生存脅迫法分離那拉提土壤拮抗放線菌及活性產(chǎn)物

劉占文 張利莉

（塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木盆地生物資源保護(hù)利用重點實驗室，新疆阿拉爾843300）

近幾年新型病情及耐藥菌株的不斷出現(xiàn)，對抗生素尤其是新的活性良好的抗生素的發(fā)現(xiàn)已經(jīng)迫在眉尖［1]，人們也努力嘗試諸如生物組合合成及半合成等方法獲得新型抗生素并取得了很大成就，然而這些方法獲得的抗生素均為已知抗生素的衍生物［2]，要想獲得母核新穎的抗生素必須需要新的資源。而放線菌是抗生素的重要產(chǎn)生資源菌，因此如何從環(huán)境中獲得活性放線菌成了解決問題的關(guān)鍵［3] 。

放線菌是抗生素的重要產(chǎn)生菌，獲得活性放線菌資源在抗生素發(fā)掘中十分重要［4]，但是常規(guī)的放線菌分離法存在兩個不足，一是獲得可培養(yǎng)放線菌的數(shù)量有限，僅為自然間放線菌總量的1%，鑒于此，Ling等年開發(fā)了一種“iChip”的裝置，此法可將土壤可培養(yǎng)放線菌的分離率提高到50%［5]，此法的核心原理是避免土壤放線菌在生長過程中互相干擾，賦予了每個放線菌單獨的生存生長空間，實現(xiàn)了“一室一菌”［6]；二是分離獲得的可培養(yǎng)放線菌中活性放線菌比例偏低，后續(xù)活性放線菌的篩選工作繁重，活性產(chǎn)物獲得幾率不高［7]，如羅紅麗等從我國西藏地區(qū)分離的可培養(yǎng)放線菌中，活性放線菌的比例只有38.5%［8]，其原因可能是土壤中非活性放線菌的比例偏高所致，因此如何處理分離土壤樣品，使其活性放線菌的比例提高在活性放線菌資源獲得上顯得尤為重要［9]。

本研究根據(jù)“自然選擇適者生存”的思想，設(shè)計了“生存脅迫法”來提高土壤樣品中活性放線菌的比例，既在預(yù)分離的土壤樣品中人工加入多種病原菌進(jìn)行脅迫，逐步淘汰面對病原菌無法生存的放線菌，同時富集能夠拮抗病原菌的放線菌，并以此預(yù)處理土樣作為放線菌分離的理想土壤樣品。同時為了進(jìn)一步提高可培養(yǎng)放線菌的分離比例，借鑒了“iChip”法分離放線菌的思路，采用“96孔板法”實現(xiàn)“一室一菌”進(jìn)行可培養(yǎng)活性放線菌的分離。

結(jié)果表明，“生存脅迫法”和“96孔板法”相結(jié)合，分離獲得的活性放線菌比例高達(dá)89.7%，并通過次生代謝產(chǎn)物的挖掘，從分離到的一株鏈霉菌——S.luteusTRM70003中成功鑒定了兩個活性良好的抗生素，分別為放線菌素D和星形孢菌素?？梢娫摲ㄔ谕寥阑钚苑啪€菌分離獲得上有效可行，為后續(xù)土壤放線菌資源及其次生代謝產(chǎn)物的挖掘提供了理論參考和實踐借鑒。

1 材料和方法

1.1 供試土樣

實驗用土樣于2017年6月采于新疆那拉提，無菌袋包裝后4℃保藏。

1.2 供試病原菌

供試病原菌均為課題組保藏菌種，分別為：金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureusATCC 6538）、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidisATCC 35984)、大腸桿菌（Escherichia coliATCC 25922）、白色念珠菌（Candida albicansATCC 64550）、棉花黃萎病（Verticillium dahliaeACCC 36211）、棉花枯萎?。‵usarium oxysporum fsp.VasinfectumACCC31038）、辣椒疫霉(Phytophthora capsiciACCC36278)。

1.3 實驗用培養(yǎng)基

ISP4：可 溶 性 淀 粉 10 g，K2HPO41.0 g，Mg-SO4.7H2O 1.0 g，(NH4)2SO42.0 g，CaCO32.0 g，微量元素液1.0 mL，NaCl 1.0 g，瓊脂 18.0 g，pH 7.0～7.6。

ISP3：燕麥 20.0 g，微量元素液 1.0 mL，NaCl 1.0 g，pH 7.0～7.5。

AM6：葡萄糖10.0 g，淀粉20.0 g，蛋白胨5.0 g，酵母浸膏5.0 g，碳酸鈣5.0 g，蒸餾水1.0 L，pH7.0。

1.4 主要試劑及儀器

PCR儀（Lab Cycler S tandard，SENSO，德國）；凝膠成像儀（ChemDoc XRS+，伯樂公司，美國）；高壓滅菌器（BXM-150M，博迅，上海）；超凈工作臺（SW-CJ-2F，博迅，上海）；高效液相色譜儀（LC-20AT，島津，日本）；制備液相儀（Waters255，Waters，美國）；核磁共振儀（500-54 Ascend UHL，Bruker，德國）；凝膠、甲醇、二氯甲烷（分析純，天津市福晨化學(xué)試劑廠）。

