體外低濃度過氧化氫對人黑素細(xì)胞自噬水平的影響及自噬相關(guān)lncRNA的篩選

石家綺 李雪 孫利 趙文娥 丁書紅 侯曉媛 修艷燕 魯嚴(yán)

1南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科 210029；2南京醫(yī)科大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院皮膚科210004；3南京醫(yī)科大學(xué)分析測試中心電鏡室 210000

白癜風(fēng)是一種后天性皮膚色素脫失性疾病，特點為表皮及毛囊中黑素細(xì)胞大量喪失[1]。研究[2]表明，白癜風(fēng)患者存在表皮內(nèi)以及系統(tǒng)性H2O2水平增高的現(xiàn)象，正常人體內(nèi)細(xì)胞信號傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄需要約10-6mol/L 濃度的H2O2，而白癜風(fēng)患者表皮H2O2濃度則高達(dá)10-3mol/L。Yao 等[3]提出，白癜風(fēng)患者在發(fā)病初期表皮內(nèi)H2O2可呈低濃度，雖不足以殺死黑素細(xì)胞，但會影響細(xì)胞功能，進(jìn)而引發(fā)炎癥及自身免疫反應(yīng)。2003年，Gauthier等[4]提出了“黑素細(xì)胞經(jīng)表皮脫失理論”，即白癜風(fēng)中黑素細(xì)胞的丟失可能是黑素細(xì)胞固有的黏附缺陷和外在機(jī)械性損傷等所致。Benzekri 等[5]發(fā)現(xiàn)，白癜風(fēng)患者存在表皮黑素細(xì)胞與周圍角質(zhì)形成細(xì)胞間的黏附障礙，并且部分角質(zhì)形成細(xì)胞損傷及功能障礙會促進(jìn)受到機(jī)械性損傷或氧化應(yīng)激的黑素細(xì)胞脫失。我們在前期研究中已成功用400 μmol/L H2O2誘導(dǎo)黑素細(xì)胞提前衰老[6]。在此基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步探討提前衰老的黑素細(xì)胞黏附功能及自噬水平的變化，并通過基因芯片篩選正常黑素細(xì)胞及提前衰老的黑素細(xì)胞中差異表達(dá)的自噬相關(guān)長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA），預(yù)測其可能的作用機(jī)制。

材料和方法

一、主要試劑及儀器

Ham F12培養(yǎng)基、胎牛血清（美國Gibco公司），Dispase酶（德國Roche公司），胰蛋白酶、青霉素-鏈霉素溶液、CCK8試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），抗氧化劑N-乙?；?L-半胱氨酸（NAC）、遺傳霉素（G418）（美國Sigma 公司），H2O2溶液（南京化學(xué)試劑有限公司），TRIzol（美國Invitrogen公司），兔抗人E-鈣黏素抗體、兔抗人β肌動蛋白抗體、兔抗人微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）抗 體（ 美 國 Cell Signaling Technology 公司），兔抗人SQSTM1/p62 抗體（英國Abcam 公司），山羊抗兔IgG 二抗（南京巴傲德生物科技有限公司），QIAGEN RNA 提取試劑盒、第一鏈緩沖液、PCR反應(yīng)試劑（上海艾博思生物科技有限公司），流式細(xì)胞儀（美國Beckman Coulter有限公司）。

二、黑素細(xì)胞培養(yǎng)及實驗分組

標(biāo)本來自南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科健康男性包皮環(huán)切術(shù)后獲得的皮膚組織，已征得患者知情同意，并經(jīng)南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)同意（倫理審批號：2018-SRFA-056）。聚維酮碘浸泡包皮后，去除皮下組織，用0.25% DispaseⅡ在37 ℃下消化4 h 后行真表皮分離。表皮剪碎后胰酶消化、篩網(wǎng)過濾、離心后獲得單細(xì)胞懸液，接種于含10%胎牛血清的F12 培養(yǎng)基，于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。然后，換液去除未貼壁細(xì)胞，并在培養(yǎng)基中加入100 mg/L G418 抑制成纖維細(xì)胞的生長。2 d 后換不含G418的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。細(xì)胞90%融合時，采用胰酶差別消化，培養(yǎng)瓶中加入胰酶在37 ℃培養(yǎng)箱中消化3 min，使黑素細(xì)胞脫離培養(yǎng)瓶壁，角質(zhì)形成細(xì)胞仍緊密黏附于培養(yǎng)瓶壁，從而分離黑素細(xì)胞與角質(zhì)形成細(xì)胞。黑素細(xì)胞液離心后用培養(yǎng)基重懸，繼續(xù)傳代培養(yǎng)。

