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    TSC1轉(zhuǎn)基因敲除小鼠動(dòng)物模型的構(gòu)建及敲除效果的初步研究

    2019-08-02 08:40:16許振凱王威平白曉春1
    關(guān)鍵詞:純合子成骨細(xì)胞骨骼

    王 紅,蔣 莉,王 巖,許振凱,王威平,方 航, 孫 鵬,白曉春1,2,3,*

    (1.南方醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院,廣東 廣州510630;2.廣東省骨科研究院,廣東 廣州510630;3.廣東省骨科醫(yī)院,廣東 廣州510630;4.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 急診科,吉林 長(zhǎng)春130021;5.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院科學(xué)研究中心,吉林 長(zhǎng)春130033;6.南方醫(yī)科大學(xué),廣東 廣州510515;7.中山大學(xué)腫瘤防治中心麻醉科,廣東 廣州510060;8.華南腫瘤學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室廣東 廣州510060;9.腫瘤醫(yī)學(xué)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心,廣東 廣州510060)

    結(jié)節(jié)性硬化復(fù)合物1(Tuberous sclerosis complex1,TSC1),是人類的一種抑癌基因,與哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(The mammalian target of rapamycin,mTOR)有著密切的聯(lián)系。目前研究發(fā)現(xiàn),mTOR能整合細(xì)胞內(nèi)外各種信號(hào),是機(jī)體與細(xì)胞感受營(yíng)養(yǎng)的信號(hào)通路[1]。TSC1位于mTOR信號(hào)通路的上游,對(duì)mTOR有一定抑制作用。既往研究主要集中mTOR信號(hào)通路對(duì)心腦疾病及腫瘤發(fā)病機(jī)制的探討,而近期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)mTOR信號(hào)通路在骨骼發(fā)育過(guò)程中發(fā)生變化[2,3],但機(jī)制仍未闡明。骨骼發(fā)育過(guò)程中,肢芽干細(xì)胞、軟骨細(xì)胞及成骨細(xì)胞是其主要構(gòu)成部分,闡明3者與mTOR信號(hào)通路的關(guān)系,將為骨骼發(fā)育提供新視野。

    本研究擬構(gòu)建肢芽干細(xì)胞特異性TSC1敲除小鼠(Prx-1-Cre;TSC1flox/flox)、軟骨細(xì)胞特異性TSC1敲除小鼠(Col2a1-Cre;TSC1flox/flox)、成骨細(xì)胞特異性TSC1敲除小鼠(Osx-Cre;TSC1flox/flox),為進(jìn)一步研究mTOR信號(hào)通路調(diào)控骨骼發(fā)育的機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:TSC1-loxP小鼠(品系號(hào):005680)、Prx-1-Cre小鼠(品系號(hào):006361)和Osx-Cre小鼠(品系號(hào):006361)均購(gòu)自美國(guó)的The Jackson Laboratory。不可誘導(dǎo)Col2a1-Cre小鼠(品系號(hào):003554)為軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院贈(zèng)與。用于保種繁殖和階段性年齡相關(guān)的野生型黑背景C57BL/6小鼠,均購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。主要材料:瓊脂果糖、GelRed等。

    1.2 方法

    1.2.1小鼠繁殖與分組 在SPF級(jí)動(dòng)物飼養(yǎng)室繁殖小鼠,溫度控制在25°左右,濕度保持70%左右。首先利用不可誘導(dǎo)Col2a1-Cre小鼠和TSC1-loxP小鼠交配,繁殖出攜帶有雜合Col2a1-Cre和雜合TSC1-loxP位點(diǎn)的小鼠,基因型為TSC1flox/-Col2a1-Cre的F1代小鼠。待小鼠成年后,繼續(xù)與TSC1-loxP小鼠交配,繁殖出雜合Col2a1-Cre和純合TSC1-loxP位點(diǎn)的小鼠,基因型為帶Col2a1-Cre的TSC1flox/flox的F2代純合子小鼠,此為軟骨細(xì)胞特異性敲除TSC1轉(zhuǎn)基因小鼠(Col2a1-Cre;TSC1flox/flox)。 同窩帶Col2a1-Cre的TSC1flox/flox小鼠分組為Col2a1-TSC1 CKO組,正常的小鼠(如Col2a1-Cre;TSC1flox/-,TSC1flox/flox)分組為正常組(Con組)。