1.5 實驗方法

1.5.1 土壤預(yù)處理

根據(jù)“自然選擇適者生存”的思想，設(shè)計了“生存脅迫法”處理土樣，即將S.aureusATCC 6538、S.epidermidisATCC 35984、E.coliATCC 25922、C.albicansATCC 64550、V.dahliaeACCC 36211、F.sp.VasinfectumACCC31038、P.capsiciACCC36278 7種病原菌分別制成菌懸液或孢子懸液，各取10 mL加入到1000g風(fēng)干土樣中，同時加入10g可溶性淀粉于土樣中，定期補水，維持土樣濕潤，30d后用于放線菌分離。

1.5.2 放線菌分離

將預(yù)處理好的土樣稀釋到10-4后，無菌條件下加入到倒有ISP4培養(yǎng)基的96孔板中，每孔5 μL，28℃培養(yǎng)11 d后挑去單菌落于培養(yǎng)皿中進(jìn)行純化培養(yǎng)。

1.5.3 純培養(yǎng)的16S rDNA鑒定

菌株的DNA提取用SDS-蛋白酶法，應(yīng)用引物27F（5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC-3′）和1492R（5′-CGG CTA CCT TGT TAC GAC TT-3′）進(jìn)行擴增放線菌的16S rDNA及測序（上海生工）。利用EzTaxon-e進(jìn)行序列比對，進(jìn)行菌株的初步鑒定，采用Neighbour-joining法對分離獲得的放線菌進(jìn)行多重序列分析，用軟件MEGA構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5.6 活性放線菌篩選及次生代謝能力分析

采用ISP4液體培養(yǎng)制備種子液，采用ISP3及AM6為發(fā)酵培養(yǎng)基，對分離獲得的放線菌進(jìn)行發(fā)酵（140 rpm，28℃，7 d），發(fā)酵液過大孔吸附樹脂并菌體甲醇超聲提取無合并的浸膏，經(jīng)甲醇重新溶解后獲得放線菌次生代謝粗提物，待用。以大腸桿菌、金黃色普通球菌及白色念珠菌為指示菌，采用濾紙片擴散法對放線菌次生代謝粗提物進(jìn)行活性實驗，同時將粗提物進(jìn)行HPLC分析。

1.5.7S.luteusTRM70003發(fā)酵、分離與純化

將菌株S.luteusTRM70003接種于ISP4液體培養(yǎng)基中（每500 mL錐形瓶中裝200 mL液體培養(yǎng)基），每瓶接種6塊菌餅，于28℃、180 rpm條件下培養(yǎng)7 d，得發(fā)酵種子液。發(fā)酵種子液接種于AM6發(fā)酵培養(yǎng)基中，與制備種子液培養(yǎng)相同時間，過濾分離菌體和發(fā)酵液，菌體用甲醇進(jìn)行超聲提取，發(fā)酵液進(jìn)行大孔樹脂柱層析，合并，濃縮，進(jìn)行柱層析分離，分離流程圖如1所示。

圖1 S.luteusTRM70003發(fā)酵產(chǎn)物分離純化

1.5.8 活性次生代謝產(chǎn)物的鑒定

根據(jù)化合物的物理化學(xué)性質(zhì)并結(jié)合核磁1H NMR、13C NMR、HSQC及HMBC譜圖數(shù)據(jù)，基于活性跟蹤基礎(chǔ)上對Fr3和Fr16部位分離的活性產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析，確定化合物的結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 那拉提土壤放線菌的分離及16S rDNA鑒定

根據(jù)《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)鑒定手冊》結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)對分離于那拉提土壤的29株放線菌進(jìn)行鑒定［10]（圖2），其中28株為鏈霉菌，占總分離菌株的96.55%，1株為小單孢菌，占總分離菌株的3.45%，結(jié)果表明，從圖2中看出，28株鏈霉菌分支情況較好，說明“生存脅迫法”和“96孔板法”相結(jié)合能較好的分離獲得土壤中的活性放線菌。此外，那拉提土壤的放線菌種類和豐富度單一，可能于土壤營養(yǎng)成分適應(yīng)于放線菌屬中鏈霉菌的生長。

圖2 29株放線菌16S rDNA鑒定及聚類

2.2 29株放線菌株次生代謝能力

根據(jù)16S rDNA序列比對結(jié)果，通過文獻(xiàn)調(diào)研29株放線菌相似菌株的次生代謝能力，結(jié)果如表2所示，由表2可知，29株相似放線菌中，只有S.mangroviTRM70134（98.82%）和S.gancidicusTRM70121（99.20%）兩株鏈霉菌未見文獻(xiàn)報道產(chǎn)生抗生素的情況，而S.ambofaciens TRM70050（99.26%，二素鏈霉菌）主要產(chǎn)生螺旋霉素及羅紅霉素；S.galilaeusTRM70126（100.00%，加利鏈霉菌）主要產(chǎn)生阿克拉霉素、S.geysiriensisTRM70112（99.72%噴泉鏈霉菌）主要產(chǎn)黃霉素、S.pseudogriseolusTRM70103(假淺灰鏈霉菌)主要產(chǎn)色霉素和茴香霉素等菌株及其所產(chǎn)的抗生素都具有良好的開發(fā)應(yīng)用價值。29株放線菌中，相似菌株應(yīng)用于實際生產(chǎn)的工業(yè)菌種多達(dá)9株，占總菌株的31.0%，29株放線菌相似菌株產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物能力較強，所產(chǎn)抗生素中有11種已經(jīng)用于臨床或農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。由此可見，“生存脅迫法”和“96孔板法”相結(jié)合是分離產(chǎn)生拮抗活性菌株的有效手段。

