糖尿病腎臟疾病中醫(yī)證候標志物研究的必要性和可行性分析

李平 趙海玲

摘要?糖尿病腎臟疾?。―KD）是尿毒癥的主要原發(fā)病，但現(xiàn)代醫(yī)學診治具有其局限性;“辨證論治”DKD具有一定的優(yōu)勢，然而，其病情評估和療效判斷的客觀性和可重復性受到質(zhì)疑。表現(xiàn)于外的中醫(yī)證候與內(nèi)在疾病本質(zhì)有著必然的聯(lián)系，代謝組學整體性特點可以發(fā)現(xiàn)DKD中醫(yī)證候?qū)拇x標志物。因此，基于代謝組學技術，開展DKD診斷代謝標志物研究具有十分重要的科學意義和臨床應用價值。本文通過探討DKD中醫(yī)證候的規(guī)范化和客觀化研究的瓶頸問題，論述基于高靈敏度、高分辨率UPLC-Q-Orbitrap質(zhì)譜分析，運用計算機“大數(shù)據(jù)+深度學習”方法，發(fā)現(xiàn)DKD中醫(yī)證候代謝標志物的必要性和可行性，為DKD的辨證分型提供可量化、可重復的客觀依據(jù)，提高DKD辨證論治的科學性。

關鍵詞?糖尿病腎臟疾病;中醫(yī)證候;代謝標志物;UPLC-Q-Orbitrap質(zhì)譜技術;深度學習方法

Abstract?Diabetic kidney disease （DKD） is the main cause of uremia，but western medical treatment of DKD has its limitations.“Syndrome Differentiation and Treatment” of Chinese medicine （CM） has certain advantages for DKD treatment.However，their objectivity and reproducibility of disease assessment and efficacy judgment were questioned.Traditional Chinese Medicine （TCM） syndromes are inevitably related to the intrinsic nature of the disease，the holistic characteristics of metabolomics are helpful to find the metabolic markers corresponding to TCM syndromes of DKD.Therefore，it is of great scientific significance and clinical application value to carry out the study of DKD diagnostic metabolic markers based on metabonomic techniques.In this study，we discussed the bottleneck problem of TCM syndrome normalized and objective study of DKD，and expounded the necessity and feasibility of TCM Syndrome markers of DKD based on high-sensitivity and high-resolution UPLC-Q-Orbitrap mass spectrometry analysis method and “big data and deep learning” technique.In order to provide a quantifiable and repeatable objective basis for DKD syndrome differentiation， and improve the scientific nature of DKD syndrome differentiation.

Keywords?Diabetic kidney disease; Traditional Chinese medicine syndrome; Metabolic markers ; UPLC-Q-Orbitrap Mass Spectrometry technique; Deep learning method

中圖分類號：R256.5;R255.4;R259文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.17.001

糖尿病腎臟疾病（Diabetic Kidney Disease，DKD）是糖尿病（Diabetic Mellitus，DM）主要微血管并發(fā)癥之一，在全球患病率高、危害嚴重[1]，是DM患者致死、致殘的主要原因。歐美國家大樣本DM隊列研究報道20%～40%的DM患者可發(fā)展為DKD[2]。我國已成為全球DM第一大國，其中2型糖尿病患者DKD患病率為10%～40%[2-3]。研究顯示，我國DKD的知曉率不足20%，治療率不足50%[4]。對2010—2015年我國三甲醫(yī)院住院人群進行的慢性腎臟病（Chronic Kidney Disease，CKD）病因調(diào)查中發(fā)現(xiàn)：自2011年起，DM相關腎臟疾病已成為導致CKD發(fā)生的首要原因[5]，但值得注意的是，DM相關腎臟疾病并非確診的DKD[6]。最新研究發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病行腎活檢患者中DKD患者僅占59.8%，其他包括非糖尿病腎臟疾?。∟on-diabetic Kidney Disease，NDKD）為34.5%，DKD合并NDKD患者為5.7%[7]。腎穿刺活檢是診斷DKD的金指標，但由于其是一項有創(chuàng)性的檢查，有一定風險及禁忌證，并十分受限于各地的醫(yī)療條件，故在臨床實踐中多以臨床特征診斷DKD。所以有些NDKD患者本可以通過激素或免疫抑制劑等藥物治療，但因為被誤診為DKD而局限于使用腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)阻滯劑，從而影響疾病的預后。因此，開展DKD無創(chuàng)診斷生物標志物研究是DKD臨床診療中亟待解決的關鍵科學問題之一。

