棘孢木霉JM -1菌株對麥根腐離蠕孢的拮抗機制

張眉　吳斌　徐德坤　王升吉　辛相啟　姜珊珊

摘要：為了研究木霉菌JM-l菌株對麥根腐離蠕孢CY6菌株的拮抗機制，本研究結(jié)合形態(tài)學和分子生物學鑒定方法，明確JM-l菌株的分類地位，并采用平板對峙培養(yǎng)法和顯微觀察，分析JM-l菌株對CY6菌株的拮抗作用。結(jié)果表明，木霉菌JM-l菌株為棘孢木霉（Trichoderma a.sperellurn），可通過空間和營養(yǎng)競爭抑制CY6菌株的生長，抑菌率為77.22%;顯微觀察發(fā)現(xiàn)，棘孢木霉JM-l對CY6菌株有明顯的重寄生作用，同時，JM-l菌株可產(chǎn)生某些抗生物質(zhì)，使CY6菌株的菌絲、分生孢子發(fā)生變形和消解。因此，棘孢木霉JM-l菌株可通過競爭作用、重寄生作用和抗生作用等多重生防機制抑制麥根腐離蠕孢的生長。

關(guān)鍵詞：棘孢木霉;麥根腐離蠕孢;拮抗機制

Antagonistic Mechanism of Trichodermaasperellum JM - 1 against Bipolaris sorokinianaZhang Mei， Wu Bin， Xu Dekun， Wang Shengji， Xin Xiangqi， Jiang Shanshan

Abstract In order to study the antagonistic mechanism of Trichoderma spp. JM - I against Bipolaris so-rokiniana， the taxonomic status of JM - 1 was confirmed by morphological and molecular biological identifica-tion methods， and the antagonistic mechanism between JM -1 and CY6 isolates were analyzed by plate con-frontation culture and microscopic observation. The results showed that JM - 1 isolate was identified as Tri-choderma asperellum， and it restrained the growth of CY6 isolate through spatial and nutrient competition withand the inhibition rate as 77.22% . Microscopic observation found that JM - 1 isolate had the significant para-sitic effect on CY6 isolate， and produced some antibiotic substance， which led to deformation and digestion ofmycelia and conidia. In summary， T. asperelluim JM - 1 isolate could inhibit the growth of B. sorokinianathrough multiple biological control mechanisms such as competition， mycoparasitism and antibiosis.

Keywords Triclzoderma asperellum ; Bipolaris sorokiniana ; Antagonistic mechanism

木霉菌（Trichoderma spp.）對多種植物病原菌都具有較好的拮抗作用[1]，是一類應用廣泛、適應力強、拮抗機制多樣的生防菌[2]，在防治植物病害上發(fā)揮著重要作用。棘孢木霉（Trichoder-ma asperellum]是由Samuels等[3]于1999年命名的木霉新種，在我國由章初龍等[4]于2005年首次報道。目前研究表明，棘孢木霉是一種優(yōu)良的生防真菌，對黃瓜枯萎病菌（Fusarium oxyspo-rum）[5]、玉米大斑病菌（Exserohilum turcicum）[6]、水稻紋枯病菌（Rhizoctonia solani）[7]等病原菌都有良好的抑制效果。

小麥根腐病是山東小麥產(chǎn)區(qū)的重要病害之一，該病危害嚴重并呈逐年加重趨勢，主要病原物為麥根腐離蠕孢（Bipolaris sorokiniana）。崔云龍等[8]研究表明，短小芽孢桿菌D82對小麥根腐病有較強的抗生作用，防效顯著。王立等[9]研究發(fā)現(xiàn)，叢枝菌根真菌摩西球囊霉（ Glomus mosseae）能有效防治小麥根腐病，并對小麥的營養(yǎng)生長有促進作用。目前利用木霉菌防治小麥根腐病的研究報道較少。本研究采用形態(tài)學和分子生物學鑒定方法，確定木霉菌JM-1菌株的分類地位，通過平板對峙培養(yǎng)和顯微觀察，明確其對麥根腐離蠕孢的拮抗機制，為木霉菌JM-1菌株防治小麥根腐病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1供試菌株