本課題組前期實驗已證實，400 μmol/L H2O2可誘導(dǎo)黑素細(xì)胞提前衰老[6]，本研究也選擇該濃度處理黑素細(xì)胞。取對數(shù)生長期黑素細(xì)胞，分為3 組：①對照組，無H2O2處理；②H2O2組，400 μmol/L H2O2處理，每天更換 H2O2溶液 1 次；③H2O2+ NAC 組：4 mmol/L NAC預(yù)處理細(xì)胞2 h，然后加入400 μmol/L H2O2處理，每天更換NAC和H2O2溶液1次。處理5 d后，進(jìn)行以下實驗，每組實驗均重復(fù)3次。

三、共聚焦顯微鏡觀察H2O2處理后黑素細(xì)胞E-鈣黏素、LC3及p62表達(dá)

各組黑素細(xì)胞處理5 d 后，用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌3 次去除培養(yǎng)基。室溫下4%多聚甲醛固定20 min，0.2%Triton X-100細(xì)胞破膜10 min，山羊抗兔血清封閉1 h，相應(yīng)抗體（E-鈣黏素抗體、LC3 抗體、p62 抗體的稀釋比例或濃度分別為1∶200、1∶100、1 μg/ml）4 ℃孵育過夜。PBS洗滌3次，室溫下避光孵育山羊抗兔IgG 二抗1 h，DAPI 熒光染料染核5 min，PBS 清洗3 次，共聚焦顯微鏡下觀察并攝片。

四、透射電鏡觀察黑素細(xì)胞自噬小體

收集各組黑素細(xì)胞，離心獲得細(xì)胞沉淀，加入預(yù)冷的2.5%戊二醛，4 ℃固定過夜，后PBS 洗滌3 次，1%鋨酸固定2 h，PBS 洗滌3 次。使用梯度乙醇（50%、70%、80%、90%）各1次脫水，每次15 min，純丙酮2次脫水，每次15 min。純丙酮+包埋液（1∶1）中室溫浸透過夜，切片機(jī)切成80 nm 超薄切片，3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色，透射電鏡觀察并攝片。

五、Western印跡法檢測LC3、p62蛋白表達(dá)

預(yù)冷PBS洗滌各組細(xì)胞3次，于冰上提取總蛋白，4 ℃離心機(jī)離心后吸去上清，加入5×上樣緩沖液混勻后煮沸變性。蛋白經(jīng)12%或10% SDSPAGE 聚丙烯酰胺凝膠電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。5%的脫脂奶粉封閉PVDF膜2 h，TBST緩沖液洗滌3次后，按抗體說明書稀釋一抗（LC3、p62稀釋比例分別為1∶1 000、1∶10 000），4 ℃孵育過夜，二抗（1∶10 000 稀釋）室溫?fù)u床孵育1 h，經(jīng)化學(xué)發(fā)光法顯色。用ImageJ軟件分析圖片，計算E-鈣黏素、p62 與β 肌動蛋白的灰度比值及LC3-Ⅰ與LC3-Ⅱ的灰度比值。

六、基因芯片分析

TRIzol 提取各組細(xì)胞總RNA，使用QIAGEN RNeasy?試劑盒純化總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA，進(jìn)一步合成熒光探針Cy3 標(biāo)記的cRNA，用QIAGEN RNeasy?微量試劑盒純化cRNA 并測定其濃度。cRNA 片段化后加入雜交緩沖液，混勻后滴加于芯片上滾動雜交過夜。雜交完成后洗滌芯片并用Agilent G2505C 掃描儀（美國Agilent Technologies 公司）掃描得到原始圖像，并用Feature Extraction 軟件提取原始數(shù)據(jù)。Genespring軟件用來進(jìn)行分位數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化及后續(xù)處理，miRNA靶基因預(yù)測軟件TargetScan 對數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，預(yù)測RNA的下游作用靶點。

