鹽酸莫西沙星原料藥微生物限度檢測方法驗(yàn)證

孫蓉 潘玲利 張軍東

摘 要 目的：建立合適的鹽酸莫西沙星原料的微生物限度檢測方法，對該方法進(jìn)行驗(yàn)證，確保適用。方法：根據(jù)中國藥典2015版指導(dǎo)原則，采用薄膜過濾法，分別以聚山梨酯80和氯化鎂作為中和劑，比較對鹽酸莫西沙星的抑菌活性的影響。結(jié)果：加入氯化鎂作為中和劑可以較好的消除鹽酸莫西沙星的抑菌活性。結(jié)論：該方法準(zhǔn)確，可靠，操作方便，適用于鹽酸莫西沙星原料的微生物限度檢測。

關(guān)鍵詞 鹽酸莫西沙星 微生物限度 薄膜過濾法

中圖分類號：R927.11 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1006-1533（2019）13-0068-05

Methodological validation of microbial limit test for moxifloxacin hydrochloride

SUN Rong1*， PAN Lingli2， ZHANG Jundong1**

（1. Shanghai Haohai Biotechnology Co.， Ltd.， Shanghai 201613， China； 2. Shanghai Li Kang Rui Biological Engineering Co.， Ltd.， Shanghai 201707， China）

ABSTRACT Objective： To establish a suitable method for the detection of the microbiological limit in moxifloxacin raw material and to verify the method so as to ensure its application. Methods： The effects of polysorbitol 80 and magnesium chloride as neutralizers on the antibacterial activity of moxifloxacin itsself in microbiological limit test were compared by membrane filtration method based on the Guideline of Chinese Pharmacopoeia 2015 Edition. Results： The antibacterial activity of moxifloxacin itsself could be better eliminated when magnesium chloride was added. Conclusion： This method is accurate， reliable， and convenient to operate and is suitable for the detection of microbial limits in moxifloxacin hydrochloride raw materials.

KEy WORDS moxifloxacin hydrochloride； microbial limit； membrane filtration method

鹽酸莫西沙星為第四代新型喹諾酮類抗菌藥物，具有廣譜抗菌活性，抗菌的作用機(jī)制為抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ，阻斷細(xì)菌DNA合成，主要優(yōu)勢是耐藥性極低，為1.8×10-9～1×10-11，特別是不易與其他喹諾酮類抗生素產(chǎn)生交叉耐藥。與第三代喹諾酮類藥物相比，它進(jìn)一步提高了對革蘭陽性菌如肺炎球菌的抑制活性，同時(shí)也可以有效抑制厭氧菌?？狗前l(fā)酵菌（假單胞菌屬和洋蔥伯克霍爾德菌（Burkholderia cepacia）除外）、葡萄球菌、肺炎鏈球菌、腸球菌和厭氧菌的活性是環(huán)丙沙星和氧氟沙星的2～16倍；抗大腸埃希菌的活性是環(huán)丙沙星的50%，而抗沙眼衣原體、肺炎衣原體和支原體的活性都比環(huán)丙沙星高[1]。鹽酸莫西沙星開發(fā)的制劑包括片劑，滴眼液，注射液，療效顯著[2-6]。

由于鹽酸莫西沙星自身的抗菌活性，常規(guī)檢測方法未必能真實(shí)反映其原料藥中的微生物負(fù)載，但藥品微生物限度是藥品安全性的重要指標(biāo)之一，法規(guī)文件也對此提出了明確要求[7]。所以，進(jìn)行微生物限度檢查時(shí)，要求供試品自身在試驗(yàn)的條件下能有效排除其抑菌作用，使其不干擾染菌的限度檢驗(yàn)，檢測方法通過驗(yàn)證可以確認(rèn)供試品所采用的檢查方法和檢驗(yàn)條件適用[8-9]。

為消除鹽酸莫西沙星的抑菌活性，準(zhǔn)確檢測出每克原料實(shí)際微生物負(fù)載量，本研究確認(rèn)培養(yǎng)基適用性之后，采用薄膜過濾法，選擇氯化鎂溶液作為中和劑，并以聚山梨酯80作為中和劑同時(shí)比較，旨在驗(yàn)證該方法適用于鹽酸莫西沙星原料藥中微生物限度的檢測。