供試菌株：木霉菌JM -1菌株分離自小麥根際土壤;小麥根腐病麥根腐離蠕孢（Bipolaris soro-kiniana）CY6菌株為本實驗室保存。

1.2 生化試劑及其他

Easy Taq酶購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，真菌DNA提取試劑盒購自O(shè)mega公司，DNA凝膠回收試劑盒購自上海Sangon公司。其他常規(guī)化學藥品均為分析純試劑。PCR引物合成由上海Sangon公司完成。DNA測序由鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司完成。

1.3 木霉菌的鑒定

1.3.1 形態(tài)學鑒定 將純化的木霉菌JM -1菌株接種于PDA培養(yǎng)基平板，28C倒置培養(yǎng)，分別在接種24、48、72、96 h觀察菌落形態(tài)、顏色及培養(yǎng)性狀。挑取菌絲，顯微觀察分生孢子梗和分生孢子的形態(tài)特征。

1.3.2 分子生物學鑒定 收集JM -1菌株的菌絲體，用HP Fungal DNA Kit提取試劑盒提取菌株基因組，以DNA為模板，用通用引物ITSIF（5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG -3）和ITS4R（5 -TCCTCCGCTTATTGATATGC -3）擴增rDNA -ITS序列，水作陰性對照。PCR反應體系為25μL：IO×Easy Taq Buffer（含Mg2+）2.5μL，2.5mmol/L dNTPs 2poL，5 U/pL Easy Taq 0.3μL，10ymol/L正反向引物各0.5μL，DNA模板1μL，ddH，0補足至25μL。PCR反應程序為：94℃ 4min;94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 35 s，35個循環(huán);72℃ 10 min。切膠回收目的條帶進行測序。

在GenBank數(shù)據(jù)庫中下載合適的木霉菌株序列，通過Clustalx l.83軟件對ITS序列進行比對。利用MEGA 5.0分析軟件中的Neighbor-Joining分析法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，基于Kimura 2-parameter距離模式計算遺傳距離。各分支置信度（Bootstrap）進行1000次重復分析。

1.4 木霉菌對病原菌的拮抗作用

采用平板對峙培養(yǎng)法：木霉菌JM-1菌株和麥根腐離蠕孢CY6菌株均置于28℃活化3d，然后用直徑7mm的打孔器分別在菌落邊緣打取菌餅，接種于PDA平板中線上相距7 cm的兩點處，28℃黑暗培養(yǎng)。以一端接種病原菌菌餅，一端接種空白PDA菌餅作對照，每個處理重復3次。每隔24h測量菌落半徑，計算抑菌率。抑菌率（%）=（對照病原菌菌落半徑一處理病原菌菌落半徑）/對照病原菌菌落半徑×l00。

1.5 拮抗作用的顯微觀察

在PDA平板兩端分別接種木霉菌JM-1菌株和麥根腐離蠕孢CY6菌株的菌餅，在菌餅之間平放無菌蓋玻片，28℃黑暗培養(yǎng)。待兩端菌絲長至蓋玻片上，菌絲相交后，進行顯微觀察。以蓋玻片上只長有病原菌作對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 木霉菌JM-1菌株的形態(tài)學鑒定

在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h菌落圓形，呈輻射狀生長，菌絲白色;培養(yǎng)48 h菌落中央產(chǎn)生綠色孢子;72 h菌落即能長滿直徑9 cm的培養(yǎng)皿，并出現(xiàn)一圈稀薄一圈厚密的菌絲生長帶，綠色孢子由中央向四周擴展;96h厚密的菌絲生長帶上產(chǎn)生大量綠色孢子，菌落呈現(xiàn)白綠相間的同心圓狀（圖1）。

顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，菌絲細長，有隔，分生孢子梗對生分支，頂端有瓶梗，瓶梗2個或多個為一組輪生，瓶梗中間膨大，呈安瓿瓶形。分生孢子大小為（2.95～4.07） μm×（3.11～4.69）卜Lm，青綠色，圓形或卵形（圖2）。該菌株的培養(yǎng)性狀和形態(tài)特征與棘孢木霉（Trichoderma asperellum）基本一致，因此初步鑒定為棘孢木霉。