1?開展DKD中醫(yī)證候的規(guī)范化和客觀化研究是當前中醫(yī)藥診治DKD有待突破的瓶頸問題

DKD研究過程中存在2個瓶頸問題：其一是早期隱匿起病，往往容易忽視;患者出現(xiàn)臨床顯性蛋白尿，疾病進展迅速，缺乏有效減少蛋白尿和改善腎功能的藥物，迅速進展至終末期腎病為普通CKD的十幾倍[4]。在國家973課題資助下，我們課題組開展中醫(yī)證候?qū)W研究發(fā)現(xiàn)：DKD中醫(yī)證候?qū)W特點是本虛標實，氣陰兩虛是DKD的核心病機，瘀血貫穿于疾病的始終[8-10]。臨床應用具有“益氣養(yǎng)陰、活血化瘀”作用的復方中藥—糖腎方，可以減少DKD臨床顯性蛋白尿，改善腎功能[11-12]。這一結果亦得到基礎研究的證實[13-15]。辨證論治是中醫(yī)治療的精華所在，證候是中醫(yī)辨證論治的核心和關鍵。而中醫(yī)對證候的認識大多是主觀的和直觀的，極大地限制了中醫(yī)學的發(fā)展和推廣。我們課題組前期利用代謝組學方法對DKD不同分期與DM患者血液標本分析研究發(fā)現(xiàn)：隨著DKD疾病進展，磷脂類代謝物呈下降趨勢;嘌呤/嘧啶核苷類代謝物呈上升趨勢。這與中醫(yī)辨證從陰虛證向氣虛證轉化，進而轉化為氣陰兩虛證的變化趨勢具有良好相關性這些結果提示：表現(xiàn)于外的中醫(yī)證候與內(nèi)在疾病的本質(zhì)有著必然的聯(lián)系。借助現(xiàn)代組學技術，深入開展DKD氣陰兩虛證代謝標志物挖掘，不僅有助于DKD無創(chuàng)診斷，亦為DKD中醫(yī)精準辨證論治提供客觀依據(jù)。

2?糖尿病腎臟疾病中醫(yī)證候標志物研究的必要性和可行性分析

鑒于DKD腎組織活檢的有創(chuàng)性，越來越多的學者致力于尋找無創(chuàng)的DKD診斷和疾病進展生物標志物。特別是高通量多種組學技術的興起將DKD診斷生物標志物研究推向了前所未有的高潮，其中高分辨代謝組學技術在DKD潛在生物標志物篩選中具有顯著優(yōu)勢，可能是實現(xiàn)DKD患者診斷與進展監(jiān)測的重要手段。

2.1?篩選特異性生物標志物是DKD無創(chuàng)診斷研究的關鍵問題?DKD生物標志物篩選是近年來研究者關注的熱點之一。目前DKD生物標志物主要包括3大類：傳統(tǒng)生物標志物、腎臟結構損傷和發(fā)病機制相關生物標志物、以及系統(tǒng)生物學方法發(fā)現(xiàn)的生物標志物。傳統(tǒng)DKD生物標志物包括尿微量白蛋白以及血清肌酐和胱抑素C等腎小球濾過率相關分子，至今仍廣泛應用于DKD臨床診斷。若腎小球濾過率（Glomemlar Filtration Rate，GFR）低于60 mL/（min·1.73 m2）和（或）尿白蛋白/肌酐比值（Urinary Albumin/Creatinine Ratio，UACR）高于30 mg/g，持續(xù)超過3個月，可臨床診斷為DKD。然而，有些DKD患者沒有UACR的改變，或DM患者合并的腎臟損害可能由其他NDKD引起[4]。

腎臟結構損傷和發(fā)病機制相關的DKD生物標志物研究發(fā)現(xiàn)：糖尿病引起的高血糖可使腎臟結構和細胞受損，腎小球濾過屏障功能缺陷，尿液中出現(xiàn)生理情況下不能透過屏障的白蛋白、轉鐵蛋白和免疫球蛋白等;足細胞損傷使DKD患者尿足細胞表面蛋白Nephrin、Podocalyxin等水平與蛋白尿正相關[16-17];腎小管上皮細胞受損脫落，DKD患者尿液中性粒細胞明膠酶相關脂質(zhì)運載蛋白（NGAL）[18]、腎損傷分子1（KIM-1）等標志蛋白含量增加[19]?；诎l(fā)病機制的DKD診斷生物標志物包括與腎臟炎性反應相關的血液TNF-α和尿液MCP-1等[20]，與氧化應激有關的尿液8-OHdG等[21]。但上述分子缺乏特異性，也可能與NDKD導致腎臟病理損傷有關，如IgA腎病和狼瘡性腎炎患者尿液中同樣存在高濃度的Nephrin等足細胞蛋白[22-23]。