七、統(tǒng)計學(xué)處理

使用Graphpad Prism 6軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料采用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，并用Tukey 檢驗進(jìn)行兩兩間的多重比較，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、H2O2處理對黑素細(xì)胞中E-鈣黏素表達(dá)的影響

圖1 共聚焦顯微鏡觀察H2O2處理黑素細(xì)胞后E-鈣黏素的表達(dá)情況（×200） 對照組黑素細(xì)胞周圍可見連續(xù)明亮綠色熒光，H2O2+NAC組熒光稍暗于對照組，H2O2組可見微弱熒光

共聚焦顯微鏡下可見對照組黑素細(xì)胞膜周圍分布E-鈣黏素的明亮綠色熒光，H2O2+NAC 組熒光稍暗于對照組，H2O2組熒光微弱，見圖1。3組黑素細(xì)胞E-鈣黏素?zé)晒鈴?qiáng)度比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=19.350，P＜ 0.01）；兩兩多重比較顯示，H2O2組熒光強(qiáng)度（4.876 ± 0.165）顯著低于對照組（16.840 ± 2.335，q=8.686，P＜ 0.01）及H2O2+NAC組（12.530 ± 0.467，q= 5.554，P＜ 0.01），對照組與H2O2+NAC組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（q=3.132，P＞0.05）。

二、透射電鏡下觀察H2O2處理后黑素細(xì)胞中自噬小體

對照組黑素細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)大部分線粒體嵴排列尚整齊，可見數(shù)個自噬小體及電子密度高的黑素小體。H2O2組黑素細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)空泡明顯增多，大部分線粒體見嵴斷裂模糊，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，胞質(zhì)內(nèi)黑色素顆粒較少，未見明顯自噬小體。H2O2+NAC組黑素細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)線粒體嵴排列尚整齊，部分空泡，可見數(shù)個自噬小體。見圖2。

三、H2O2處理降低黑素細(xì)胞自噬水平

共聚焦顯微鏡下，對照組及H2O2+ NAC 組的黑素細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)可見多個明亮的LC3點狀熒光，而H2O2組黑素細(xì)胞內(nèi)則未見LC3 點狀熒光，見圖3。相反，與對照組及H2O2+ NAC 組相比，H2O2組中p62熒光增多，見圖4。Western印跡結(jié)果顯示，3組黑素細(xì)胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ值及p62/β 肌動蛋白值差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（F= 15.39、7.227，均P＜0.05）。兩兩多重比較顯示，H2O2組黑素細(xì)胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ值（0.604±0.012）顯著低于對照組（1.200±0.081，q=7.718，P＜ 0.01）及H2O2+NAC組（1.017 ±0.062，q=5.076，P＜ 0.05），同時其p62/β 肌動蛋白值（0.881±0.079）顯著高于對照組（0.456±0.121，q= 4.847，P＜ 0.05）及 H2O2+ NAC 組（0.492 ±0.049，q=4.439，P＜ 0.05）。見圖5。H2O2+NAC組與對照組的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ值及p62/β 肌動蛋白值差異無統(tǒng)計學(xué)意義（q=2.642和0.407，均P＞ 0.05）。

圖2 透射電鏡觀察H2O2處理對黑素細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響 2A（×30 000）：對照組，黑素細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)大部分線粒體嵴排列尚整齊，可見數(shù)個自噬小體及電子密度高的黑素小體；2B（×25 000）：H2O2組，黑素細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)空泡明顯增多，大部分線粒體見嵴斷裂模糊，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，胞質(zhì)內(nèi)黑色素顆粒較少，未見明顯自噬小體；2C（×25 000）：H2O2+NAC組，黑素細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)線粒體嵴排列尚整齊，部分空泡，可見數(shù)個自噬小體圖中箭頭標(biāo)注為細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)自噬體

圖3 共聚焦顯微鏡觀察H2O2處理后黑素細(xì)胞微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（LC3）表達(dá)情況（×400） 對照組及H2O2+NAC組的黑素細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)可見多個明亮的LC3點狀熒光，而H2O2組黑素細(xì)胞內(nèi)未見明顯LC3點狀熒光

圖4 共聚焦顯微鏡觀察H2O2處理后黑素細(xì)胞內(nèi)p62表達(dá)情況（×400） 與對照組及H2O2+NAC組相比，H2O2組黑素細(xì)胞內(nèi)p62點狀熒光增多

