芹菜線粒體atp6基因的克隆及在花發(fā)育過程中的表達

譚國飛， 鐘秀來， 羅 慶， 王天文

(貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 園藝研究所， 貴州 貴陽 550006)

芹菜(ApiumgraveolensL.)為傘形科芹屬一二年生的蔬菜作物，是世界上重要的蔬菜作物之一。中國是芹菜種植大國，每年栽培面積約為55 hm2，產(chǎn)量約為2 000萬t[1]。芹菜由于雄性不育材料的缺乏，以及芹菜育性相關(guān)的分子機制研究相對其他蔬菜較少，導(dǎo)致芹菜雜種優(yōu)勢不能較好利用[1]。同為傘形科重要蔬菜作物的胡蘿卜，雄性不育材料已得到了很好的利用，育性相關(guān)分子方面的研究也有較多報道。為此，借鑒胡蘿卜雄性不育材料的研究成果，對芹菜育性進行研究，可以為選育芹菜雄性不育材料提供基礎(chǔ)。

通過對胡蘿卜雄性不育性狀的分子標記、線粒體測序及基因克隆等分析表明，atp6基因可能是引起胡蘿卜雄性不育的原因之一[2-4]。其他植物的研究，也同樣表明了atp6基因可能參與了植物雄性不育的形成，如水稻[5-6]、高粱[7]、辣椒[8]和蘿卜[9]等。線粒體atp6基因是編碼ATPase蛋白6的基因，與植物能量代謝相關(guān)。植物線粒體atp6基因的缺陷和突變，將導(dǎo)致植物能量代謝失調(diào)，尤其是在花發(fā)育過程中，很可能導(dǎo)致植物雄性不育。胡蘿卜atp6基因在可育材料與雄性不育材料中，具有明顯的差別。BACH等[2]研究表明，在胡蘿卜雄性不育材料中線粒體atp6基因可閱讀框為744 bp。LRIZZO等[10]公布的可育胡蘿卜線粒體數(shù)據(jù)中，atp6基因可閱讀框長度為1 152 bp，且為單拷貝。在2016年公布的胡蘿卜基因組數(shù)據(jù)中，atp6基因為雙拷貝，可閱讀框長度分別為1 152 bp和744 bp[11]。筆者通過設(shè)計差異引物，對胡蘿卜可育與雄性不育材料研究也表明胡蘿卜存在單雙拷貝的現(xiàn)象[4]。其中可育材料Kuroda為單拷貝，克隆的atp6基因長度為954 bp，野生可育材料Wuye存在2種atp6基因，克隆得到的長度分別為954 bp和819 bp，但Wuye中篩選到的不育材料Wuye-BY，該基因為單拷貝，克隆得到的長度為819 bp。同時還表明較長片段的atp6基因在胡蘿卜花發(fā)育過程中，相對較短的atp6基因表達量變化較大，暗示著長片段的胡蘿卜atp6基因可能參與了胡蘿卜花的發(fā)育及與胡蘿卜育性相關(guān)[4]。

目前，芹菜atp6基因拷貝未見研究報道，芹菜花發(fā)育過程中的表達情況也尚未見研究報道。因此，筆者利用2種可育芹菜六合黃心芹(Q1)和津南實芹(Q2)為研究材料，對2種可育芹菜atp6基因進行克隆與分析。在芹菜atp6基因克隆和序列測定的基礎(chǔ)上，設(shè)計熒光定量檢測引物，對芹菜花發(fā)育過程中atp6基因表達水平進行檢測。通過對芹菜atp6基因與胡蘿卜atp6基因的比較研究，為培育芹菜雄性不育材料提供分子基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

六合黃心芹(Q1)和津南實芹(Q2)均為南京農(nóng)業(yè)大學(xué)傘形科蔬菜作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新實驗室提純和保存。

1.2 培育條件

將2種芹菜種子分別播種于營養(yǎng)缽(20 cm× 40 cm× 50 cm)中，培養(yǎng)土為有機質(zhì)∶蛭石=3∶1。于人工氣候室中種植和培養(yǎng)，溫度為25℃光照/20℃黑暗，光周期為12 h光照/12 h黑暗，光密度為300 μmol/(m2· s)。5葉期時，分別選取2種芹菜幼嫩的葉片，保存于-80℃冰箱中，用于芹菜線粒體DNA的提取。