    用以上的繁殖方法可獲得帶Prx-1-Cre的TSC1flox/flox純合子小鼠、帶Osx-Cre的TSC1flox/flox純合子小鼠,并分組為Prx-1-TSC1 CKO組、Osx-TSC1 CKO組。

    小鼠基因型鑒定引物序列:

    Prx-1-Cre primer forward:5′-TCCAATTTACTGACCGTACACCAA-3′

    Prx-1-Cre primer forward:5′-CCTGATCCTGGCAATTCGGCTA-3′

    Col2a1-Cre primer forward:5′-GCATCGACCGGTAATGCAGGC-3′

    Col2a1-Cre primer reverse:5′-GAGGGTCCAGCCCGAGCTACTT-3′

    Osx-Cre primer forward:5′-CTCTTCATGAGGAGGACCCT-3′

    怎么會(huì)是這樣呢?紫云一臉錯(cuò)愕,掩面沖出辦公室,跟呆立在門外的水仙芝撞了一個(gè)滿懷。兩人先是一驚,不覺同時(shí)笑起來(lái)了。

    Osx-Cre primer reverse:5′-GCCAGGCAGGTGCCTGGACAT-3′

    TSC1 loxP primer up:5′-GTC ACG ACC GTA GGA GAA GC-3′

    TSC1 loxP primer down:5′-GAA TCA ACC CCA CAG AGC AT-3′

    反應(yīng)體系的配置如下:

    2×PCR mix10 μl上游引物 02 μl下游引物02 μl超純水02 μlDNA模板04 μl總體積20 μl

    PCR反應(yīng)程序:

    Col2a1-Cre程序:①94℃ 3 min;②94℃ 40sec;③ 65℃ 40sec;④72℃ 1 min;⑤72℃ 2 min;⑥10℃ hold。②到④為循環(huán)反應(yīng),循環(huán)數(shù)為37

    TSC1 loxP程序:①94℃ 3 min;②94℃ 40sec;③65℃ 1 min;④72℃ 1 min;⑤72℃ 2 min;⑥04℃ hold。②到④為循環(huán)反應(yīng),循環(huán)數(shù)為35

    Osx-Cre程序:①94℃ 2 min;②94℃ 30sec;③60℃ 30sec;④72℃ 30sec;⑤72℃ 2 min;⑥04℃ hold。②到④為循環(huán)反應(yīng),循環(huán)數(shù)為35

    Prx-1-Cre程序:①94℃ 3 min;②94℃ 30sec;③60℃ 1 min;④72℃ 1 min;⑤72℃ 2 min;⑥04℃ hold。②到④為循環(huán)反應(yīng),循環(huán)數(shù)為35

    瓊脂糖凝膠電泳鑒定基因:吸取7-8 μl樣品加入瓊脂糖凝膠上樣孔中,常溫下恒壓160V 電泳約15-20 min,紫外投射儀下觀察并拍照。

    1.2.3免疫組化 在出生后8周處死小鼠后取脛腓骨標(biāo)本,固定并用石蠟包埋后,制作成石蠟切片,收集的新鮮組織標(biāo)本石蠟切片,進(jìn)行一抗p-S6過(guò)夜孵育,二抗37度孵育1 h,DAB顯色觀察。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    2 結(jié)果

    2.1 轉(zhuǎn)基因小鼠大體外觀及體長(zhǎng)分析

    各轉(zhuǎn)基因小鼠繁殖比較順利,均獲得相應(yīng)的帶Cre的TSC1純合小鼠。Prx-1-TSC1 CKO組與Con組相比,Prx-1-TSC1 CKO組小鼠瘦小。Col2a1-TSC1 CKO組與Con組相比,Col2a1-TSC1 CKO組小鼠弓形駝背。Osx-TSC1 CKO組與Con組相比,Osx-TSC1 CKO組呈方顱畸形(圖1)。