1 材料和方法

1.1 菌株與培養(yǎng)基

實(shí)驗(yàn)所用菌株為即用型定量菌株，金黃色葡萄球菌CMCC（B）26003（批號20181008）；枯草芽胞桿菌CMCC（B）63501（批號20180908）；銅綠假單胞菌CMCC（B） 10104（批號20180809）；白色假絲酵母CMCC（F） 98001（批號20180904）；黑曲霉CMCC（F） 98003（批號20180817）。以上菌株均為3代，全部購自浙江泰林生物技術(shù)股份有限公司。其凍干粉直接用商品配套溶液復(fù)溶，配制成菌懸液濃度為每0.1 ml不超過100 cfu。

胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（批號20181025）和沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（批號20170837），均購自浙江泰林生物技術(shù)股份有限公司；胰酪大豆胨瓊脂對照培養(yǎng)基（批號135025-201603）和沙氏葡萄糖瓊脂對照培養(yǎng)基（批號135013-201502），購自中國食品藥品檢定研究院。

1.2 藥品與試劑

鹽酸莫西沙星原料（印度瑞迪實(shí)驗(yàn)制藥股份有限公司，批號ABKH005846），氯化鎂（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號20181130），pH 7.2無菌磷酸鹽緩沖液（自制，批號20181127）。

1.3 儀器

BHC-1300IIA2生物安全柜（蘇州時(shí)金凈化設(shè)備科技有限公司）；LRH-250生化培養(yǎng)箱（上海合恒儀器有限公司）；LRH-100生化培養(yǎng)箱（上海合恒儀器有限公司）；ES-315全自動(dòng)滅菌鍋（日本Tomy公司）；KBF220一次性使用集菌過濾培養(yǎng)器（溫州維科生物實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；XK97-A菌落計(jì)數(shù)器（邦西儀器科技（上海）有限公司）。

1.4 方法

1.4.1 培養(yǎng)基適用性檢查

按定量菌株要求分別配制好菌懸液，使每0.1 ml菌液濃度不超過100 cfu；按照培養(yǎng)基說明書要求，配制好培養(yǎng)基。取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和枯草芽胞桿菌菌懸液各0.1 ml，分別各注入2個(gè)無菌平皿中，立即傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固，于30～35℃倒置培養(yǎng)3 d。白色假絲酵母和黑曲霉同法操作菌，但于30～35 ℃倒置培養(yǎng)5 d；同時(shí)，還將他們置于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基20～25 ℃培養(yǎng)5 d。細(xì)菌和真菌均須用相應(yīng)的對照培養(yǎng)基替代被檢培養(yǎng)基進(jìn)行上述試驗(yàn)。

逐日觀察需氧菌和真菌的菌落生長情況，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，取平均值計(jì)算比值。觀察比較試驗(yàn)菌在被檢培養(yǎng)基上與相應(yīng)的對照培養(yǎng)基上的菌落的數(shù)量、形態(tài)和大小。

1.4.2 未加中和劑

稱量鹽酸莫西沙星原料10 g，溶于1 000 ml pH 7.2無菌磷酸鹽緩沖液，作為1∶100的供試液。

1）試驗(yàn)組 取供試液100 ml與0.1 ml的金黃色葡萄球菌的菌懸液混勻，過濾，用700 ml pH 7.2無菌磷酸鹽緩沖液沖洗，每次100 ml，沖洗7次；將濾膜取出，菌面向上，貼于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平皿上（平行制備2個(gè)平皿），于30～35 ℃倒置培養(yǎng)不超過3 d，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。銅綠假單胞菌和枯草芽胞桿菌同法操作。而白色假絲酵母和黑曲霉須同法操作各制備2張濾膜，分別貼于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平皿和沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平皿上，置于30～35 ℃和20～25 ℃倒置培養(yǎng)不超過5 d。

2）菌液對照組 取稀釋液100 ml代替供試液，加入0.1 ml的菌懸液（不超過100 cfu），混勻，過濾，按試驗(yàn)組同法操作。

3）供試品對照組 取供試液100 ml，不接入試驗(yàn)菌，按照試驗(yàn)組同法操作。

4）空白對照組 用稀釋液100 ml代替供試液，不接入試驗(yàn)菌，按照試驗(yàn)組同法操作。

試驗(yàn)組菌數(shù)回收率=（試驗(yàn)組菌落數(shù)-供試品對照組菌落數(shù)）/菌液對照組菌落數(shù)×100%。

上述試驗(yàn)獨(dú)立平行操作3次。

1.4.3 中和劑加入試驗(yàn)