當(dāng)植株長至12葉期時，將芹菜移到實驗大棚中，讓其低溫春化?；ㄆ跁r，分別取不同發(fā)育時期的花，用錫箔紙包好后于液氮中速凍，保存于-80℃冰箱中，用于提取植物總RNA。

1.3 芹菜線粒體DNA(mtDNA)的提取及鑒定

按照SCOTTI等[12]的方法制備芹菜mtDNA。將2 g的新鮮芹菜葉片放入加有液氮的研磨中，將其磨成粉末。粉末放入20 mL預(yù)冷的勻漿緩沖中[100 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，2.6 mol/L NaCl，50 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA，pH 8.0)，0.4% BSA，在使用前加入0.1%半胱氨酸和56 mmol/L的β-巰基乙醇]，在200 r/min攪拌機中，均勻攪拌20 min。然后，將混合好的勻漿通過尼龍過濾器(100 um)，334 r/min(4℃)離心(eppendorf 5810 R臺式高速冷凍離心機，轉(zhuǎn)子型號：1.5/2.0 mL×30固定角轉(zhuǎn))，去除較大的植物細胞。

上清液1 734 r/min(4℃)分別離心15 min和10 min，去除質(zhì)體；隨后在9 667 r/min(4℃)離心15 min，去除裂解核成分；20 mL冷勻漿緩沖液中再懸浮，9 667 r/min(4℃)離心15 min；使用0.5 mL裂解緩沖液[25 mmol/LTris-HCl(pH 8.0)，20 mmol/L EDTA(pH 8.0)，0.5 % SDS]溶解，蛋白K酶增加到最終濃度為50 μg/mL；然后37℃搖床中輕輕搖動1 h。加入0.1倍體積的2 mol/L醋酸銨，mtDNA與TE(10 mmol/LTris-HCl(pH 8.0)，1 mmol/L EDTA飽和酚/氯仿(50∶50)等體積；mtDNA在2倍體積的100%乙醇沉淀，20℃過夜(14 h)孵育，12 000 r/min離心20 min；最后mtDNA使用30 μL滅菌的ddH2O溶解。

提取的mtDNA用1.2%(v/v)的瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性，使用微量分光光度計Nanodrop ND-1000 spectrophotometer(Nanodrop Technologies Inc.，DE，USA)測量提取的濃度。使用公布的芹菜內(nèi)參基因引物(正向為5′-CTTCCTGCCATATATGATTGG-3′，反向為5′-GCCAGCACCTCGATCTTCATG -3′)[13]，檢測提取的mtDNA是否含有基因組DNA。對提取的芹菜mtDNA進行PCR檢查，程序為94℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 min，54℃退火30 s，72℃延伸1.5 min，35個循環(huán)；72℃延伸10 min后，4℃保存。PCR產(chǎn)物于凝膠電泳上未發(fā)現(xiàn)目的片段，表明提取的mtDNA不含或含有的基因組DNA較低，達到試驗要求。提取的芹菜mtDNA保存于-20℃冰箱中，用于芹菜atp6基因的克隆。

1.4 芹菜atp6基因的克隆與鑒定

利用對胡蘿卜atp6基因的克隆引物(atp6-F1、atp6-F2和atp6-R)[4]，進行芹菜atp6基因的克隆。引物序列atp6-F1：5′-ATGGTTAACAGAAGTCCCGACGA-3′；atp6-F2：5′-ATGAAATTAAAAGTTTTTCTTACGATTAC-3′；atp6-R：5′-TCAATTATAAATAACCACTTCACTTTG-3′。其中，atp6-F1+atp6-R和atp6-F2+atp6-R在胡蘿卜中分別能克隆954 bp和819 bp的基因片段。

PCR采用PCR聚合酶ExTaq(TaKaRa，大連)對目的片段進行克隆?？寺〕绦驗?4℃預(yù)變性4 min；然后按照94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，32個循環(huán);72℃延伸10 min,4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)過1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定正確后，使用Axygen膠回收試劑盒進行目的片段的回收。回收產(chǎn)物連接到pMD19-T載體(TaKaRa，大連)上，使用42℃熱激的方法，將構(gòu)建的克隆載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α。將菌液PCR正確的單菌落，委托通用生物系統(tǒng)有限公司(滁州)測序。

