高效液相色譜法測定木姜葉柯中根皮苷、三葉苷和根皮素的含量

王 鈺，王 磊，張東星，李赫宇，晏仁義

(天津益倍生物科技集團(tuán)有限公司 天津300457)

木姜葉柯(LithocarpusploystachyusRehd)，別名多穗柯、湖南甜茶、野金柴等，是我國傳統(tǒng)民間草藥和保健飲料植物，以葉入藥，對高血壓及冠心病有療效[1]。據(jù)《中華中藥志》記載：多穗柯茶能防治高血壓，治療濕熱痢疾、皮膚瘙癢、癰疽惡瘡等癥，并具有滋養(yǎng)肝腎、和胃降逆、潤肺止咳、解困醒酒等作用。

2017年 6月，木姜葉柯被批準(zhǔn)為我國的新食品原料，化學(xué)成分主要是黃酮類物質(zhì)，其中根皮苷常被作為木姜葉柯質(zhì)量評價的成分指標(biāo)。楊大堅等[2]從木姜葉柯的乙醇提取物中分離得到除根皮苷外，還有含量較高的成分三葉苷。文獻(xiàn)報道木姜葉柯三葉苷對α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶有明顯抑制作用，且具有較強的抗氧化能力，是一種有應(yīng)用潛力的抗糖尿病活性物質(zhì)[3]。因此三葉苷也是木姜葉柯的有效成分之一，經(jīng)測定木姜葉柯中三葉苷的含量比根皮苷高出很多。本文為了更好地評價木姜葉柯藥材質(zhì)量，以 11批木姜葉柯樣品為研究對象，以三葉苷、根皮苷和根皮素3個成分的含量作為評價指標(biāo)。

1 檢測儀器與樣品

島津 LC-2030C 3D高效液相色譜系統(tǒng)，包括洗脫泵、自動進(jìn)樣器、柱溫箱和 PDA檢測器(日本島津公司)，KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，MS105DU型1/10萬電子天平(瑞士梅特勒-托利多有限公司)，TDZ4-WS臺式低速離心機(湖南賽特湘儀離心機儀器有限公司)。

根皮苷、根皮素(純度大于 98%)對照品購自中國食品藥品檢定研究院。三葉苷(純度大于 98%)對照品為成都曼思特生物科技有限公司與中國科學(xué)院成都生物研究所聯(lián)合制得。乙腈、甲酸均為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。共從產(chǎn)地采集木姜葉柯葉樣品11份。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱 Inertail ODS-3 C18(250mm×4.6mm，5μm)；流動相乙腈(A)-0.04%甲酸(B)梯度洗脫(表 1)；流速 0.8mL/min；柱溫 40℃；檢測波長285nm。在上述色譜條件下，樣品中三葉苷、根皮苷和根皮素的色譜峰能達(dá)到較好的分離，且純度檢查符合要求，樣品其他成分的測定無干擾，如圖1。

圖1 對照品和木姜葉柯樣品的高效液相色譜圖Fig.1 High performance liquid chromatography of references and sample

表1 流動相梯度洗脫數(shù)據(jù)(%)Tab.1 Gradient elution of mobile phase(%)

2.2 對照品溶液制備

精密稱取真空至恒質(zhì)量的根皮苷、三葉苷、根皮素5.00mg置于10mL容量瓶中，加70%乙醇溶解并定容，搖勻，用0.22μm微孔濾膜過濾，取濾液供測試。

2.3 供試品溶液制備

將多穗柯葉干燥、粉碎、研磨，過4號篩備用。精確稱取多穗柯樣品 0.25g，置于 25mL容量瓶中，加入適量 70%乙醇，超聲處理(100W，40kHz)30min，取出、放冷、定容、搖勻、離心，取上清液 1mL定容于 10mL 70%乙醇中，搖勻，用 0.22μm 微孔濾膜過濾，取濾液供測試。

2.4 線性關(guān)系考察

精確稱取根皮苷、三葉苷、根皮素對照品各5mg，置于 10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，即得標(biāo)準(zhǔn)品母液。精密吸取標(biāo)準(zhǔn)品母液按照 1、2.5、5、10、20、40、50 倍數(shù)進(jìn)行稀釋，得系列質(zhì)量濃度溶液，取各個濃度的對照品溶液各 5μL注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件測定峰面積。以進(jìn)樣量X(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積值 Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程和相關(guān)系數(shù)。同法逐級稀釋，分別以信噪比S/N＝3和S/N＝10的進(jìn)樣濃度確定檢測限和定量限，結(jié)果見表2。