    A為轉(zhuǎn)基因小鼠繁殖策略;B為8周齡大小鼠的大體外觀。(放大倍數(shù)為10X和40X)

    2.2 轉(zhuǎn)基因小鼠的鑒定分析

    RT-PCR實(shí)驗(yàn)基因鑒定結(jié)果:圖2為出生后3周各小鼠的基因鑒定結(jié)果。1號(hào)為帶Prx-1-Cre的TSC1flox/ flox純合子;2號(hào)為不帶Prx-1-Cre的TSC1flox/flox純合子;3號(hào)為不帶Prx-1-Cre的TSC1flox/-雜合子;4號(hào)為帶Prx-1-Cre的TSC1flox/-雜合子;5號(hào)、6號(hào)為不帶Col2a1-Cre的TSC1flox/flox純合子;7號(hào)為帶Col2a1-Cre的TSC1flox/-雜合子;8號(hào)為帶Col2a1-Cre的TSC1flox/flox純合子;9號(hào)、11號(hào)為帶Osx-Cre的TSC1flox/-雜合子;10號(hào)為帶Osx-Cre的野生型小鼠;12號(hào)為帶Osx-Cre的TSC1flox/flox純合子。

    圖2 小鼠基因DNA及Cre重組酶的PCR鑒定結(jié)果

    RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:TSC1-loxP的PCR產(chǎn)物為230 bp和193 bp,TSC1純合子只有230 bp條帶,野生型小鼠則只有193 bp條帶,而雜合子則有230 bp和193 bp 條帶。Prx-1-Cre的PCR產(chǎn)物為550 bp條帶,Col2a1-Cre的PCR產(chǎn)物為358 bp條帶,Osx-Cre的PCR產(chǎn)物為430 bp條帶(圖2)。

    2.3 轉(zhuǎn)基因小鼠軟骨與骨組織的免疫組化分析

    取8周齡大的小鼠膝關(guān)節(jié)進(jìn)行免疫組化p-S6染色。Prx-1-TSC1 CKO組與Con組相比,其p-S6的主要表達(dá)位置集中在關(guān)節(jié)軟骨面的軟骨細(xì)胞和軟骨下骨骨小梁的成骨細(xì)胞,而且明顯升高。Col2a1-TSC1 CKO組與Con組相比,其p-S6的主要表達(dá)位置集中在關(guān)節(jié)軟骨面的軟骨細(xì)胞,而且明顯升高。Osx-TSC1 CKO組與Con組相比,其p-S6的主要表達(dá)位置集中在髓腔骨小梁的成骨細(xì)胞,而且明顯升高(*,P<0.05;**,P<0.01)(圖3)。