1.5 芹菜atp6進化分析

將克隆得到的芹菜atp6基因，查找可翻譯的閱讀框，并推導(dǎo)成對應(yīng)的氨基酸序列。獲得的芹菜atp6氨基酸序列與胡蘿卜atp6氨基酸序列進行進化分析。使用MEGA6軟件的鄰接方法(Neighbor Joining，NJ)法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，Bootstrap檢驗值設(shè)為1 000[14]。

1.6 芹菜總RNA的提取與cDNA的合成

分別選取2種芹菜未開放(設(shè)為0 d)、開放(設(shè)為5 d)和凋謝(設(shè)為10 d)的花，用錫紙包裹后及時放入液氮中速凍，于-80℃超低溫冰箱中保存。采集的花，使用液氮將其磨成細小的粉末，采用總RNA提取試劑盒(Tiangen，北京)提取總RNA。提取的植物總RNA，分別使用1.2%瓊脂糖凝膠檢測總RNA的完整性，以及使用微量分光光度計Nanodrop ND-100(Nanodrop Technologies Inc.，DE，USA)檢測總RNA的濃度。最后，提取的總RNA使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT Reagent Kit with a DNA Eraser Kit(Perfect Real-Time)(TaKaRa，大連)反轉(zhuǎn)錄成cDNA。反轉(zhuǎn)錄的cDNA用滅菌的ddH2O稀釋15倍后，于-20℃冰箱保存，用于熒光定量PCR分析。

1.7 熒光定量PCR分析

根據(jù)芹菜atp6基因克隆測序結(jié)果，設(shè)計熒光定量引物。正向引物分別采用atp6-F1和atp6-F2，反向引物序列為5′-GAGAGTGAGTAGCATAAACAAAGAGG-3′。采用SYBR PremixExTaq試劑盒(TaKaRa，大連)進行熒光定量PCR。熒光定量PCR為20 μL體系，其中SYBR Premix Ex Taq10 μL，正向/反向引物各0.5 μL，稀釋的模板：2 μL，滅菌的ddH2O 7 μL。使用iQ5 software和iQ5 Real-time PCR System完成熒光定量PCR。以芹菜ACTIN為內(nèi)參基因(正向為5′-CTTCCTGC CATATATGATTGG-3′,反向為5′-GCCAGCAC CTCGATCTTCATG -3′)，與目的基因一起擴增[13]。熒光定量PCR程序：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火30 s，65℃延伸10 s，40個循環(huán)；72℃延伸2 min，4℃保存。相對定量，使用參照基因ΔCT法，表達差異等于2-ΔCT，ΔCT=CT目標基因-CT actin。相對定量是基于處理和對照之間，目標基因?qū)⒖蓟虻谋磉_量的比較[15]。

1.8 數(shù)據(jù)分析

使用Microsoft Excel 2007進行定量數(shù)據(jù)和物質(zhì)含量顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 芹菜atp6基因的分離

胡蘿卜atp6基因不含內(nèi)含子[4, 10-11]，芹菜atp6基因可能也不含內(nèi)含子。為此，使用芹菜mtDNA作為模板克隆芹菜atp6基因。結(jié)果顯示，atp6-F1+atp6-R克隆到的2個芹菜品種atp6基因片段較長(圖1，泳道1～2)，與胡蘿卜954 bp的atp6基因片段長度一致(圖1，泳道3)。atp6-F2+atp6-R克隆到的2個芹菜品種atp6基因長度較短(圖1，泳道4～5)，與胡蘿卜819 bp的atp6基因片段長度一致(圖1，泳道6)。

經(jīng)基因測序表明，芹菜中atp6基因不含內(nèi)含子。其中，atp6-F1+atp6-R克隆到的長片段atp6基因(分別為Q1-L和Q2-L)，長度均為954 bp(圖2)。atp6-F1+atp6-R克隆到的長片段atp6基因(分別為Q1-D和Q2-D)，長度均為819 bp(圖2)，參照公布的胡蘿卜atp6基因序列(AY007817和AY007824)，該長度的atp6基因可閱讀框為744 bp。

注：M，標準分子量；1～2，引物atp6-F1+atp6-R；4～5，引物atp6-F1+atp6-R；1和4，六合黃心芹；2和5，津南實芹；3和6，胡蘿卜2種不同長度的atp6基因長度分別為954和819 bp

Note: M was marker. 1～2, using the primers atp6-F1+atp6-R；4～5, using the primers atp6-F1+atp6-R；1 and 4, Liuhe Huangxin Qin；2 and 5, Jinnan Shiqin；3 and 6, two different lengths of atp6 gene was 954 bp and 819 bp，respectively.