表2 29株放線菌相似菌株及拮抗活性成分分析

2.3 發(fā)酵產(chǎn)物拮抗活性與HPLC分析

采用AM6和ISP3兩種培養(yǎng)基對分離的29株放線菌進(jìn)行發(fā)酵，獲得粗提物后對E.coli、S.aureus和C.albicans靶標(biāo)菌進(jìn)行抗菌活性測試，采用濾紙片擴散法對放線菌次生代謝粗提物進(jìn)行活性實驗，同時將粗提物進(jìn)行HPLC分析。結(jié)果如表3和圖3。

從29株放線菌的HPLC分析來看，29株放線菌均有不同程度的產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物能力，更進(jìn)一步證實了“生存脅迫法”和“96孔板法”相結(jié)合在分離活性放線菌上的優(yōu)勢。

表3 29株放線菌拮抗活性篩選Table 3 Antimicrobial activity screening of 29 actinomycetes

從表3可以看出，分離獲得的29株放線菌中，至少對三種供試靶標(biāo)菌一種有活性的菌株多達(dá)26株，占89.7%，遠(yuǎn)大于常規(guī)分離法獲得活性菌株的比例。其中對三種供試靶標(biāo)菌都具有活性的菌株為：TRM70001、 TRM70003、 TRM70117、 TRM70124、TRM70103、TRM70120、TRM70119等7株放線菌表現(xiàn)出了對三種靶標(biāo)菌的拮抗活性（24.1%，）表明其具有廣譜抑菌能力。

圖3 29株放線菌次生代謝產(chǎn)物HPLC分析

2.4 S.luteusTRM70003發(fā)酵產(chǎn)物分離鑒定

鑒于S.luteusTRM70003發(fā)酵粗提物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌及白色念珠菌都具有抑制活性，且HPLC分析顯示代謝產(chǎn)物豐富，采用ISP3對該菌株進(jìn)行發(fā)酵及產(chǎn)物分離鑒定，最終成功分離獲得了兩種活性良好的抗生素70006-6和70003-3，通過1H NMR及13C NMR數(shù)據(jù)于文獻(xiàn)比對，70003-6鑒定為放線菌素D［33]，70003-3為星形孢菌素［34]，其13C NMR信息如表4和表5，結(jié)構(gòu)如圖4所示。

圖4 放線菌素D（左）和星形孢菌素（右）化學(xué)結(jié)構(gòu)

3 討論

醫(yī)藥領(lǐng)域新藥的研發(fā)主要來源于放線菌，70%以上的抗生素都來源于放線菌次生代謝產(chǎn)物，從放線菌中尋找次生代謝產(chǎn)物的方法也多種多樣，基于文獻(xiàn)報活性追蹤，拮抗活性篩選和高通量篩選的方法和手段分離的活性菌株率為1‰，甚至更少。而本論文基于“生存脅迫法”和“96孔板法”相結(jié)合分離思路，將各種病原菌和土壤共同孵育，再通過常規(guī)分離方法獲對病原菌有拮抗活性菌株的比例高達(dá)89.7%，而且分析拮抗菌株產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物的豐富度來分析，29株放線菌中有9株放線菌已經(jīng)工業(yè)化，11中在臨床和農(nóng)業(yè)實際中有所應(yīng)用。可見“生存脅迫法”和“96孔板法”相結(jié)合法是有效的活性放線菌分離及次生代謝產(chǎn)物挖掘方法，值得推廣提倡，也因此本研究為后續(xù)活性放線菌資源的獲取提供了重要的理論參考和實際借鑒作用［35-36]。

同時對分離到的S.luteusTRM70003進(jìn)行了發(fā)酵產(chǎn)物分離鑒定，最終成功獲得了兩種活性；良好的抗生素——分別為放線菌素D及星形孢菌素。對多種病原菌都具有抗菌活性。然而不足的是，本研究分離獲得放線菌數(shù)量有限，僅為29株，而且多樣性較差，29株放線菌中只有一株為小單孢菌，其余均為鏈霉菌，這可能與分離培養(yǎng)基過于單一（本研究僅用ISP4作為分離培養(yǎng)基）有關(guān)，如何進(jìn)一步提高分離放線菌的多樣性及數(shù)量有待進(jìn)一步研究。

表4 化合物70003-6和放線菌素D13C NMR數(shù)據(jù)

續(xù)上表

表5 化合物70003-3和星形孢菌素D13C NMR數(shù)據(jù)