2.5 精密度試驗

精密吸取對照品混合溶液 5μL，按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣 6次，測定峰面積值。記錄峰面積，計算峰面積的 RSD。結(jié)果顯示根皮苷、三葉苷、根皮素峰面積的RSD分別為0.30%、0.37%、0.29%，表明儀器精密度良好。

表2 標(biāo)準(zhǔn)品的線性關(guān)系和范圍Tab.2 Linear relationship and range of references

2.6 穩(wěn)定性試驗

取供試品溶液，分別于配制后 0、2、4、8、12、24h進(jìn)樣，記錄根皮苷、三葉苷和根皮素的峰面積值，計算峰面積 RSD。結(jié)果顯示，根皮苷、三葉苷和根皮素峰面積的RSD分別為0.94%、0.56%、1.49%，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗

精密稱取同一份樣品約 250mg，共 6份，按照2.3項下方法制備供試品溶液并進(jìn)樣、測定峰面積、計算含量。結(jié)果 6份樣品中，根皮苷、三葉苷和根皮素的RSD分別為1.86%、1.1%和1.05%，表明此方法的重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收試驗

精密稱取已知含量的樣品0.125g，共6份，分別加入一定量對照品，按 2.1項下色譜條件進(jìn)行測定，計算回收率，結(jié)果見表3。

2.9 樣品的含量測定

取各藥材粉末，按2.3項下的方法操作制備供試品溶液，每個樣品平行 2份，并按 2.1項下的色譜條件進(jìn)行測定，計算各供試品中 3種成分的含量，結(jié)果見表4。

表3 根皮苷、三葉苷和根皮素的加樣回收率Tab.3 Results on recovery rate of phlorizin，trilobatin and phloretin

表4 根皮苷、三葉苷和根皮素的含量(%)Tab.4 Contents of phlorizin，trilobatin and phloretin in samples(%)

3 討論和結(jié)論

本研究建立了通過 HPLC測定木姜葉柯中三葉苷、根皮苷和根皮素3種成分含量的方法，能將3種成分很好分離，經(jīng)過方法學(xué)驗證，證實該方法簡便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好?？朔艘恍┪墨I(xiàn)報道方法的缺點，比如張毅等[3]用高效液相法檢測從多穗柯中分離純化出的三葉苷，色譜條件 C18(150mm×4.6mm，5μm)，洗脫條件甲醇∶水＝60∶40，檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)：三葉苷色譜峰的保留時間與根皮苷一致，經(jīng)核磁共振波譜分析后證實三葉苷與根皮苷互為同分異構(gòu)體。陳文等[4]用高效液相法測試木姜葉柯水提物中根皮苷的含量，色譜條件 C18(150mm×4.6mm，5μm)，洗脫條件甲醇∶水＝47∶53，檢測結(jié)果根皮苷含量高達(dá) 92.8%，推測根皮苷與三葉苷的色譜峰未能分離。蔣珍藕等[5]研究紫外分光光度計測定木姜葉柯總黃酮的方法，發(fā)現(xiàn)蘆丁是黃酮醇類的化合物，而木姜葉柯中的總黃酮成分是二氫查爾酮，兩者在結(jié)構(gòu)上存在較大的差異，所以用經(jīng)典方法以蘆丁為對照品，通過絡(luò)合比色法測定木姜葉柯總黃酮的結(jié)果并不理想。之后，采用以根皮苷為對照品，采用直接紫外測定法測定總黃酮，結(jié)果比較可靠。

采用本文建立的方法對 11批樣品進(jìn)行了測定。本實驗中，以 4～8月份的木姜葉柯為材料，測定三葉苷、根皮苷和根皮素的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，根皮苷從4～8月份含量大幅度增加(0.74%～6.26%)。三葉苷從4～6月份的含量大幅度降低(17.14%～0.66%)，之后含量變化不明顯(0.20%～0.67%)。根皮素4月份到6月份的含量小幅度降低(0.42%～0.22%)，7月份和8月份樣本檢測不到根皮素。整體而言，木姜葉柯中根皮苷、三葉苷和根皮素含量變化具有一定規(guī)律性：隨著月份增加根皮苷含量增加，三葉苷含量降低，根皮素含量逐漸降低至沒有。說明木姜葉柯在整個生長周期中，有效成分會發(fā)生轉(zhuǎn)變，其發(fā)生機理有待于進(jìn)一步深入研究，為提高木姜葉柯有效活性成分的含量提供有力的依據(jù)。