近年來，基因組學、轉錄組學、蛋白質(zhì)組學、代謝組學等高通量系統(tǒng)生物學技術迅速發(fā)展，為DKD新的生物學標志物篩選提供了更好的技術平臺。蛋白質(zhì)組學發(fā)現(xiàn)DKD患者尿液中有60余種蛋白水平明顯改變;443種尿液蛋白肽段中約50%含有Ⅰ型膠原α1和Ⅲ型膠原α1片段，提示這2種蛋白肽段是DKD潛在分子診斷標志物[24-25]?；蚪M學發(fā)現(xiàn)DKD患者尿液外泌體中miRNA-145、miRNA-130a等22個miRNA表達水平差異有統(tǒng)計學意義[26]。

代謝組學作為基因組學和蛋白質(zhì)組學的延伸，能夠測繪生物樣本中代謝物的動態(tài)變化，成為篩選DKD這一代謝性疾病生物標志物的強有力工具。代謝組學通過檢測內(nèi)源性代謝產(chǎn)物在擾動下（如疾病發(fā)生或藥物作用后）的變化，對生物系統(tǒng)進行整體及其動態(tài)變化規(guī)律的研究，已被廣泛應用于疾病診斷、醫(yī)藥研制開發(fā)等領域[27]。糖尿病是以高血糖為特征的代謝性疾病，DKD早期雖無特異的臨床癥狀，已有研究表明在明顯器質(zhì)性病變之前，DKD患者體內(nèi)的某些相關代謝物已經(jīng)發(fā)生了變化[28]。已有學者利用DKD患者血液或尿液樣本開展代謝組學研究，發(fā)現(xiàn)了三羧酸循環(huán)代謝產(chǎn)物、氨基酸代謝、脂質(zhì)代謝、尿素循環(huán)和核苷酸代謝產(chǎn)物與DKD進展密切相關[29-31]。因此，基于代謝組學技術，開展DKD代謝標志物研究具有十分重要的科學意義和臨床應用價值。

2.2?UPLC-Q-Orbitrap質(zhì)譜技術和深度學習方法為DKD代謝標志物研究提供了新的平臺?隨著高分辨質(zhì)譜技術的發(fā)展，新型靜電場軌道阱（Orbitrap）質(zhì)譜具有高分辨率、高質(zhì)量精度、動態(tài)范圍寬、質(zhì)量范圍廣等優(yōu)勢，并克服了其他高分辨質(zhì)譜如傅里葉變換離子回旋共振（FTICR）質(zhì)譜和飛行時間（TOF）質(zhì)譜的尺寸大、維護與操作復雜等缺點，可以同時提供定性和定量分析;再者，四極桿-Orbitrap（Q-Orbitrap）在線性離子阱-Orbitrap（LTQ-Orbitrap）質(zhì)譜基礎上發(fā)展而來，具有更強的定量能力;加上儀器配置的數(shù)據(jù)庫能夠?qū)崿F(xiàn)未知化合物的鑒定，因此該技術可為代謝組學的研究提供了更加強大的技術支持[32-33]。近年來，UPLC-Q-Orbitrap質(zhì)譜技術已被應用于多項基礎研究[34-35]，利用高分辨、高精度的UPLC-Q-Orbitrap質(zhì)譜技術開展DKD代謝組學研究，是發(fā)掘DKD特異代謝標志物的重要研究方向。

“深度學習”方法是開啟大數(shù)據(jù)時代的鑰匙。龐大的臨床大數(shù)據(jù)改變了基于概率論和數(shù)理統(tǒng)計的傳統(tǒng)數(shù)據(jù)科學，促進了數(shù)據(jù)分析方法的創(chuàng)新，尤其是“深度學習”，被業(yè)界視為是開啟大數(shù)據(jù)時代的鑰匙。深度學習是一種“數(shù)據(jù)驅(qū)動”技術，旨在研究如何從數(shù)據(jù)中自動提取多層特征表示，建立、模擬人腦進行表示學習和解釋數(shù)據(jù)，它具有強大的數(shù)據(jù)自動特征提取、復雜模型構建以及圖像處理能力，非常適合處理醫(yī)療大數(shù)據(jù)分析所面臨的問題。以“大數(shù)據(jù)+深度學習”的技術融合為切入點，通過數(shù)據(jù)驅(qū)動的方式，建立、模擬人腦從數(shù)據(jù)中學習表示并逐層轉換為更高層更抽象的表示，轉變傳統(tǒng)基于“假設驅(qū)動”的醫(yī)學研究趨勢向“數(shù)據(jù)驅(qū)動”方向發(fā)展，為實現(xiàn)DKD氣陰兩虛證的精準辨證提供了先進的技術保證。