分別以4.0%聚山梨酯80和2 mol/L氯化鎂為中和劑，各組每100 ml培養(yǎng)基中加入了5 ml中和劑，其余按1.4.2操作。

2 結(jié)果

2.1 培養(yǎng)基適用性

被檢與對照培養(yǎng)基菌落平均數(shù)的比值均在0.5～2范圍內(nèi)，且菌落形態(tài)大小與對照培養(yǎng)基的菌落一致（表1），說明培養(yǎng)基適用性檢查符合要求。

2.2 不加中和劑

鹽酸莫西沙星對細(xì)菌的抑菌活性較強(qiáng)，檢測需氧菌總數(shù)時(shí)需要添加合適的中和劑抑制其自身的抗菌活性；白色假絲酵母和黑曲霉的回收率在0.5～2.0之間（表2），符合藥典規(guī)定要求，表明可直接進(jìn)行霉菌和酵母菌的微生物限度檢測。

2.3 加入中和劑

2.3.1 聚山梨酯80

加入聚山梨酯80對需氧菌的生長沒有明顯影響，表明其不能抑制鹽酸莫西沙星自身的抗菌活性，但其對霉菌和酵母菌的檢測沒有影響（表3）。

2.3.2 氯化鎂

氯化鎂作為中和劑加入可較好地消除鹽酸莫西沙星的抑菌活性，適用于需氧菌總數(shù)的檢測，而對霉菌和酵母菌的檢測沒有影響（表4）。

3 討論

不同的產(chǎn)品，或者同一產(chǎn)品用途不同，微生物限度的檢測方法都存在差異，需要建立合適的方法[10-17]。根據(jù)中國藥典2015版通則1105要求[18]，本研究首先確認(rèn)了培養(yǎng)基適用性，然后驗(yàn)證計(jì)數(shù)方法適用性，即微生物限度檢測方法適用性。

鹽酸莫西沙星在水中溶解度不是特別好，選擇pH 7.2磷酸鹽緩沖液，可以提高溶解度，并且溶液pH穩(wěn)定。鹽酸莫西沙星配成1∶100的供試液，取100 ml，采用薄膜過濾法，單張薄膜菌落數(shù)即可為每克原料的微生物負(fù)載量，無需換算，符合檢測限度要求的量。

鹽酸莫西沙星屬于喹諾酮類藥物，對金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌，枯草芽胞桿菌有明顯抑制作用，未加中和劑或加中和劑聚山梨酯80時(shí)，這三種細(xì)菌的回收率均為0。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[19]，氟喹諾酮類藥物與Mn2+、Mg2+等金屬離子絡(luò)合，可降低其生物活性。本研究比較了培養(yǎng)基中不加中和劑、加入中和劑聚山梨酯80和氯化鎂對其自身抗菌活性的影響，結(jié)果顯示氯化鎂作為中和劑具有較好的抑制其自身抗菌活性的效果，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。細(xì)菌和真菌的回收率大都可達(dá)0.5以上，僅枯草芽胞桿菌有一次回收率為0.49。中國藥典2015版規(guī)定[18]：若各試驗(yàn)組菌數(shù)的回收率均符合要求，照所用的供試液制備方法及計(jì)數(shù)方法進(jìn)行該供試品的需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)。方法適用性確認(rèn)時(shí)，若采用上述方法還存在一株或多株試驗(yàn)菌的回收達(dá)不到要求，那么選擇回收最接近要求的方法和試驗(yàn)條件進(jìn)行供試品的檢查。

根據(jù)微生物限度驗(yàn)證結(jié)果可知，鹽酸莫西沙星對白色假絲酵母和黑曲霉的抑菌活性不強(qiáng)，無論加中和劑與否，回收率均在0.5～2.0之間。根據(jù)中國藥典2015版要求，回收率在0.5～2.0之間，可認(rèn)為該方法適用，即可用于霉菌和酵母菌的檢測。

本研究表明，胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基中加入氯化鎂中和劑，可用于檢測需氧菌總數(shù)；沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基不加中和劑，可用于檢測霉菌和酵母菌總數(shù)。符合中國藥典檢測抗菌藥物微生物限度的有關(guān)要求。也許還有更合適的試劑或更合適的濃度可以更好地消除鹽酸莫西沙星自身的抑菌活性，研究人員將繼續(xù)探索，以期發(fā)現(xiàn)更合適的抑菌中和劑。

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