圖1六合黃心芹和津南實芹atp6基因克隆

Fig.1 PCR amplificationatp6 gene from Liuhe Huangxin Qin and Jinnan Shiqin

注：引物atp6-F1用下劃線標注，atp6-F2用方框標注，atp6-R用點標注；箭頭標注為Q1-D和Q2-D參考胡蘿卜atp6基因(登錄號為AY007817.1和AY007824.1)的ORF框起始。

Note: The primers of atp6-F1，atp6-F2and atp6-R were marked by underline, box and dot, respectively. The ORF start of Q1-D and Q2-D were marked by arrow base on carrot’satp6 gene (GenBank：AY007817.1 and AY007824.1).

圖2六合黃心芹和津南實芹線粒體mtDNA克隆的atp6基因

Fig.2 Nucleotide acid sequence alignment ofatp6 genes sequences that cloned from the mtDNA of Liuhe Huangxin Qin and Jinnan Shiqin

2.2 芹菜atp6基因編碼的氨基酸序列

經(jīng)克隆得到芹菜atp6基因推導(dǎo)的氨基酸序列，與TAN等[4]對胡蘿卜atp6氨基酸序列(Wuye-D、Wuye-BY、Kuroda和Wuye-L，其中Wuye-D和Wuye-BY為較短片段，Kuroda和Wuye-L為較長片段，Wuye-BY為野生胡蘿卜雄性不育材料中克隆得到)進行比對顯示，較短的芹菜atp6氨基酸序列(Q1-D和Q2-D)與胡蘿卜較短的atp6氨基酸序列(Wuye-D和Wuye-BY)長度一致；芹菜較長的atp6氨基酸序列(Q1-L和Q2-L)與胡蘿卜較長的atp6氨基酸序列(Kuroda和Wuye-L)長度一致(圖3)。同時，2個品種芹菜atp6氨基酸序列(Q1-D、Q2-D、Q1-L和Q2-L)與胡蘿卜atp6氨基酸序列(Wuye-D、Wuye-BY、Kuroda和Wuye-L)，在3′端高度保守。

圖3 六合黃心芹和津南實芹atp6基因推導(dǎo)的氨基酸序列

2.3 芹菜atp6系統(tǒng)進化樹

經(jīng)對芹菜atp6基因推導(dǎo)的氨基酸序列與胡蘿卜atp6氨基酸進行進化分析表明，2個芹菜品種長片段atp6基因推導(dǎo)的氨基酸(Q1-L和Q2-L)在進化樹上均屬于同一分枝(圖4)。2個芹菜品種短片段atp6基因推導(dǎo)的氨基酸序列(Q1-D和Q2-D)，進化存在一定的距離。進一步分析表明，2種芹菜長片段atp6(Q1-L和Q2-L)與胡蘿卜雄性不育品種atp6基因推導(dǎo)的氨基酸(Wuye-BY、AY007817和AY007824)及可育野生種胡蘿卜材料較短的atp6基因推導(dǎo)的氨基酸(Wuye-D)，進化距離較近；較短的芹菜atp6與可育胡蘿卜品種atp6基因推導(dǎo)的氨基酸序列(JQ248474.1、Wuye-L和Kuroda)進化距離較近。表明胡蘿卜atp6與芹菜atp6之間，可能存在類似的進化關(guān)系。胡蘿卜段片段的atp6可能于胡蘿卜導(dǎo)致胡蘿卜雄性不育，而長片段atp6可能是可育胡蘿卜的特征，暗示著芹菜長片段atp6基因的表達于花發(fā)育相關(guān)。

注(Note):Bootstrap was 1000.