四、基因芯片數(shù)據(jù)分析

通過生物信息學(xué)分析，從lncRNA 芯片結(jié)果中篩選出18 個差異表達(dá)的、且與黑素細(xì)胞提前衰老有關(guān)的自噬相關(guān)lncRNA，其中表達(dá)上調(diào)的lncRNA有11個，表達(dá)下調(diào)的有7個。進(jìn)一步篩選出在提前衰老的黑素細(xì)胞中表達(dá)明顯上調(diào)的自噬相關(guān)lncRNA NONHSAT190308.1（差異 ＞ 10 倍），見圖6。靶基因預(yù)測軟件TargetScan 預(yù)測其可與miRNA hsa-miR-361-3p 靶向結(jié)合，hsa-miR-361-3p 又靶向CDKN1A，CDKN1A即衰老相關(guān)蛋白p21。

討 論

圖5 Western 印跡法檢測各處理組p62 及微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3（LC3）表達(dá) 1：對照組；2：H2O2組；3：H2O2+NAC組

圖6 基因芯片數(shù)據(jù)分析篩選差異表達(dá)的自噬相關(guān)長鏈非編碼RNA（lncRNA） 生物信息學(xué)分析篩選出262 個自噬相關(guān)lncRNA（差異 ＞ 2倍，P ＜ 0.05），其中有18個lncRNA與黑素細(xì)胞提前衰老有關(guān)

越來越多的研究[2，7-9]表明，由 H2O2引起的氧化應(yīng)激是白癜風(fēng)發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素之一，細(xì)胞氧化還原平衡失調(diào)可能是白癜風(fēng)的致病機(jī)制。Bellei等[10]提出，氧化應(yīng)激可導(dǎo)致黑素細(xì)胞提前衰老，并在細(xì)胞和分子水平上表現(xiàn)出和退行性疾病相同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的改變，包括脂質(zhì)代謝的改變、線粒體呼吸鏈的損傷、細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)的功能障礙。“黑素細(xì)胞經(jīng)表皮脫失理論”提出后便受到了廣泛關(guān)注，該理論認(rèn)為黑素細(xì)胞受損導(dǎo)致的黏附缺陷以及受到的外在機(jī)械損傷會導(dǎo)致其與角質(zhì)形成細(xì)胞黏附受損，進(jìn)而從表皮脫失，其本質(zhì)與氧化應(yīng)激密切相關(guān)[4]。我們前期通過電鏡觀察到白癜風(fēng)患者皮損邊緣黑素細(xì)胞樹突縮短，部分黑素細(xì)胞甚至沒有樹突，致使其與周圍角質(zhì)形成細(xì)胞連接松散，從超微結(jié)構(gòu)驗證了黑素細(xì)胞經(jīng)表皮脫失理論[11]。黑素細(xì)胞與角質(zhì)形成細(xì)胞間的直接接觸是黑素小體轉(zhuǎn)運所必須的條件，E-鈣黏素作為介導(dǎo)黑素細(xì)胞與角質(zhì)形成細(xì)胞間黏附的主要介質(zhì)，存在于整個細(xì)胞表面；在氧化應(yīng)激狀態(tài)下可在黑素細(xì)胞膜內(nèi)呈不連續(xù)或不均勻分布或丟失，這種分布的改變先于白癜風(fēng)皮損的發(fā)生，是白癜風(fēng)發(fā)病機(jī)制中的早期事件[12]。前期實驗[6]中我們已經(jīng)從蛋白水平證實，H2O2處理后黑素細(xì)胞E-鈣黏素表達(dá)較對照組顯著下降。在本研究中，我們運用免疫熒光檢測H2O2處理前后E-鈣黏素的變化，發(fā)現(xiàn)與對照組細(xì)胞周圍明亮的綠色熒光相比，H2O2組黑素細(xì)胞周圍E-鈣黏素?zé)晒鈴?qiáng)度顯著減弱，而H2O2+NAC 組細(xì)胞E-鈣黏素?zé)晒鈴?qiáng)度未有明顯減弱。以上結(jié)果表明，H2O2誘導(dǎo)的提前衰老的黑素細(xì)胞存在黏附缺陷，與周圍角質(zhì)形成細(xì)胞黏附減弱，易經(jīng)表皮脫失而發(fā)生白斑。