    3 討論

    正常情況下,骨骼發(fā)育過(guò)程是需要多種細(xì)胞參與,如間充質(zhì)干細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞等。其中間充質(zhì)干細(xì)胞早期可分化成肢芽干細(xì)胞,在骨骼形成中有著密切關(guān)系,是修復(fù)骨缺損的重要細(xì)胞來(lái)源。軟骨內(nèi)成骨的過(guò)程中,間充質(zhì)細(xì)胞或者肢芽干細(xì)胞形成致密體,致密體內(nèi)細(xì)胞分化為軟骨細(xì)胞,然后軟骨細(xì)胞開始停止增殖,表達(dá)肥大軟骨細(xì)胞特異性表達(dá)的X型膠原,后分化為成骨細(xì)胞,使之分泌骨基質(zhì),最終形成骨領(lǐng)[4]。在此過(guò)程中,如肢芽干細(xì)胞發(fā)育異常,則直接影響骨骼發(fā)育,導(dǎo)致身體機(jī)能嚴(yán)重受限。如軟骨細(xì)胞發(fā)育異常,則發(fā)生軟骨發(fā)育不全,導(dǎo)致侏儒癥或者骨關(guān)節(jié)炎[5]。如成骨細(xì)胞發(fā)育異常,則發(fā)生骨質(zhì)疏松癥或者脆骨病等[6]。mTOR是一個(gè)調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)與代謝的信號(hào)通路,參與調(diào)節(jié)蛋白合成、細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、增殖及凋亡[7,8]。其對(duì)骨骼發(fā)育的重要作用[9]已逐漸成為研究的熱點(diǎn)。但是,大多數(shù)的研究結(jié)果均得不到一致的結(jié)果,甚至互相矛盾,對(duì)其發(fā)育機(jī)制仍有爭(zhēng)議。有些觀點(diǎn)認(rèn)為,mTOR信號(hào)通路是促進(jìn)成骨分化[10];而黃彬[11]等認(rèn)為,mTOR信號(hào)通路是促進(jìn)成骨增殖,抑制成骨分化。在我們的研究中,不管在軟骨細(xì)胞,還是成骨細(xì)胞,Con組小鼠的mTOR活性均比Prx-1-TSC1 CKO組、Col2a1-TSC1 CKO組、Col2a1-TSC1 CKO組小鼠明顯降低,說(shuō)明在正常情況骨發(fā)育過(guò)程下,mTOR活性保持低表達(dá);而mTOR活性高表達(dá),則引起相應(yīng)的骨骼疾病,如侏儒癥、方顱畸形等。因此,從肢芽干細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞上探討mTOR信號(hào)將成為結(jié)果骨骼發(fā)育異常的新策略。

    Cre/loxP系統(tǒng)是目前應(yīng)用較多的基因敲除模型,在國(guó)內(nèi)外已經(jīng)得到廣泛推廣。該系統(tǒng)主要由Cre重組酶和loxP位點(diǎn)組成,Cre重組酶具有一定的催化活性,并且與限制酶有一定相似之處,能識(shí)別特定的DNA序列,如loxP位點(diǎn),引起內(nèi)外源基因敲除、失活、激活、插入、倒轉(zhuǎn)、易位等[12,13]。在肢芽干細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞上敲除TSC1基因,將有望構(gòu)建肢芽干細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞mTOR活性激活的轉(zhuǎn)基因小鼠,對(duì)研究骨骼發(fā)育異常提供良好的動(dòng)物模型。按照轉(zhuǎn)基因繁殖方法[14],我們得到了相應(yīng)的Prx-1-TSC1 CKO組、Col2a1-TSC1 CKO組和Col2a1-TSC1 CKO組小鼠各8只,其敲除效果明顯: Prx-1-TSC1 CKO組集中在關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下骨骨小梁;Col2a1-TSC1 CKO組,集中在關(guān)節(jié)軟骨,引起脊柱弓形駝背;Osx-TSC1 CKO組,集中在髓腔骨小梁,引起方顱畸形。

    圖3 轉(zhuǎn)基因小鼠的p-S6分布結(jié)果

    A為Prx-1-TSC1 CKO組與Con組小鼠的關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下骨p-S6的表達(dá),B、C分別為其關(guān)節(jié)軟骨、骨小梁p-S6表達(dá)統(tǒng)計(jì)分析;D為Col2al-TSC1 CKO組與Con組小鼠的關(guān)節(jié)軟骨p-S6的表達(dá),E為其關(guān)節(jié)軟骨p-S6表達(dá)統(tǒng)計(jì)分析。F為Osx-TSC1 CKO組與Con組小鼠的髓腔骨小梁p-S6的表達(dá),G為其骨小梁p-S6表達(dá)統(tǒng)計(jì)分析。(放大倍數(shù)為200X和400X)

    綜上所述,本實(shí)驗(yàn)中成功構(gòu)建了肢芽干細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞特異性敲除TSC1轉(zhuǎn)基因小鼠,首次從骨骼發(fā)育各階段中繁殖出相應(yīng)的mTOR活性激活小鼠,為進(jìn)一步探討骨骼發(fā)育缺陷提供新的研究靶點(diǎn)和新認(rèn)識(shí),為臨床骨科相關(guān)疾病提供新的理論基礎(chǔ)。

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