的水果蔬菜，而吃鹽腌或浸的食物相對減少的緣故。因此，如何提高水果蔬菜的保鮮效果，盡量減少維生素C的損失尤為重要。

本研究選用菠菜為電冰箱冷藏室果蔬盒中代表食物，采用高效液相色譜（HPLC）法測定其維生素C含量，通過比較菠菜存儲不同周期維生素C的損失率，進(jìn)而評估電冰箱的保鮮性能。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

用75 %的酒精擦拭電冰箱所有儲藏間室內(nèi)表面及冰箱所有儲藏間室內(nèi)各附件的表面并晾干，將電冰箱的溫度控制裝置設(shè)定在制造廠聲明的的位置（冷藏室4 ℃，冷凍室-20 ℃，寬幅變溫室-3 ℃，左右變溫室0 ℃），預(yù)運(yùn)行24 h。選擇顏色為深綠色、無損傷、成熟度一致、帶根的整棵菠菜作為樣品。將（未經(jīng)處理的）新鮮菠菜去掉泥土、黃葉和雜質(zhì)，均勻化后150 g作為一個(gè)樣本，根莖部用紙膠帶纏繞固定成一束。待電冰箱穩(wěn)定運(yùn)行2 h后，置于電冰箱冷藏室果蔬盒中貯藏。

1.2 儀器與試劑

儀器：Agilent 1260型 高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司），AB135-S型電子天平（梅特勒-托利多），KQ-500E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），H1650-W型離心分離機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司），各類玻璃器皿（均用二次蒸餾水沖洗后，再用丙酮清洗并于120 ℃烘干4 h后備用）。

試劑：偏磷酸（分析純），磷酸二氫鉀（分析純），磷酸（分析純），十六烷基三甲基溴化銨（色譜純），甲醇（色譜純），維生素C標(biāo)準(zhǔn)品（純度99.8 %，Supelco）。

1.3 方法

1.3.1 試樣制備

將150 g菠菜放入破壁機(jī)中全部粉碎，稱取2 g（精確至0.001 g）混合均勻的試樣于50 mL燒杯中，用20 g/L偏磷酸溶液超聲5 min溶解后，轉(zhuǎn)至50 mL容量瓶中用20 g/L偏磷酸溶液定容搖均。取部分液體以12 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，取上清液經(jīng)0.45 μm水相濾膜過濾，濾液待上機(jī)測試。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：ZORBAX Eclipse PlusC18色譜柱（4.6×150 mm，3.5 μm）；檢測器：二極管陣列檢測器；流動(dòng)相：采用等度洗脫，流動(dòng)相A：6.8 g磷酸二氫鉀和0.91 g十六烷基三甲基溴化銨，用水溶解定容至1 L（用磷酸調(diào)pH至2.5～2.8），流動(dòng)相B：100 % 甲醇。按A:B=為98:2混合，過0.45 μm濾膜，超聲脫氣；流速：0.7 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL；檢測波長：245 nm。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取維生素C標(biāo)準(zhǔn)品0.01 g（精確至0.01 mg），用20 g/L偏磷酸溶液定容至100 mL，配制成濃度為0.1 mg/mL維生素C儲備液。

2 結(jié)果與分析

2.1 系統(tǒng)適用性及專屬性

系統(tǒng)適用性試驗(yàn)結(jié)果顯示，維生素C的分離度大于1.5，其理論塔板數(shù)高于10 000，均符合要求；專屬性試驗(yàn)結(jié)果顯示，樣品與維生素C標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間基本一致，如圖1所示。

圖1 維生素C液相色譜圖

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性趨勢

吸取維生素C儲備液0 mL，0.05 mL，0.1 mL，0.2 mL，0.5 mL，1.0 mL到10 mL棕色容量瓶中，用20 g/L偏磷酸溶液定容混勻，配制成濃度分別為0 μg/mL，0.5 μg/mL，1 μg/mL，2 μg/mL，5 μg/mL，10 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)系列，按上述色譜條件進(jìn)樣測試。以標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，對應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合回歸方程為y=131.027 7x-3.535 3，R2=0.999 8。結(jié)果表明維生素C在0～10 μg/mL范圍內(nèi)線性良好，見圖2。

2.3 精密度

取同一試樣，按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測得維生素C峰面積的RSD為0.71 %，表明儀器精密度高，見表1。

2.4 重復(fù)性

取同一批樣品，按1.3.1項(xiàng)試樣制備的方法制備6份樣液并按上述色譜條件進(jìn)行測定，測得維生素C含量的RSD為0.97 %，表明方法重復(fù)性良好，見表2。

2.5 準(zhǔn)確度

取同一批樣品分成4份，每份約150 g，其中3份加入高、中、低三個(gè)濃度點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.3.1項(xiàng)處理后進(jìn)行測定，每個(gè)濃度重復(fù)3次，結(jié)果顯示高、中、低三個(gè)水平的加標(biāo)回收率在94.7 %～98.1 %范圍內(nèi)，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.34 %～1.61 %之間，表明該方法準(zhǔn)確度較理想，結(jié)果見表3。

2.6 穩(wěn)定性

將樣品溶液分別在室溫、避光條件下放置0、1、2、3、4、5和6 h后，分別測維生素C的峰面積，結(jié)果表明避光保存比室溫保存測得樣液維生素C的含量要高，樣液5 h后維生素C含量降低明顯，因此測試需在4 h內(nèi)完畢。

2.7 貯藏周期對菠菜中維生素C含量的影響

取5份150 g的菠菜置于電冰箱冷藏室果蔬盒相同位置分別貯藏3、7、10、12和14天后，按1.3.1方法進(jìn)行處理后根據(jù)1.3.2色譜條件上機(jī)測定，測試結(jié)果見表4。

由表4數(shù)據(jù)可看出，電冰箱冷藏室溫度在4 ℃狀態(tài)下，菠菜置于果蔬盒中貯藏14天其損失率僅為4.18 %，貯藏周期較久。分析原因，果蔬盒模擬利于蔬菜存儲的陰冷環(huán)境，隔絕蔬菜于水接觸，降低了腐爛程度，且低溫條件下有氧呼吸作用減弱，維生素C的分解減少，有利于維生素C含量的保持，而高溫將促進(jìn)維生素C的分解[6]。但是從數(shù)據(jù)上看菠菜貯藏7天以上維生素C的損失逐漸增高，為確保蔬菜新鮮，建議盡早食用。

圖2 維生素C標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

表1 精密度試驗(yàn)結(jié)果

表2 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

表3 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

表4 不同貯藏周期菠菜中維生素C的含量

3 結(jié)論

本文建立了一種快速測定菠菜中維生素C含量的方法，選用ZORBAX Eclipse Plus C18反相色譜柱重現(xiàn)性好，加標(biāo)回收率較理想，該方法簡便快速，數(shù)據(jù)可靠性高，適用廣泛，可用于食品中維生素C的測定。并根據(jù)維生素C損失率對電冰箱果蔬盒貯藏菠菜周期進(jìn)行考察，整個(gè)貯藏期維生素C含量總體呈下降趨勢，貯藏初期下降緩慢，后期降幅較大，但在整個(gè)儲藏期維生素C損失率相對來說較低，這主要得利于果蔬盒良好的貯藏環(huán)境。