2.2 木霉菌JM-1菌株的分子生物學鑒定

用通用引物ITSIF/ITS4R擴增JM-1菌株基因組的ITS序列，得到一條約600 bp的目的條帶（圖3）。將測定的JM-1菌株ITS序列與GeneBank數(shù)據(jù)庫中下載的木霉序列進行同源性比較并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，從樹狀圖（圖4）可以看出，JM-1菌株聚類到Trichoderma asperellum進化枝上。綜合形態(tài)學和分子生物學鑒定結(jié)果，明確JM-1菌株為棘孢木霉（Trichoderma asperel-lum）。

2.3 棘孢木霉對麥根腐離蠕孢的拮抗作用

在PDA平板對峙培養(yǎng)過程中，棘孢木霉JM-1菌株對麥根腐離蠕孢CY6菌株有較強的抑制作用，抑菌率為77.22%。相比CY6菌株，JM-1菌株生長迅速，培養(yǎng)3d菌絲即與CY6菌絲相交，CY6菌絲的生長明顯受到抑制，菌落邊緣出現(xiàn)輕微塌陷。培養(yǎng)至第4d，JM-1菌絲將CY6菌落包圍，菌絲幾乎不能生長，而JM-1菌絲覆蓋在CY6菌落上繼續(xù)生長。對峙培養(yǎng)10d，JM -1菌絲已將CY6菌落完全覆蓋，并在CY6菌落上產(chǎn)生大量綠色孢子（圖5）。從以上結(jié)果可以看出，棘孢木霉JM -1菌株能夠通過對生長空間和營養(yǎng)物質(zhì)的競爭有效抑制麥根腐離蠕孢CY6菌株的生長。

2.4 棘孢木霉對麥根腐離蠕孢拮抗作用的顯微觀察

在PDA培養(yǎng)基上，棘孢木霉JM -1菌株與麥根腐離蠕孢CY6菌株對峙培養(yǎng)3d菌絲相交，顯微觀察發(fā)現(xiàn)，棘孢木霉JM-1菌絲逐漸纏繞CY6菌絲，與對照相比，CY6菌絲發(fā)生變形、斷裂、消解，分生孢子量明顯減少，并出現(xiàn)變形、破裂現(xiàn)象（圖6）。由此可見，棘孢木霉JM-1菌株可通過纏繞的方式寄生在CY6菌絲上，具有重寄生作用，此外，JM-1菌株還可能產(chǎn)生了某些抗生物質(zhì)，導致CY6菌絲和分生孢子變形、解體。

3 討論與結(jié)論

木霉屬真菌廣泛存在于土壤、植物殘體等生態(tài)環(huán)境中，是土壤中微生物種群的優(yōu)勢真菌[10]。該屬真菌種類繁多，常見的木霉屬真菌有哈茨木霉（T.harzianum）、綠色木霉（T.viride）、棘孢木霉（T.asperelluim）、深綠木霉（T.atroviride）、長枝木霉（T. longibrachiatum）、康寧木霉（T.konin-gii）等。本研究從菌落形態(tài)、分生孢子梗及分生孢子特性等方面，初步確定木霉菌JM-1菌株為棘孢木霉。但由于木霉菌形態(tài)特征較復雜，同時缺乏穩(wěn)定性[5]，單從形態(tài)特征上不能準確確定分類地位。真菌rDNA - ITS序列因既具有保守性，又具有序列多態(tài)性，能夠有效鑒定微生物的種屬關(guān)系。本研究通過擴增JM-1菌株ITS序列并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹發(fā)現(xiàn)，木霉菌JM-1菌株聚類在了Trichoderma asperellu：m進化分支上。分子生物學鑒定結(jié)果與形態(tài)學鑒定結(jié)果一致，明確了木霉菌JM-1菌株為棘孢木霉（Trichoderma asperellum）。