圖4芹菜及胡蘿卜atp6氨基酸的系統(tǒng)進化樹

Fig.4 System phylogenetic tree ofatp6 amino acid sequences between celery and carrot

2.4 芹菜atp6基因在花發(fā)育過程中的表達

分別于芹菜花未開期(0 d，表達量設(shè)為1)、花盛開期(5 d)和花凋謝期(10 d，圖5A)，使用熒光定量PCR對芹菜花發(fā)育的3個階段，進行atp6基因表達量的檢測。結(jié)果表明，六合黃心芹(Q1)和津南實芹(Q2)較長片段的atp6基因(Q1-L和Q2-L)表達量在花盛開期表達量最高，其次為花凋謝期，最低為花未開期；而六合黃心芹(Q1)和津南實芹(Q2)較短片段的atp6基因表達量在芹菜花發(fā)育過程中變化較小(圖5B)。說明，芹菜較長atp6基因片段，可能與芹菜花發(fā)育相關(guān)。

注：A為津南實芹形態(tài)，B為芹菜花atp6基因表達水平。圖B中同一品種的同長短中不同大小寫字母分別表示表示在芹菜發(fā)育過程中有極顯著性(P<0.01)和顯著性(P<0.05)。

Note:A was the morphology of Jinnan Shiqin and B was the expression level ofatp6 gene in celery flower. In the figure B，the different capital and lower case letters of the same length in the same variety represent extremely significant (P< 0.01) and significant (P< 0.05) during the development of celery.

圖5不同發(fā)育階段芹菜的花形態(tài)及atp6基因表達水平

Fig.5 Different stages of floral development and expression levels ofatp6 gene in celery flowers

3 結(jié)論與討論

傘形科蔬菜如胡蘿卜、芫荽和芹菜等，普遍有花較小、花兩性及花發(fā)育不一致等特點，嚴重制約了傘形科蔬菜雜交種的利用和研究進程[16-17]。目前，胡蘿卜雄性不育材料的利用，為胡蘿卜育種提供很大的便利。據(jù)統(tǒng)計[17]，目前歐美等發(fā)達國家大部分采用胡蘿卜雄性不育材料進行育種。芹菜雄性不育材料很少，主要有1986年QUIROS等[18]以及2002年中國于西芹高代自交系發(fā)現(xiàn)的芹菜雄性不育[19]。QUIROS等[18]發(fā)現(xiàn)的芹菜雄性不育材料，由于不育性穩(wěn)定性差，很長時間無法利用到芹菜育種中。中國發(fā)現(xiàn)的芹菜雄性不育材料，已培育出津奇1號和津奇2號等品種[19]。

試驗從六合黃心芹和津南實芹中均能克隆到長短不同的2種atp6基因，且與對應(yīng)的胡蘿卜長度atp6基因長度一致，推導(dǎo)的氨基酸相似度很高?；虮磉_分析表明，長片段atp6基因在芹菜花發(fā)育過程中表達量增加，而短片段atp6基因表達量在花發(fā)育過程中變化不大，該結(jié)果與胡蘿卜研究結(jié)果類似[4]。結(jié)合對胡蘿卜atp6的研究，推測芹菜長片段atp6基因可能與花發(fā)育相關(guān)。同時，也暗示了利用胡蘿卜不育材料的質(zhì)體與芹菜核進行融合，可能培育出芹菜雄性不育材料。

利用細胞融合技術(shù)將不育材料與可育材料進行融合，已培育出很多農(nóng)作物雄性不育材料。SAKAI和IMAMURA[20]通過細胞融合技術(shù)將蘿卜不育的質(zhì)體轉(zhuǎn)移到油菜中，獲得了不育系油菜品系。侯喜林等[21]利用非對稱細胞融合技術(shù)獲得的不結(jié)球白菜胞質(zhì)雄性不育系。KANG等[22]通過將細胞融合技術(shù)獲得了一種新型的細胞雄性不育油菜(INAP CMS)。在培育芹菜雄性不育材料中，譚芳等[23]初步研究了芹菜與CMS胡蘿卜原生質(zhì)體非對稱性融合，成功將瓣化型雄性不育基因轉(zhuǎn)移到芹菜中。為此，利用筆者之前獲得的野生胡蘿卜雄性不育材料線粒體atp6基因與芹菜atp6基因長度和拷貝數(shù)的差異，為利用細胞融合技術(shù)培育芹菜雄性不育材料提供了分子依據(jù)。