2.3?DKD氣陰兩虛證代謝標志物研究有望為DKD精準辨證提供客觀依據(jù)?對于DKD證候的認識，我們課題組從既往名老中醫(yī)經(jīng)驗、專家問卷調(diào)查，到大量的臨床研究和文獻數(shù)據(jù)挖掘，運用聚類分析、主成分分析和因子分析等數(shù)理學方法以及“證素辨證”等研究與驗證，各期證候分布符合從氣陰兩虛逐漸發(fā)展至陰陽俱虛的過程，血瘀證貫穿疾病始終[36]。通過對近30年來中醫(yī)藥治療DKD的1 464篇臨床RCT文獻進行了證候頻次的回顧性研究，發(fā)現(xiàn)頻次大于20%的證候依次為血瘀（89.9%）、氣虛（83.4%）、陰虛（66.2%）、腎虛（48.5%）、肝郁（41.8%）、脾虛（31.6%）和濕濁（21.8%）。在此基礎上，又通過350例臨床病例研究，確定DKD患者主要證候為氣虛證和陰虛證。然而，臨床證候不是孤立的，單純氣虛血瘀證與陰虛血瘀證是很少見的，氣陰兩虛夾瘀證是DKD主要證候，也是中醫(yī)藥治療DKD的最佳時機。由此，發(fā)現(xiàn)DKD氣陰兩虛證代謝標志物對DKD辨證論治十分重要。

近年來，諸多學者通過探索現(xiàn)代醫(yī)學指標與DKD中醫(yī)證候的相關性，實現(xiàn)辨證指標的量化，以期為DKD中醫(yī)辨證論治提供客觀依據(jù)。研究表明，DKD患者中醫(yī)證候與血肌酐、胱抑素C、尿蛋白等指標密切相關[39]。按照陰虛燥熱證、氣陰兩虛證、脾腎氣虛證、陰陽兩虛證順序，DKD患者血清IV型膠原和同型半胱氨酸水平逐漸增多，驗證了DKD本證從陰虛、氣虛到陽虛的演變。然而上述研究僅局限于DKD常規(guī)理化指標與中醫(yī)證候的關系，無法全面解析DKD中醫(yī)證候的生物學基礎。代謝組學整體性特點與中醫(yī)藥理論的整體觀和辨證論治相吻合，是研究中醫(yī)證候本質(zhì)的最佳方法之一。

一直以來，我們和其他研究者利用代謝組學方法對DKD證候研究進行了有益探索。有研究者利用2型糖尿病、糖尿病視網(wǎng)膜病變、DKD患者開展血清和尿液代謝組學研究，發(fā)現(xiàn)了DKD氣陰兩虛證相關的差異代謝物主要涉及氨基酸代謝、糖代謝、膽固醇代謝、脂代謝等[37]。另一項代謝組學研究篩選出3種2型DKD III期氣陰兩虛證潛在生物標志物：磷脂酰甘油、鞘磷脂和溶血磷脂酰乙醇[38]。在國家973課題和國家自然科學基金項目的資助下，我們與清華大學羅國安教授團隊曾運用磷脂[39]、脂肪酸[40-41]、嘌呤嘧啶[42]和硫醇氨基酸等定量代謝組學方法發(fā)現(xiàn)了包括磷脂酰膽堿PC792與PC802、磷脂酰乙醇胺PE750和PE742等4個磷脂類代謝標志物，S-腺苷同型半胱氨酸、同型半胱氨酸、谷胱甘肽、胱氨酸等4個硫醇氨基酸類代謝標志物，以及肌酐、尿嘧啶核苷、肌苷、肌氨酸等4個嘌呤嘧啶類代謝標志物共12個與DKD氣陰兩虛證相關的潛在代謝標志物。

3?目前存在的問題與展望

迄今為止，DKD代謝標志物研究均為小樣本探索性研究，并且所納入病例大多基于臨床特征診斷，而非經(jīng)腎活檢明確診斷的DKD，結果準確性難以保證。益氣養(yǎng)陰作為DKD主要治療原則在業(yè)內(nèi)達成共識，然而病情評估和療效判斷的客觀性和可重復性受到質(zhì)疑，因此，影響了藥物在臨床中的治療效果。表現(xiàn)于外的中醫(yī)證候與內(nèi)在疾病本質(zhì)有著必然的聯(lián)系，代謝組學整體性特點可以發(fā)現(xiàn)DKD氣陰兩虛證對應的代謝標志物，有助于提高DKD辨證論治的準確性和臨床療效。因此，基于高靈敏度、高分辨率代謝組學研究方法，結合計算機“大數(shù)據(jù)和深度學習”技術，發(fā)現(xiàn)并驗證DKD疾病以及DKD氣陰兩虛證的代謝標志物，進一步將數(shù)據(jù)變?yōu)樽C據(jù)，將為DKD的辨證分型提供可量化、可重復的客觀依據(jù)，有助于提高DKD辨證論治的科學性，為闡明該證候的物質(zhì)基礎提供重要依據(jù)。

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（2020-08-01收稿?責任編輯：王明）