木霉菌可通過競爭作用、重寄生作用、抗生作用、誘導抗性和協(xié)同拮抗作用等多重生防機制防治植物病害[ll]。李琳等[6]篩選獲得一株棘孢木霉T31菌株，該菌對玉米大斑病菌有較強的生長競爭優(yōu)勢，同時具有明顯的重寄生作用。夏偉等[12]研究結(jié)果表明，棘孢木霉菌株I4能夠通過競爭和抗生雙重作用有效抑制立枯絲核菌的生長。本研究發(fā)現(xiàn)，棘孢木霉JM-1菌株能夠快速占領(lǐng)生長空間，且能覆蓋在麥根腐離蠕孢CY6菌落上，表明棘孢木霉JM -1菌株具有較強的空間和營養(yǎng)競爭優(yōu)勢，可通過競爭作用抑制CY6菌絲的生長。同時，棘孢木霉JM-1菌株還可纏繞在CY6菌株的菌絲上，通過重寄生作用吸取CY6菌絲的營養(yǎng)物質(zhì)，使其菌絲發(fā)生斷裂、解體。木霉菌發(fā)揮抗生作用而產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)主要有抗菌肽類、抗生素類以及揮發(fā)性物質(zhì)[13]，這些代謝產(chǎn)物能夠引起病原菌菌絲原生質(zhì)凝聚、菌絲變形解體[12，14]，抑制病原孢子萌發(fā)[15]等。本研究顯微觀察發(fā)現(xiàn)，棘孢木霉JM-1菌株與麥根腐離蠕孢CY6菌株相交后，CY6菌絲發(fā)生變形、斷裂、解體，分生孢子發(fā)生變形消解。由此可以推斷，棘孢木霉JM -1菌株可能產(chǎn)生了某些抗菌物質(zhì)，從而對麥根腐離蠕孢CY6菌株起到抗生作用。綜上，棘孢木霉JM-1菌株可通過競爭作用、重寄生作用和抗生作用有效抑制麥根腐離蠕孢的生長。下一步將針對棘孢木霉JM-1菌株產(chǎn)生的抗生物質(zhì)主要成分以及該菌株對小麥根腐病的生防作用做進一步研究。

參考文獻：

[1]郭潤芳，劉曉光，高克祥，等.拮抗木霉菌在生物防治中的應用與研究進展[J].中國生物防治，2002，18（4）：180 -184.

[2] 吉海龍，伊洪偉，池玉杰.長枝木霉菌株T05抑菌活性與拮抗機制[J].東北林業(yè)大學學報，2016，44（1）：114 -119.

[3] Samuels G J，Lieckfeldt E，NirenbergH I.Trichoderma a.s-perellum，a new species with warted conidia. and redesCriptionof Zviricle[J].Svdowia，1999，51（1）：71 - 88.

[4] 章初龍，徐同.我國河北、浙江、云南及西藏木霉種記述[J].菌物學報，2005，24（2）：184 -192.

[5] 夏偉，顏艷偉，張紅，等.木霉菌Trl0的鑒定及其對幾種病原菌的抑制作用[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2010，38（5）：2424 - 2426.

[6] 李琳，張雅梅，張祥輝，等.生防棘孢木霉T31菌株的分離篩選及其生物學特性[J].植物保護學報，2014，41（1）：54 -60.

[7] 陳立華，金秋，牛明，等.棘孢木霉對水稻紋枯病病原菌立枯絲核菌生物防治的研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學，2015，43（5）：115 -117.

[8] 崔云龍，姬金紅，衣海青.短小芽孢桿菌D82對小麥根腐病原菌拮抗的研究[J].中國生物防治，1995，11（3）：114 - 118.

[9] 王立，王敏，馬放，等.叢枝菌真菌對小麥的促生長效應與根腐病抑制效應[J].哈爾濱工業(yè)大學學報，2015，47（4）：15 -19.

[10]張廣志，楊合同，文成敬.木霉菌形態(tài)學分類檢索與分子生物學鑒定[J].山東農(nóng)業(yè)大學學報（自然科學版），2011，42（2）：309 -316.

[11] 王永陽，杜佳，高克祥.苦瓜枯萎病生防木霉的篩選鑒定及其定殖的qPCR檢測[J].山東農(nóng)業(yè)科學，2018，50（8）：110 - 115.

[12] 夏偉，張紅，顏艷偉，等.棘孢木霉L4對立枯絲核菌的拮抗機制[J].植物保護學報，2010，37（5）：477 -478.

[13] 李沖偉，楊立賓，鄧勛，等.木霉菌株對金黃殼囊孢菌的抑菌效應及機制[J].林業(yè)科學，2012，48（9）：88 -94.

[14] 朱天輝，邱德勛.Trichoderma harzzanum對Rhizoctonic solani的抗生現(xiàn)象[J].四川農(nóng)業(yè)大學學報，1994，12（1）：11 -15.

[15] 蔣妮，白丹宇，宋利沙，等.棘孢木霉F2菌株對三七灰霉病的生物防治作用[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學，2018，46（20）：94 - 97.