自噬是溶酶體降解過程，可以清除細(xì)胞內(nèi)受損的細(xì)胞器和錯誤折疊的蛋白質(zhì)，維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，促進(jìn)細(xì)胞生長[13]。自噬的激活可以抑制由應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老和延緩衰老，而自噬水平的降低或抑制則與衰老和提前衰老有關(guān)[14]。氧化應(yīng)激環(huán)境可破壞細(xì)胞線粒體功能，線粒體是體內(nèi)活性氧的主要來源場所，線粒體受損可促進(jìn)活性氧的過度生成[15]，進(jìn)而加速細(xì)胞衰老。本研究發(fā)現(xiàn)，H2O2組黑素細(xì)胞內(nèi)線粒體數(shù)量減少，明顯腫脹，嵴排列紊亂，而加入NAC 作為抗氧化劑的處理組大部分線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)仍基本正常，僅存在微弱的線粒體損傷，證明氧化應(yīng)激環(huán)境可使細(xì)胞線粒體出現(xiàn)形態(tài)異常，而形態(tài)異常則是線粒體功能受損的主要表現(xiàn)。線粒體受損后，則需要啟動自噬過程來清除受損線粒體，自噬水平下降則會使損傷細(xì)胞器積聚，影響細(xì)胞功能。電鏡下，與對照組相比，H2O2組黑素細(xì)胞內(nèi)線粒體腫脹伴嵴斷裂，未見明顯的自噬體，與白癜風(fēng)患者皮損邊緣黑素細(xì)胞超微電鏡觀察結(jié)果基本一致[16]。蛋白水平上亦證實H2O2組黑素細(xì)胞LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ轉(zhuǎn)化減少，同時p62 表達(dá)增加，而H2O2+NAC 組黑素細(xì)胞內(nèi)可見較多自噬小體，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值高于H2O2組，表明抗氧化干預(yù)可緩解氧化應(yīng)激對黑素細(xì)胞造成的自噬損傷。

2011年有學(xué)者提出了競爭性內(nèi)源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）假說[17]，即miRNAs 可通過序列互補(bǔ)與靶基因的miRNA 反應(yīng)元件（miRNA response elements，MREs）互補(bǔ)結(jié)合，導(dǎo)致靶基因mRNA的降解或阻止靶基因的翻譯，起到負(fù)性調(diào)節(jié)的作用。lncRNA 可作為一種ceRNA，通過“海綿”吸附的方式吸附miRNA，減弱miRNA對靶基因 mRNAs 的“沉默效應(yīng)”，從而對 miRNA 的靶基因mRNAs 進(jìn)行調(diào)控。本課題組前期實驗[6]已證實，400 μmol/L H2O2可誘導(dǎo)黑素細(xì)胞提前衰老，且衰老相關(guān)蛋白p21、p53 表達(dá)增高。根據(jù)基因芯片結(jié)果及預(yù)測軟件預(yù)測hsa-miR-361-3p 靶向CDKN1A（又被稱為p21），我們預(yù)測自噬相關(guān)lncRNA NONHSAT190308.1 可能通過 MRE 競爭結(jié)合hsa-miR-361-3p，降低hsa-miR-361-3p的水平，減弱其對靶基因p21的“沉默效應(yīng)”，從而可能使衰老相關(guān)蛋白p21的表達(dá)增多。

綜合本研究結(jié)果和前期研究結(jié)果我們推測，氧化應(yīng)激可使黑素細(xì)胞自噬水平顯著下降，難以清除氧化應(yīng)激壓力下受損的細(xì)胞器，進(jìn)而導(dǎo)致黑素細(xì)胞提前衰老，細(xì)胞樹突縮短，與角質(zhì)形成細(xì)胞連接疏松，傳遞黑素小體功能受損，黏附能力減弱，最終經(jīng)表皮脫失。如能證實并明確自噬相關(guān)lncRNA NONHSAT190308.1在黑素細(xì)胞提前衰老中作用機(jī)制，則可通過降低衰老相關(guān)蛋白的表達(dá)，延緩黑素細(xì)胞在氧化應(yīng)激環(huán)境下的提前衰老進(jìn)程，維持黑素細(xì)胞黏附能力，進(jìn)而減少黑素細(xì)胞經(jīng)表皮脫失，調(diào)控白癜風(fēng)的發(fā)生和發(fā)展。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突